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Managua, Nicaragua
Septiembre, 2006
CONTENIDO
RESUMEN/ ABSTRAC
1
INTRODUCCIN
OBJETIVOS
MARCO TERICO
MARCO METODOLOGICO
RESULTADOS
DISCUSIN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFA
10 ANEXOS
ndice de tablas
TABLA 1 .COMPOSICIN QUMICA DEL CAF VERDE
TABLA 2 - COMPARACIONES ENTRE DISTINTOS TIPOS DE DETECTORES
TABLA 3 - MONTAJE EXPERIMENTAL
TABLA 4 - VARIABLES E INDICADORES
TABLA 5 - IDENTIDAD DE LOTE PROCESADO, FECHA DE RECOLECCIN DE MUESTRA Y FECHA DE
CONCLUSIN DEL EXPERIMENTO
TABLA 45- MATRIZ DE CONCENTRACIONES DETERMINADAS PARA LOS CIDOS MLICO Y LCTICO MEDIANTE
REFLECTOQUANT
ndice de figuras
FIGURA 1 - SECCIN LONGITUDINAL DEL CAF CEREZO
FIGURA 2 - CONSTITUCIN DEL TEJIDO DE PERICARPIO DE COFFEA ARABICA VAR. TYPICA CRAMER.
EXAMINACIN POR MICROSCOPA LUEGO DE FERMENTACIN (20 H)
FIGURA 3 - DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESAMIENTO DE CAF POR LA VA HMEDA
FIGURA 4 ESTRUCTURA DEL MUCLAGO Y DEL PERGAMINO ANTES DE LA FERMENTACIN
FIGURA 5 - COMPORTAMIENTO DEL PH EN FUNCIN DEL TIEMPO DE FERMENTACIN
FIGURA 6 - CROMATOGRAFA DE ELUSIN
FIGURA 7 - COMPONENTES DEL SISTEMA DE HPLC
FIGURA 8 - DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO EXPERIMENTAL, FINCA LA CANAVALIA
FIGURA 9 - SEPARACIN DE GRANOS DE CAF DE ACUERDO A SU ESTADO DE MADUREZ
FIGURA 10 - RECIPIENTES DE FERMENTACIN DEL CAF
FIGURA 11 HOJAS DE DATOS UTILIZADAS PARA EL CONTROL EXPERIMENTAL DE LOTES DE CAF EN LA FASE
EXPERIMENTAL
FIGURA 29 - GRFICA Y TABLA CON EL COEFICIENTE DE CORRELACIN PARA CIDO MLICO, TCNICA DEL
REFLECTOQUANT Y HPLC
FIGURA 31 - GRFICA Y TABLA CON EL COEFICIENTE DE CORRELACIN PARA CIDO LCTICO. FASE
EXPERIMENTAL Y FASE DE LABORATORIO
FIGURA 32 - GRFICA Y TABLA DE CORRELACIN (PEARSON) PARA LOS DATOS DE PH MEDIDOS EN LA FASE
EXPERIMENTAL CON EL SISTEMA REFLECTOQUANT Y CON CINTAS INDICADORAS
FIGURA 33- GRFICA Y TABLA DE CORRELACIN (PEARSON) ENTRE LAS MEDICIONES DE PH, FASE
EXPERIMENTAL Y FASE DE LABORATORIO
Dedicatoria
Agradecimientos
Resumen/ Abstract
procesamiento
hmedo,
fermentacin,
The fermentation of Coffea arabica during the wet processing method is originated
by the consumption of sugars within the mucilage by micro flora. As a result, the
concentration of carboxilic acids increases and thus the pH falls. At some
concentrations these carboxilic acids are related to the apparition of "off-flavors" or
"flavor notes". With the aim of know which would be the relationship among the
stage of fermentation and the concentration of these acids, coffee samples
(Coffea arabica, var. caturra) of La Canavalia farm (San Ramn, Matagalpa) were
processed during the harvest season 2005-2006 and their fermentation interrupted
at different pH. Then the concentration of representative carboxilic acids was
analyzed by HPLC. Although the statistical tests didn't show clearly differences
among treatments, a pattern in the increasing and decreasing concentration of
some acids was obtained. Differences among experimental batches might be a
cause for such a lack of clearly defined differences among groups.
Key words: Coffea arabica, wet processing, fermentation, mucilage, HPLC,
carboxilic acids
1 INTRODUCCIN
La reciente crisis originada por el colapso del mercado mundial del caf ha
causado severas condiciones econmicas para los productores de caf en pases
productores, incluyendo Nicaragua. Como resultado, muchos productores de caf
desean mejorar la calidad y consistencia de su caf con el propsito de tener
acceso a los mercados de caf especiales.
En Nicaragua los productores cultivan Coffea arabica y lo procesan por medio del
beneficiado hmedo en el cual es crucial la etapa de fermentacin. Para
determinar cul es el punto idneo para interrumpir la fermentacin mediante el
lavado del caf los productores utilizan un mtodo tradicional, ste no es preciso
para determinar cundo el caf se ha sobrefermentado. El tiempo de fermentacin
juega un papel crucial: una sobrefermentacin produce caf con sabores
desagradables, una sub-fermentacin redundara en caf pergamino con
remanentes de muclago.
El conocimiento terico de la qumica de la fermentacin es clave para la
propuesta de un mtodo alternativo para predecir cundo interrumpirla. Los
ltimos estudios plantean que el muclago es separado del caf pergamino
(parnquima) principalmente por los cambios en su pH a lo largo del tiempo de
fermentacin (Avallone et al, 2001a). Por esta razn se considera que el pH
tendra una funcionalidad muy importante para predecir cundo interrumpir la
fermentacin (Puerta-Quintero, 1999, 2001).
2 OBJETIVOS
2.1 GENERAL
Identificar los principales cidos carboxlicos del muclago de caf (Coffea arabica)
en dependencia del pH en el cual se interrumpe su fermentacin.
2.2 ESPECFICOS
3 MARCO TERICO
3.2.1 Botnica
La planta de caf pertenece al gnero Coffea de la familia Rubiacea. De acuerdo a
Belitz y Grosch (1999) y a Wood (1998) se han censado alrededor de 70 especies
de caf, sin embargo solamente tres se cultivan: Coffea arabica, la cual provee el
75% de la produccin mundial, C. canephora, alrededor del 25% y C. liberica y
otros, con menos de 1%.
A pesar que la presencia de estas especies est confinada a las regiones
tropicales (Daviron y Lerin, 1990), Coffea arabica se cultiva en altitudes
comprendidas entre 800 y 2000 m bajo temperaturas templadas, al contrario de C.
robusta la cual puede crecer a altitudes inferiores a los 800 m.
Luego del cultivo en viveros, las plantas jvenes son sembradas al inicio de la
poca lluviosa. Adems de recomendarse un suelo frtil y con pH superior a 5.5,
otros factores ambientales afectan al cafeto: la disponibilidad de agua, la
iluminacin, la ventilacin, los fuertes vientos y las sequas (Wood, 1998).
Luego de la siembra hay que esperar hasta 3-4 aos para que los frutos empiecen
a producirse, se espera un rendimiento de productividad mximo de 10-15 aos.
En edad adulta, la altura de la planta puede variar entre 3 a 12 m dependiendo de
la especie, sin embargo se trata de mantenerla entre 2-2.5 m para facilitar la
recoleccin (Snchez-Martn, 2005).
algo ms tarde se torna roja, paso previo al color carmes que adquiere en la
madurez completa (esta es la razn por la que se le conoce como cereza o uva),
algunas variedades maduran a color amarillo (Guharay et al, 2000). De acuerdo a
Avallone et al (1999) el exocarpio consiste en una capa de pequeas clulas
epidrmicas (~10 x 30 m).
De acuerdo a Belitz y Grosch (1999), el pericarpio exterior encierra un mesocarpio
(15 a 25% masa/masa de la fruta). Este mesocarpio se divide en un mesocarpio
exterior de color amarillezco (pulpa) y un mesocarpio interior (muclago) con un
contenido de pectinas 1,9 veces inferior al de la pulpa (Garca et al, 1991).
El endocarpio tambin se conoce como pergamino, es de color amarillezco o de
color grisceo-verdoso (cascarilla), en el interior de estas estructuras se encuentra
el grano de caf propiamente dicho, este consiste por lo general de dos
hemisferios elpticos, pegados por su parte plana. Cada grano est recubierto por
una fina membrana de tonalidad plateada. Otras veces, 10-15% de las cerezas
solamente tienen un grano esfrico (caracolillo).
Una presentacin ms clara sobre la estructura de este conjunto de capas
(pericaripio) as como sus anchuras promedio y la forma de las clulas que las
conforman se presenta en la Figura 2.
Las clulas que conforman la piel tienen una anchura de 10 x 30 m, la pulpa tiene un
espesor de 1 mm, el muclago 300 m. El pergamino por su parte tiene una anchura de
50-110 m, este ltimo est conformado por esclernquimas transversales (~25 m) y
esclernquimas longitudinales (~150 x 25 m). Adaptado de: Avallone et al (1999).
COMPONENTE
Extracto acuoso
Protena bruta
Grasa
Azcares reductores (Expresados como glucosa)
Azcares
reductores
(Expresados
como
29.0-36.2
8.7-12.2
8.3-17.0
0-0.5
2-9
sacarosa)
Sacarosa
Fibra bruta
Acido ctrico
Acido mlico
Acido oxlico
cidos clorognicos
Cafena
Trigonelina
Minerales
Fuente: Belitz y Grosch (1999).
6-7
10-11.7
0.5-1.15
0-0.5
< 0.2
4.5-11-1
0.9-2.6
0.24-1.2
3.0-5.4
En
por un conjunto de
caracteriza
por
tener
notas
fenlicas,
medicinales
mohosas.
Spadone y Liardon (1987) atribuyen al compuesto qumico 2, 4, 6- Trichloromethoxi-benceno (TCA) como el responsable de este defecto. En otra
investigacin Holscher et al (1995) concluyeron que posibles causas de la
generacin de este compuesto pueden ser metabolitos de algunos pesticidas,
aunque antes, Dentan (1987) estimaba que los granos que exhiben estas
caractersticas son ricos en Aspergillus fumigatus.
Finalmente Cantergiani et al (2001) relacionaron el defecto mohoso/tierroso a los
compuestos geosmin, 2-metilisoborneol, 2, 4,6-tricloroanisol y en menor medida a
tres metoxi- pirazinas (2-metoxi-3-isopropil/-3-sec-butil-/-3-isobutil-pirazina). Como
posible causa incluyeron al secado durante la poscosecha.
3.2.4.3 cidos carboxlicos
Los cidos carboxlicos pueden encontrarse de forma natural en las semillas de
caf verde tanto de arabica como de robusta y aportan entre el 1.1-3.1%, en
porcentaje (m/m).
manera: cido frmico (0.14%), actico (trazas), oxlico (trazas-0.2%), mlico (0.30.7%), succnico (trazas-0.15), ctrico (0.5-1.5) y qunico (0.3-0.6% en arbicas).
3.3.1 Cosecha
En su investigacin, Guharay et al (2000) plantean que en Nicaragua la recolecta
inicia a mediados de octubre y finaliza a mediados de marzo. El estado de
madurez de las cerezas (o uvas) de caf durante la recolecta es determinante en
la calidad final del caf. Estas estn maduras cuando el pericarpio es de color rojo
brillante, las sobremaduras son de color violeta a negro y las no maduras todava
verdes. Para producir caf de calidad Gutirrez et al (2005) recomiendan
recolectar solamente cerezas maduras.
La cosecha puede ser mecnica, se han propuesto interesantes y sofisticados
mecanismos para la recoleccin de cerezas de caf, por ejemplo: la cosecha
mediante el impacto a las ramas por medio de un equipo especial que tambin
desprende y recoge los frutos (Garca et al, 2001), o el sistema descrito por
La recepcin y la clasificacin:
El despulpado
Carpio Zavala (1998) reporta que cuando la despulpadora mecnica est mal
calibrada o cuando hay mezclas de variedades de cerezas, se dan heridas o
cortes en el grano verde que lo desvalorizan. Tambin las diversidades en las
texturas y dimetros de las cerezas dificultan al trabajador elegir la calibracin ms
adecuada para el equipo. Una solucin a esto es ajustar la despulpadora de
acuerdo al tamao del grano, con granos ms grandes al inicio de la cosecha y
ms pequeos al final (Gutirrez et al, 2005).
A pesar que Puerta-Quintero (2001) recomienda no utilizar agua ni para el
despulpado ni para transportar las pulpas o los granos despulpados, SnchezMartn (2005) enfatiza que normalmente se utiliza en la prctica. Por otro lado es
de suma importancia limpiar diariamente la despulpadora, para evitar que se forme
suciedad y para retirar los granos que puedan estar atrapados, tambin se
recomienda revisar diariamente el funcionamiento del despulpador: en el caso que
se observe grano mordido, quebrado o machacado, se debe ajustar y corregir
cualquier
problema
(Berros
et
al,
2005;
Gutirrez
et
al,
2005;
La fermentacin
El lavado y la clasificacin
El lavado se efecta con el fin de eliminar del grano de caf los productos de la
fermentacin que ocasionan sabor agrio a la bebida de caf, si no se retiran
rpidamente (Carpio Zapata, 1998; Puerta-Quintero, 1999), dentro de estos
productos se incluyen los restos del muclago degradado (Belitz y Grosch, 1999).
Zambrano e Isaza (1994) reportan un consumo de agua de entre 20 y 30 L por
cada kg de caf pergamino lavado.
Despus del lavado la apariencia del grano pergamino debe ser limpia y de olor
agradable. El caf que resulta del lavado se conoce como pergamino, al tacto este
debe ser limpio y al frotarlo entre los dedos y chocarlos entre s deben sonar.
El secado
La trilla y la clasificacin
Luego del secado los granos se llevan a unas mquinas de trilla para eliminar el
pergamino y finalmente se da brillo al grano y se eliminan los restos de cascarilla,
obtenindose el caf verde.
Snchez-Martn (2005) comenta que los granos de caf verde varan de tamao y
forma, la razn de esto la da Illy (2005), al indicar que se busca uniformidad en el
producto, para asegurar la homogeneidad del tostado y de molido. La clasificacin
se realiza con tamices perforados que funcionan mecnicamente y que separan
los granos segn el tamao. Tambin se utilizan chorros de aire para eliminar los
fragmentos de granos y las sustancias extraas.
La seleccin de los granos de color defectuoso se realiza a mano en la mayora de
los casos, aunque se ha dado un gran desarrollo en los instrumentos de deteccin
fotoelctrica para detectar y eliminar granos sobrefermentados (Gibson y Butty,
1976).
El almacenamiento
(bacterias
levaduras)
con
parmetros
bioqumicos
con
capacidades
importantes
para
la
produccin
de
etanol.
pH
5.5
5.0
4.5
4.0
0
10
15
20
las
presencias
de
compuestos
precursores
de
sabores
Eluyentes
Sistema de impulsin
Columna
Detector
ndice de refraccin
Fluorescencia
Conductimtrico
Electroqumico
Espectrmetro de masas
Estabilidad
Alta
Baja
Alta
Baja
Baja
Media
Selectividad
Media
No
Si
Si
Si
No
Gradiente
Si
No
Si
No
Si
Si
Sensibilidad
Variable (alta)
500 ng
Variable (0.1 ng)
5 ng
0.01 ng
50 ng
4 MARCO METODOLOGICO
4.1.3 Muestra
La investigacin se realiz con 10 muestras de caf despulpado. Cada una de
estas muestras provino de un lote diferente de caf procesado en la finca La
RG1 (duplicado)
RG2 (duplicado)
RG3 (duplicado)
O1
O2
O3
Tabla 4
Variable
pH
de
interrupcin de
fermentacin
(Independiente)
Concentracin
. Actico
de
cido . Frmico
orgnico.
A.
Propinico
(Dependiente)
A. Lctico
A. Ctrico
A. Mlico
Valor de pH
Escala
medida
pH
de Tipo
de Tipo
de
variable
escala
de
medida
Cuantitativa
Escala de
Continua
proporcin o
razn
Cuantitativa
continua
Escala de
proporcin o
razn
A.
Galacturnico
San Ramn, Matagalpa (Figura 34, Anexos, Seccin 10) . La altitud de la finca es
de 747 m.s.n.m. Posee una temperatura que oscila entre los 20 a 26 C. y una
pluviosidad que varan entre los 2000 a 2400 mm (INIFOM, 2001).
En Nicaragua predomina el cultivo de la especie Coffea arabica, por tanto esa fue
la especie que se tom para realizar los experimentos y especficamente la
variedad caturra, la cual predomina en las plantaciones de La Canavalia.
Se hizo coincidir la realizacin de los experimentos con la poca de cosecha de
caf. De esta forma, la proveniencia de los lotes de caf estaba en dependencia
del plan de corte de la finca.
La Tabla 5 presenta las fechas en que se recolectaron las muestras as como el
da en que se concluy el experimento. Es de notar que los experimentos
concluyeron normalmente un da despus de recolectadas las muestras, ms
adelante se discute el porqu.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
ID
experimento
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
Fecha de
recoleccin
de muestras
29-dic-06
30-dic-05
31-dic-05
02-ene-06
03-ene-06
04-ene-06
06-ene-06
07-ene-06
08-ene-06
09-ene-06
Fecha de
conclusin del
experimento
30-dic-06
31-dic-05
01-ene-06
03-ene-06
04-ene-06
05-ene-06
07-ene-06
08-ene-06
09-ene-06
10-ene-06
Antes del despulpado, el caf se separ por categoras: los granos rojos, los
granos verdes y los granos oscuros (Figura 9). Posteriormente, los granos se
vertieron en un tanque lleno de agua, all se identificaron y eliminaron aquellos que
flotaban (clasificado).
Figura 9 - Separacin de granos de caf de acuerdo a su estado de madurez
Las muestras de caf que
se utilizaron para los
experimentos siguieron el
mismo tratamiento que el
caf recolectado en la
finca. Se procur realizar
una seleccin de granos
rojos y se descartaron
granos
verdes
y
sobrefermentados
(de
color ms oscuro)
Cortesa de S. Jackels.
4.2.2 Despulpado
El despulpado de las muestras de caf se realiz con una despulpadora de
tambor, este tipo de despulpadora consiste en un cilindro giratorio con las paredes
interiores rugosas y con una cubierta estacionaria o coraza que cubre un tercio de
su superficie. El espacio entre el tambor y la coraza es ajustable y disminuye en el
sentido de giro del tambor. Los frutos se alimentaron mediante un sistema de
tuberas directamente desde los tanques de clasificacin al despulpador,
resultando estrujados al entrar en el hueco, rompindose el fruto y expulsando
suavemente los granos recubiertos con la piel apergaminada. La capacidad media
de este despulpador fue de 1200 a 1500 Kg/h de frutos.
La finca adquiri este despulpador gracias al apoyo de CRS en fechas recientes,
por lo tanto al ser relativamente nuevo y estar bien ajustado, se obtuvieron granos
con calidad aceptable de despulpado (pocos granos presentaba pulpa adherida).
4.2.3 Fermentacin
Luego de despulpados, los granos de caf se depositaron en un tanque de
fermentacin. Se procedi a seleccionar 60 kg de forma aleatoria, procurando
obtener una cantidad representativa de todo el lote. Los 60 kg se distribuyeron a
razn de 10 kg en cada uno de los seis recipientes exclusivamente diseados para
los experimentos (Figura 10).
Cortesa de S. Jackels.
Figura 11 Hojas de datos utilizadas para el control experimental de lotes de caf en la fase
experimental.
(a) En la primera hoja se indican los datos generales, el inicio de la fermentacin, datos
intermedios y se registra si se tomaron muestra para el primer lavado (pH 4.6).
(b) En la segunda hoja se incluyen los datos relevantes sobre las muestras a las que se
ha de hacer la segunda interrupcin de la fermentacin (pH4.1) y en la tercera
interrupcin (pH3.9).
4.2.5.1 Toma
de
muestra
refrigeracin
para
posterior
anlisis
cromatogrfico
Cuando la muestra alcanz el pH requerido, y antes de proceder al lavado del caf
contenido en determinado balde, se procedi a tomar alrededor de 500 g de forma
representativa del caf contenido en dicho balde.
Estas muestras de caf se empacaron en bolsas plsticas con cierre hermtico y
se guardaron apropiadamente en el congelador de la finca (que tena temperatura
cercana a los 0C).
Para transportar las muestras hasta Managua y posteriormente hasta el
laboratorio en Seattle, se utilizaron hieleras porttiles con congelantes qumicos,
para mayor seguridad se mantuvo la temperatura cercana a 0C dentro de estas
hieleras.
Las muestras permanecieron en un congelador a una temperatura constante y
cercana a 0C hasta que se realizaron los anlisis cromatogrficos.
De acuerdo a Masoud et al (2004) la temperatura cercana al punto de
congelamiento es un mtodo para interrumpir la fermentacin, ya que se logra
disminuir el crecimiento de la microflora a niveles en los cuales la produccin de
subproductos metablicos no es considerable.
cromatogrficas
un
factor
de
dilucin
especfico
Etapa
Pesado
Material
Balanza analtica
Adicin de agua
Esptula
Beaker de 150 mL
Agua HPLC
1
1 por muestra
50 mL
Probeta de 50 mL
Agitador magntico
con imanes
Cronmetro
Pipeta Pasteur
Viales de
centrifugado
Micro centrfuga
Microfiltro de 0.45
m
1
1 por muestra
Agitacin
Centrifugado
Filtrado
Encapsulado para
HPLC
Medicin rpida de
parmetros
qumicos
Microfiltro de 0.2 m
Vial con tapa de
rosca para preservar
el filtrado.
Viales para HPLC
micro pipeta, rango
100 a 1000 L
Puntas para micro
pipeta
Procesador
Reflectoquant
Cintas reflectoquant
Cantidad
1 por muestra
4 por muestra
1
1 por muestra
1 por muestra
1 por muestra
Fabricante
ScienTech,
Loveland, CO, USA
Acros, New Jersey,
NJ, USA
Hach, Loveland, CO,
USA
Fischer Scientific
Whatman Schleider
& Schuell, New
Jersey
Fischer Scientific
1 por muestra
Agilent
Gilson pipetman
1 para muestra,1
para patrn interno
2
EMD Chemicals
1 set de 50 cintas
(cido lctico,
mlico, pH)
EMD Chemicals
El
Fase mvil
Fase
estacionaria
Inyector
Detector
Recoleccin
datos
Compuesto
cido
Frmico
Grado de
pureza
95 97%
Propinico
ND
Galacturnico 98%
Mlico
ND
Lctico
ND
Actico
100%
Ctrico
99.9%
Fabricante
Sigma
Chemical,
USA
ND
Fluka, Suiza
Sigma,
China
J.T. Baker
Chemical,
USA
Fisher
Scientific,
USA
J.T. Baker
Chemical,
USA
Frmula
HCOOH
Peso
Molecular
(g/mol)
46.0
Fase
Lquido
CH3CH2COOH 74.0
C6H9NaO7
216.12
Lquido
Slido
C4H6O5
134.09
Slido
C3H6O3
90.1
Lquido
CH3COOH
60.0
Lquido
H3C6H5O7
192.13
Slido
ND: No indicado en el envase pero mayor a 95% de acuerdo a los registros del inventario
en el laboratorio.
2.
Cdigo
Grupo
experimental /pH
en que se
interrumpi la
fermentacin
3.7
5307 D
3.9
6832 K
4.8
6346 E
6.3
8410 B
Caractersticas de la solucin
(*) Se realiz este ensayo con cido frmico para determinar la posicin de este pico con
respecto a la de un pico aledao.
El compuesto que cumpli todos estos requisitos y por lo tanto se utiliz como
patrn interno es el cido pirazincarboxlico, cuya frmula es C5H4O2N2, su
estructura molecular se presenta en la Figura 14.
Esta tcnica tambin requiri disponibilidad de estndares puros de los
compuestos de inters (ya se presentaron en la Tabla 8). Con los estndares se
prepararon diferentes mezclas que contenan los compuestos de inters a
Puesto que la cantidad de patrn interno que se adiciona a las muestras y a los
estndares es la misma (Cmpi) el eje de las X se puede representar simplemente como
la concentracin en cido (Cmi). Adaptado de Johnson y Stevenson (1978).
Sy/x =
(y
e
i
yic ) 2
Ecuacin 1
N 2
Sm =
Sb =
Sy/x
N
i
Ecuacin 2
xi x
S y / x i xi2
N i xi x
N
Ecuacin 3
Sy/x
m
( y y )2
1 1
+ + 2 0N
L N m xi x 2
i
Ecuacin 4
Ecuacin 5
En donde :
n = nmero de rplicas de estndares analizados mediante el instrumento
por lo general n es 7
s = desviacin estndar de n
t = valor de t de Student con n - 1 grados de libertad
= nivel de significancia
Ecuacin 6
Cdigo
pH (papel)
Archivo del
cromatograma
5082
8189
8410
3470
2585
6053
2837
6053
1510
5307
1293
5122
6346
3727
9370
7118
9296
6181
8071
5000
9801
6615
2935
5169
2935
Beneficio
8507
6319
6319
5583
6832
6174
6174
7060
3539
8548
4.5
3.9
6.3
4.3
4.2
4.7
4.2
6.3
4
3.7
4.2
3.9
4.8
4.2
3.8
4.4
4.7
3.9
6.1
4
4.2
4.4
6.1
4.5
4.6
coffee_nic140
coffee_nic79
coffee_nic88
coffee_nic85
coffee_nic82
coffee_nic149
coffee_nic146
coffee_nic152
coffee_nic143
coffee_nic112
coffee_nic118
coffee_nic115
coffee_nic134
coffee_nic131
coffee_nic128
coffee_nic137
coffee_nic159
coffee_nic156
coffee_nic168
coffee_nic171
coffee_nic174
coffee_nic180
coffee_nic183
coffee_nic186
coffee_nic189
coffee_nic192
coffee_nic198
coffee_nic195
coffee_nic201
coffee_nic227
coffee_nic230
coffee_nic233
coffee_nic236
coffee_nic239
coffee_nic242
coffee_nic245
4
3.8
6.1
4.3
3.9
4.7
6.1
4.2
3.9
3.8
Grupos y
duplicados
Subvariables
. Actico
10 filas,
muestra
A. Propinico
10 filas
A. Lctico
10 filas
A. Ctrico
10 filas
A. Mlico
10 filas
A. Galacturnico
10 filas
por
5 RESULTADOS
Tiempo de elusin
promedio (min)
2.0
2.5
3.0
3.7
4.2
5.3
11.1
Orden de
elusin
1
2
3
4
5
6
7
Picos en el cromatograma
cido orgnico al que correspondera
A
Galacturnico
B
Frmico
D
Mlico
E
ND*
G
Actico
I
Ctrico
L
Propinico
M
Patrn interno (Pirazinecarboxlico)
* Al inicio este pico se crea que perteneca al cido lctico.
. Galacturnico
. Frmico
. Mlico
. Lctico
. Actico
. Ctrico
. Propinico
Patrn Interno
Tiempo de retencin
(min)
Inicio
Fin
1.95
2.464
3.154
3.643
4.287
5.867
10.214
14.121
2.45
2.954
3.511
4.18
4.747
6.534
11.664
15.344
Volumen
total (L)
Volumen
de cidos
en la
mezcla
(L)
Volumen
de patrn
interno
0.05
mg/mL
(L)
1600
1400
200
(mg/mL)
0.4
1.2
2.4
4
6
8
Blanco
Cabe destacar que se realizaron tres repeticiones para cada medicin. Los datos
incluidos la Tabla 16 se utilizaron como factor de dilucin para calcular
la
cido orgnico
Galacturnico
Frmico
Mlico
Lctico
Actico
Ctrico
Propinico
Figura
Figura 17
Figura 18
Figura 19
Figura 20
Figura 21
Figura 22
Figura 23
8
7
Ai/Api
6
5
4
3
2
1
0
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
-1
Concentration (mg/mL)
Datos Estadsticos
Ai/Api
0.00
0.35
1.05
2.10
3.50
5.25
7.00
0.00
0.41
1.14
2.23
3.89
6.08
8.57
Sy/x
xbar
ybar
Sslope
Sintercept
Slope
Intercept
n
0.19
2.75
3.19
0.03
0.11
1.21
-0.13
7.00
Ai/Api
15
10
0
0
-5
Concentration (mg/mL)
Ai/Api
0
0.35
1.05
2.1
3.5
5.25
7
0.00
1.02
3.07
6.16
10.23
15.83
22.43
Datos estadsticos
Sy/x
xbar
ybar
Sslope
Sintercept
Slope
Intercept
n
0.46
2.75
8.39
0.07
0.26
3.15
-0.28
7.00
y = 2.9278x - 0.2847
R2 = 0.9974
20
Ai/Api
15
10
0
0
-5
Concentration (mg/ml)
Datos estadsticos
Ai/Api
0.00
0.93
2.81
5.67
9.46
14.67
20.81
Sy/x
xbar
ybar
Sslope
Sintercept
Slope
Intercept
n
0.43
2.75
7.77
0.07
0.25
2.93
-0.28
7.00
12
y = 1.6744x - 0.225
R2 = 0.995
10
Ai/Api
0
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
-2
Concentration (mg/mL)
Datos de la curva de
calibracin, cido lctico
Ci
(mg/ml)
0.00
0.35
1.05
2.10
3.50
5.25
7.00
Datos estadsticos
Ai/Api
0.00
0.51
1.55
3.14
5.27
8.22
11.98
Sy/x
xbar
ybar
Sslope
Sintercept
Slope
Intercept
n
0.34
2.75
4.38
0.05
0.19
1.67
-0.22
7.00
7.00
8.00
y = 1.7445x - 0.1809
R2 = 0.9971
12
10
Ai/Api
0
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
-2
Concentration (mg/mL)
Datos de la curva de
calibracin, cido actico
Ci (mg/ml)
Ai/Api
0.00
0.00
0.35
0.55
1.05
1.67
2.10
3.36
3.50
5.60
5.25
8.73
7.00
12.41
Datos estadsticos
Sy/x
xbar
ybar
Sslope
Sintercept
Slope
Intercept
n
0.27
2.75
4.62
0.04
0.16
1.74
-0.18
7.00
8.00
30
y = 4.2093x - 0.6756
R2 = 0.992
25
Ai/Api
20
15
10
0
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
-5
Concentration (mg/mL)
Datos de la curva de
calibracin, cido ctrico
Ci
(mg/ml)
0.00
0.35
1.05
2.10
3.50
5.25
7.00
Datos estadsticos
Sy/x
Ai/Api
0.00
1.26
3.83
7.73
12.86
20.29
30.33
xbar
ybar
Sslope
Sintercept
Slope
Intercept
n
1.09
2.75
10.90
0.17
0.62
4.21
-0.68
7.00
7.00
8.00
12
10
Ai/Api
0
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
-2
Concentration (mg/mL)
Datos de la curva de
calibracin, cido propinico
Ci (mg/ml)
0.00
0.35
1.05
2.10
3.50
5.25
7.00
Ai/Api
0.00
0.63
1.96
3.28
5.63
8.97
13.09
Datos estadsticos
Sy/x
xbar
ybar
Sslope
Sintercept
Slope
Intercept
n
0.45
2.75
4.79
0.07
0.26
1.81
-0.20
7.00
8.00
s
(Ai/Api)
0.0130
0.0288
0.0232
0.0121
0.0129
0.0276
0.0575
12
3.05
MDL
0.0398
0.0879
0.0707
0.0368
0.0393
0.0840
0.1755
X0
(mg/mL)
0.1441
0.1167
0.1214
0.1563
0.1262
0.1805
0.2046
Hay que sealar que el valor de X0 se obtuvo mediante los datos de la curva de
calibracin para cada cido en particular, razn por la cual se expresa como
mg/mL.
Los
tambin
permiten
apreciar
la
conformacin
de
los
grupos
Exp.
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
Benef.
Inicial
6.3
7.35
0.16
16.32
0.35
6.15
0.14
8.61
0.18
Galacturnico
4.8
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
9.72
13.58
0.29
7.38
0.16
10.26
0.14
0.19
0.26
0.27
0.30
0.17
4.5
13.00
0.27
12.70
0.27
20.14
0.44
10.93
0.23
4.2
11.27
11.68
11.59
9.67
0.24
0.24
0.24
0.20
8.03
0.17
7.80
0.16
0.21
10.38 0.22
7.90
0.17
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
3.9
3.8
8.75
0.18
4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
6.37
8.98
12.30
12.67
14.24
8.29
Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
4.7
4.6
0.20
4.4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
6.1
14.92
3.7
0.32
12.91
7.87
0.17
10.50
0.22
0.27
8.22
0.17
12.22
0.26
11.54
5.67
0.13
10.34
0.22
8.29
0.17
0.24
Exp.
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
Benef.
Inicial
6.3
0.36
0.11
0.50
0.11
0.36
0.11
Frmico
0.39
0.41
0.11
0.48
0.11
0.62
0.61
0.11
0.31
0.11
0.11
4.5
0.43
0.11
0.43
0.11
4.2
0.37
0.53
0.51
0.34
0.11
0.11
0.11
0.11
0.35
0.11
0.33
0.11
3.7
0.11
0.51
0.33
0.36
0.79
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
3.9
3.8
0.37
0.11
4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
0.11
0.11
0.11
4.4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
0.32
0.46
4.8
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
6.1
0.11
0.49
0.29
0.11
0.41
0.11
0.11
0.11
0.11
Exp.
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
Benef.
Inicial
6.3
0.32
0.12
0.35
0.12
0.21
0.12
0.19
0.12
Mlico
4.8
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
0.20
0.35
0.12
0.21
0.12
0.19
0.12
0.12
0.12
0.12
0.12
0.12
4.5
0.23
0.12
0.22
0.12
0.27
0.12
0.20
0.12
4.2
0.23
0.31
0.22
0.20
0.12
0.12
0.12
0.12
0.19
0.12
0.17
0.12
0.12
0.19 0.12
0.17
0.12
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
3.9
3.8
0.21
0.12
4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
0.26
0.32
0.26
0.28
0.28
0.17
Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
4.7
4.6
0.12
4.4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
6.1
0.32
3.7
0.12
0.20
0.18
0.12
0.19
0.12
0.12
0.18
0.12
0.21
0.12
0.20
0.17
0.12
0.20
0.12
0.27
0.12
0.12
Exp.
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
Benef.
Inicial
6.3
0.31
0.12
0.35
0.12
0.36
0.12
0.23
0.12
Actico
4.8
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
0.23
0.40
0.12
0.34
0.12
0.29
0.12
0.12
0.12
0.12
0.12
0.12
4.5
0.38
0.12
0.23
0.12
0.29
0.12
0.25
0.12
4.2
0.36
0.36
0.48
0.30
0.12
0.12
0.12
0.12
0.28
0.12
0.33
0.12
0.12
0.37 0.12
0.20
0.12
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
3.9
3.8
0.32
0.12
4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
0.28
0.31
0.26
0.28
0.28
0.23
Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
4.7
4.6
0.12
4.4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
6.1
0.47
3.7
0.12
0.41
0.28
0.12
0.27
0.12
0.12
0.25
0.12
0.29
0.12
0.40
0.24
0.12
0.35
0.12
0.26
0.12
0.12
Exp.
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
Benef.
Inicial
6.3
0.26
0.21
0.26
0.21
0.21
0.21
0.23
0.21
Ctrico
4.8
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
0.24
0.31
0.20
0.24
0.21
0.28
0.21
0.21
0.21
0.21
0.21
0.21
4.5
0.27
0.20
0.23
0.21
0.25
0.21
0.23
0.21
4.2
0.25
0.27
0.29
0.24
0.21
0.20
0.20
0.21
0.24
0.21
0.22
0.21
0.20
0.26 0.21
0.23
0.21
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
3.9
3.8
0.25
0.21
4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
0.22
0.25
0.22
0.23
0.24
0.22
Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
4.7
4.6
0.21
4.4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
6.1
0.32
3.7
0.20
0.29
0.23
0.21
0.23
0.21
0.20
0.22
0.21
0.26
0.21
0.29
0.22
0.21
0.26
0.21
0.22
0.21
0.20
Exp.
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
Benef.
Inicial
6.3
0.13
0.20
0.13
0.20
0.11
0.20
0.17
0.20
Propinico
4.8
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
0.14
0.13
0.20
0.13
0.20
0.14
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
4.5
0.14
0.20
0.15
0.20
0.13
0.20
0.13
0.20
4.2
0.12
0.14
0.13
0.14
0.20
0.20
0.20
0.20
0.14
0.20
0.12
0.20
0.20
0.16 0.20
0.16
0.20
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
3.9
3.8
0.12
0.20
4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
0.13
0.12
0.13
0.12
0.15
0.16
Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
4.7
4.6
0.20
4.4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
6.1
0.13
3.7
0.20
0.13
0.12
0.20
0.13
0.20
0.20
0.13
0.20
0.17
0.15
0.20
0.13
0.12
0.20
0.13
0.20
0.20
0.20
Tabla 25), mlico (Tabla 26), actico (Tabla 27), ctrico (Tabla 28) y propinico
(Tabla 29).
Tabla 24 - Tabla de datos para anlisis estadstico entre grupos, cido galacturnico
9.7245
13.5783
12.6971
20.1431
14.9155
7.8665
8.9796
7.3790
9.1762
10.4979
12.2969
10.2629
10.3750
8.7515
12.6683
14.2431
16.3197
10.9316
12.9968
7.8049
11.2735
11.6850
11.5932
12.9060
8.2224
12.2159
9.6696
5.6711
8.0291
10.3402
7.9028
8.2879
11.5425
8.29
Tabla 25 - Tabla de datos para anlisis estadstico entre grupos, cido frmico
G1
G2
G3
0.3152
0.3565
0.4601
0.4997
0.7893
0.3099
0.3330
0.3929
0.4269
0.4311
0.4056
0.4753
0.3371
0.3656
0.5257
0.6155
0.3570
0.3721
0.5128
0.3254
0.6130
0.5127
0.3400
0.3497
0.2876
0.4112
0.4851
Tabla 26- Tabla de datos para anlisis estadstico entre grupos, cido mlico
0.2017
0.3492
0.2123
0.1893
0.1954
0.2253
0.1675
0.2238
0.2670
0.2239
0.1879
0.2328
0.3096
0.2183
0.2049
0.1943
0.1673
0.3173
0.1804
0.1892
0.2089
0.2019
0.1827
0.2122
0.1688
0.2001
0.2736
0.1955
Tabla 27- Tabla de datos para anlisis estadstico entre grupos, cido actico
0.2297
0.3971
0.3357
0.2862
0.2516
0.3761
0.3279
0.2274
0.2929
0.3361
0.3689
0.3557
0.3554
0.4780
0.3029
0.2767
0.2015
0.4727
0.2830
0.2721
0.3212
0.4138
0.2469
0.2874
0.2390
0.3528
0.2630
0.3969
Tabla 28- Tabla de datos para anlisis estadstico entre grupos, cido ctrico
0.2362
0.3136
0.2395
0.2756
0.2334
0.2744
0.2204
0.2275
0.2469
0.2445
0.2564
0.2479
0.2703
0.2930
0.2429
0.2404
0.2330
0.3223
0.2250
0.2327
0.2509
0.2935
0.2187
0.2584
0.2238
0.2616
0.2202
0.2869
Tabla 29- Tabla de datos para anlisis estadstico entre grupos, cido propinico
0.1428
0.1265
0.1275
0.1419
0.1280
0.1445
0.1223
0.1528
0.1276
0.1195
0.1592
0.1214
0.1382
0.1274
0.1448
0.1359
0.1614
0.1330
0.1248
0.1338
0.1224
0.1262
0.1253
0.1718
0.1204
0.1266
0.1496
realizaron dos pruebas de forma paralela para los seis cidos carboxlicos: la
prueba de Kolmogorov-Smirnov y la prueba de Shapiro-Wilk.
Ambas prueban la hiptesis nula que los datos poseen una distribucin normal. Un
nivel de significancia particularmente bajo (generalmente menor a 0.05) indica que
la distribucin de los datos difiere significativamente de una distribucin normal. A
continuacin se presenta una matriz resumen de la prueba que se realiz con el
software SPSS (Tabla 30).
En este caso se analizaron los datos para la prueba Kolmogorov-Smirnov, estos
muestran que no hay distribucin normal para las concentraciones de cido
mlico en dos de los grupos: G1 (pH 6.1-6.3) y G4 (pH 3.7-4). Las
concentraciones en cido propinico tampoco se ajustan a una distribucin
normal en los grupos G1 y G4.
muestran una distribucin normal.
CONC_GAL
CONC_MAL
CON_ACE
CON_CIT
CON_PROP
CONC_FOR
*
PH_GROUP
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
Kolmogorov-Smirnov
Statistic
df
Sig.
.196
8
.200*
.152
7
.200*
.251
10
.074
.149
11
.200*
.236
8
.200*
.322
7
.027
.205
10
.200*
.315
11
.003
.201
8
.200*
.154
7
.200*
.165
10
.200*
.218
11
.149
.179
8
.200*
.265
7
.146
.250
10
.078
.186
11
.200*
.392
8
.001
.289
7
.079
.169
10
.200*
.292
11
.010
.267
5
.200*
.284
6
.141
.229
8
.200*
.172
8
.200*
Statistic
.939
.939
.793
.978
.920
.747
.933
.782
.947
.957
.960
.914
.907
.897
.888
.892
.746
.835
.928
.729
.881
.879
.848
.950
Shapiro-Wilk
df
8
7
10
11
8
7
10
11
8
7
10
11
8
7
10
11
8
7
10
11
5
6
8
8
Sig.
.606
.633
.012
.956
.429
.012
.479
.006
.678
.797
.783
.272
.336
.313
.160
.146
.007
.088
.426
.001
.314
.264
.091
.713
Con estos resultados se concluy que una prueba no paramtrica para encontrar
diferencias
entre
grupos
deba
realizarse
tanto
los
grupos
de
las
Figura 24 - Grficos cajas de puntos o boxplots para determinar puntos aberrantes dentro
de los datos de cada grupo para cada cido
30
.5
(b)
(a)
22
.4
20
17
10
CON_ACE
CONC_GAL
.3
0
N=
"6.1-6.3"
.34
4.5-4.8
10
11
4.2-4.4
3.7-4
.1
N=
.9
(c)
.6
.26
.5
.24
.22
.20
"6.1-6.3"
4.5-4.8
10
11
4.2-4.4
3.7-4
CONC_FOR
.28
10
11
4.2-4.4
3.7-4
.7
22
4.5-4.8
(d)
.8
.30
N=
"6.1-6.3"
.32
CON_CIT
.2
10
.4
.3
.2
N=
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
Tabla 31 - Prueba de Levene para muestras a las que se realizara la prueba ANOVA
Test of Homogeneity of Variances
CONC_FOR
CON_ACE
CON_CIT
Levene
Statistic
.866
1.957
2.685
df1
df2
3
3
3
23
32
32
Sig.
.473
.140
.063
df1
df2
3
31
Sig.
.072
Between Groups
Within Groups
Total
Sum of
Squares
2.414
216.585
218.999
df
3
31
34
Mean Square
.805
6.987
F
.115
Sig.
.951
ANOVA
CONC_FOR
CON_ACE
CON_CIT
Between Groups
Within Groups
Total
Between Groups
Within Groups
Total
Between Groups
Within Groups
Total
Sum of
Squares
.018
.324
.343
.006
.146
.153
.002
.024
.026
df
3
23
26
3
32
35
3
32
35
Mean Square
.006
.014
F
.432
Sig.
.732
.002
.005
.449
.719
.001
.001
.720
.547
Los cidos mlico y propinico no estaban sujetos a una distribucin normal, por
esta razn a ambos se les aplicaron pruebas no paramtricas, especficamente la
prueba Kruskal Wallis y la prueba de comparacin de medianas. Ambas pruebas
estn diseadas para probar la significancia de las diferencias entre mltiples
grupos, bsicamente cumplen el papel sustituto de la prueba ANOVA.
La prueba Kruskal-Wallis mide cuanto los rangos dentro de un grupo difieren del
rango medio del resto de los grupos, el valor chi-cuadrado se obtiene en base a
estos valores de los rangos. Los grados de libertad para la prueba estadstica chicuadrado son iguales al nmero de grupos menos uno.
La significancia asintomtica estima la probabilidad de obtener un estadstico chicuadrado mayor o igual al que se presenta, en el caso que verdaderamente no
hubiese diferencias entre los rangos de los grupos. Cuando el valor es inferior a
.05 hay diferencias entre los grupos.
En el caso de los cidos mlico y propinico la prueba Kruskal Wallis no arroja
diferencias entre los grupos (Tabla 33).
Tabla 33- Resultados de la prueba Kruskall Wallis para cido mlico y propinico
Test Statisticsa,b
Chi-Square
df
Asymp. Sig.
CONC_MAL
7.286
3
.063
CON_PROP
2.747
3
.432
La prueba de la mediana, tiene como hiptesis nula que las mediana de todo el
conjunto de datos es una buena aproximacin con el centro de cada uno de los
grupos experimentales. Para probar esta hiptesis, cada grupo se divide en dos
subgrupos: aquellos cuyos valores se ajustan cerca o bajo la mediana, y aquellos
cuyos valores son superiores a los de la mediana. El resultado es una tabla de
frecuencias de dos vas con dos filas y un nmero n de columnas donde n es el
nmero de categoras de la variable agrupadora. En la Tabla 34- a, por ejemplo, la
primera celda es el nmero de valores de concentracin de cido que para el
grupo 1 son superiores a la mediana.
La prueba de la Mediana detecta diferencias en la localizacin y forma entre los
grupos. La mediana lista la mediana general ignorando la membresa a
determinados grupos. Si los grupos no difieren, la mediana general debera
eventualmente separar cada grupo. El estadstico chi-cuadrado compara las
separaciones observadas a las separaciones tericas. Los niveles de significancia
inferiores a .05 indican que los grupos difieren estadsticamente.
En el caso del cido mlico el nivel de significancia (Asymp. Sig.) .023, por lo
tanto los grupos dentro del cido mlico diferiran entre s. Por otro lado, las
concentraciones de los grupos en cido propinico poseen un nivel de
significancia (Asymp. Sig) de .127, por lo que se concluye los grupos no se
diferencian entre s.
CONC_MAL
CON_PROP
> Median
<= Median
> Median
<= Median
"6.1-6.3"
7
1
2
6
PH_GROUP
4.5-4.8
4.2-4.4
3
6
4
4
5
7
2
3
3.7-4
2
9
4
7
CONC_MAL CON_PROP
36
36
.212250
.127450
9.497a
5.704a
3
3
.023
.127
de esos valores. Uno de los requerimientos para las pruebas de dos vas es que
se tenga el mismo nmero de valores para las columnas y para las filas, en esto
se diferencia de la configuracin precedente. Por tal razn no fue posible obtener
ms que una matriz de 4 filas (experimentos) por 4 columnas (grupos) para los 7
cidos en estudio
En esta seccin se presentan las tablas que sirvieron de alimentacin a las
pruebas estadsticas. A. galacturnico (Tabla 35 a), frmico (Tabla 35b), mlico
(Tabla 35c), actico (Tabla 35d), ctrico (Tabla 35e) y propinico (Tabla 35f).
Tabla 35- Datos para anlisis estadstico entre grupos y entre experimentos (ANOVA 2 vas)
(a)
cido Galacturnico
Exp
Inicial
(mg/mL)
B
C
F
K
7.348
16.320
6.372
14.243
Grupos
G1
G2
(mg/mL) (mg/mL)
12.997
13.578
7.379
10.263
10.225
11.685
12.697
10.375
G3
(mg/mL)
8.752
14.915
8.222
12.216
(b)
Exp
B
C
F
cido Frmico
Grupos
Inicial
G1
G2
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
0.356
0.500
0.315
0.431
0.613
0.310
0.351
0.526
0.406
G3
(mg/mL)
0.372
0.615
0.325
(c)
Exp
B
C
F
K
cido Mlico
Grupos
Inicial
G1
G2
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
0.317
0.353
0.263
0.275
0.225
0.349
0.212
0.189
0.228
0.310
0.224
0.188
G3
(mg/mL)
0.209
0.317
0.183
0.212
(d)
Exp
B
C
F
K
cido Actico
Grupos
Inicial
G1
G2
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
0.305
0.351
0.282
0.281
0.376
0.397
0.336
0.286
0.346
0.355
0.227
0.369
G3
(mg/mL)
0.321
0.473
0.247
0.287
(e)
Exp
B
C
F
K
cido Ctrico
Grupos
Inicial
G1
G2
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
0.259
0.258
0.216
0.242
0.274
0.314
0.240
0.276
0.246
0.270
0.228
0.256
G3
(mg/mL)
0.251
0.322
0.219
0.258
(f)
Exp
B
C
F
K
cido Propinico
Grupos
Inicial
G1
G2
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
0.125
0.125
0.126
0.153
0.144
0.127
0.128
0.142
0.120
0.138
0.153
0.159
G3
(mg/mL)
0.122
0.133
0.125
0.172
cambio el hecho que no existan diferencias entre los grupos indican que esto se
debera al azar.
Por otro lado, la prueba para el . mlico (Tabla 36-b), presenta diferencias claras
tanto entre los grupos de pH como entre los experimentos. Los valores de P
relativamente bajos indican que las diferencias no se deben al azar.
El . ctrico por su parte presenta diferencias entre los grupos de pH, las
diferencias entre los experimentos tambin es remarcable. Al igual que para el .
galacturnico, se utiliz un nivel de significancia de 0.1 para el clculo de F.
Ambas diferencias no se deberan al azar de acuerdo a estos resultados.
El . frmico presenta diferencias entre experimentos pero no entre los grupos
experimentales. Las diferencias entre los experimentos no se deben al azar, en
cambio el hecho que entre grupos no haya diferencias podra deberse al azar, en
parte debido al valor relativamente elevado del coeficiente P.
Por su parte, se pueden apreciar diferencias entre los experimentos pero no entre
los grupos tanto para el cido actico como para el . propinico. En ambos casos
las diferencias entre los experimentos no seran el resultado del azar, pero s el
hecho que no existan diferencias entre los grupos se debera al azar.
(a) . Galacturnico
SS
df
MS
F
P-value
F crit
68.52777357
3 22.84259 3.26403 0.073326 2.812863
0.11817867
3 0.039393 0.005629 0.999373 2.812863
62.98449855
9 6.998278
Total
131.6304508
Source of Variation
Rows
Columns
Error
SS
0.035034891
0.01299707
0.003971187
Total
0.052003148
Source of Variation
Rows
Columns
Error
SS
0.008659529
0.002415798
0.001944975
Total
0.013020303
Source of Variation
Rows
Columns
Error
SS
0.1151609
0.00611956
0.01459855
Total
0.13587901
Source of Variation
Rows
Columns
Error
SS
0.031752
0.004007
0.020547
Total
0.056306
Source of Variation
Rows
Columns
Error
SS
0.002043
0.000232
0.001236
Total
0.003511
15
(b) . Mlico
df
MS
F
P-value
F crit
3 0.011678 26.46682 8.49E-05 3.862548
3 0.004332 9.818529 0.003375 3.862548
9 0.000441
15
(c) . Ctrico
df
MS
F
P-value
F crit
3 0.002887 13.35677 0.001156 2.812863
3 0.000805 3.726215 0.054411 2.812863
9 0.000216
15
(d) . Frmico
df
MS
F
P-value
F crit
2 0.05758045 23.6655458 0.001424 5.143253
3 0.00203985 0.83837925 0.520357 4.757063
6 0.00243309
11
(e) . actico
df
MS
F
P-value
F crit
3 0.010584 4.635999 0.031792 3.862548
3 0.001336 0.585051 0.639759 3.862548
9 0.002283
15
(f) A. Propinico
df
MS
F
P-value
F crit
3 0.000681 4.957748 0.026658 3.862548
3 7.72E-05 0.561768 0.653589 3.862548
9 0.000137
15
Los resultados de las mediciones de reflectoquant para los cidos mlico y lctico
se han resumido en una matriz (Tabla 45, Anexos, Seccin 10.6).
cido Mlico
Inicial
G1
G2
G3
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
139
125
190
198
166
186
159
95
145
86
74
73
128
60
151
83
65
61
62
135
102
93
79
118
cido Lctico
Inicial
G1
G2
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
150
72
103
84
136
73
75
96
52
97
159
104.5
27
17
21
15
18
18
14
36
42
25
33
26
36
31
60
44
43
46
31
32
41
47
31
39
G3
(mg/mL)
93
108
48
62
75
69
59
57
28
31
19
56
CONC_MAL
CON_LAC
PH_GROUP
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
Kolmogorov-Smirnov
Statistic
df
Sig.
.195
7
.200*
.207
7
.200*
.148
10
.200*
.181
11
.200*
.267
7
.143
.154
7
.200*
.165
10
.200*
.120
11
.200*
Statistic
.940
.906
.919
.928
.890
.953
.912
.971
Shapiro-Wilk
df
7
7
10
11
7
7
10
11
Sig.
.642
.368
.346
.391
.274
.757
.295
.899
CONC_MAL
CON_LAC
Between Groups
Within Groups
Total
Between Groups
Within Groups
Total
Sum of
Squares
27011.071
31149.971
58161.043
7525.948
8444.452
15970.400
df
3
31
34
3
31
34
Mean Square
9003.690
1004.838
F
8.960
Sig.
.000
2508.649
272.402
9.209
.000
Para el cido lctico se puede apreciar que solamente para los contrastes 1 y 4 se
han percibido diferencias entre los grupos. Es decir que el grupo inicial y el G3,
presentan diferencias, as como el G1, G2 con el G3.
Tabla 40 - Prueba de contrastes para ANOVA una va, datos de reflectoquant
(a)
Contrast Coefficients
Contrast
1
2
3
4
"6.1-6.3"
-1
0
0
0
PH_GROUP
4.5-4.8
4.2-4.4
0
0
-1
1
0
-1
-.5
-.5
3.7-4
1
0
1
1
(b)
Contrast Tests
Mal_Refl
Lac_Refl
Contrast
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
Value of
Contrast
-65.64286
.471429
5.600000
5.835714
-65.64286
.471429
5.600000
5.835714
40.337662
8.685714
17.509091
21.851948
40.337662
8.685714
17.509091
21.851948
Std. Error
15.32635
15.62152
13.85037
12.34329
14.67480
15.39460
14.41052
12.97824
7.9798693
8.1335535
7.2113769
6.4266991
8.3637379
3.6209769
8.6733414
8.3977674
t
-4.283
.030
.404
.473
-4.473
.031
.389
.450
5.055
1.068
2.428
3.400
4.823
2.399
2.019
2.602
df
31
31
31
31
15.103
13.137
19.000
19.440
31
31
31
31
10.792
14.995
12.322
10.981
Sig. (2-tailed)
.000
.976
.689
.640
.000
.976
.702
.658
.000
.294
.021
.002
.001
.030
.066
.025
Las concentraciones tanto del cido mlico como del cido lctico para los datos
de reflectoquant se graficaron en dependencia del pH en que se interrumpi la
fermentacin. Se pueden apreciar dos comportamientos diferentes tanto para el
cido mlico como para el cido lctico. El primero (Figura 25-a) presenta un
comportamiento decreciente, a medida que avanza el proceso fermentativo su
concentracin disminuye, se mantiene casi constante entre los G1, G2 y G3,
aumenta ligeramente en G3.
El cido lctico por su parte, para el cual no se obtuvieron datos mediante el
sistema HPLC presenta un comportamiento diferente (Figura 25-b), con la
concentracin aumentando de forma casi constante desde 20 mg/L al inicio hasta
alrededor de 60 mg/L hasta el G3.
Figura 25 - Comportamiento de las concentraciones de cido mlico y cido lctico a
medida que avanza el proceso de fermentacin, datos de Reflectoquant.
70
180
160
(a)
60
(b)
50
Mean of CON_LAC
Mean of CONC_MAL
140
120
100
80
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
40
30
20
10
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
Tabla 41 - Datos de Reflectoquant para el anlisis estadstico ANOVA dos vas, . mlico y .
lctico
Exp
B
C
F
K
139
125
190
159
128
145
86
74
G3
63.5
135
151
61
Exp
B
C
F
K
27
17
21
14
36
42
25
33
84
150
73
75
G3
37
32
60
46
62
93
69
59
Source of Variation
Rows
Columns
Error
SS
5243.922
8167.922
11230.27
df
3
3
9
Total
24642.11
15
MS
1747.974
2722.641
1247.807
F
1.400836
2.18194
P-value
0.304813
0.159894
F crit
3.862548
3.862548
(b) . Lctico
Source of Variation
Rows
Columns
Error
SS
149.1875
5554.688
1261.063
df
3
3
9
Total
6964.938
15
MS
49.72917
1851.563
140.1181
F
0.354909
13.2143
P-value
0.786919
0.001201
F crit
3.862548
3.862548
En el caso del . lctico, las diferencias entre experimentos no son evidentes y por
el contrario se podra concluir que sus similitudes se deberan al azar (un valor P
relativamente alto). En el caso de los grupos, hay diferencias claras y el valor P
bajo indica que otras son las causas (no el azar) de esas diferencias.
6 DISCUSIN
Tabla 25) debido a que durante los das en que se realiz dicho experimento las
condiciones experimentales variaron un poco con relacin a las que se venan
manifestando en das previos, uno de los aspectos ms destacables fue la
temperatura, durante el da en que se llev a cabo el anlisis (26/06/06) la
temperatura del laboratorio y en especial en el sitio en donde se encontraba el
equipo de HPLC sufri un incremento cercano a los 10 C con relacin a los das
con que previamente se haban analizado otras muestras. Esto fue una de las
causas por las cuales los picos en los cromatogramas presentaron tiempos de
elusin diferentes a los que en da previos venan presentando, adems, se pudo
observar que a temperaturas ms altas el pico que representaba al . frmico se
fusionaba con el pico de . galacturnico, razn por la cual no fue posible
identificarlo y estos datos no se pudieron incluir en el instrumento de investigacin.
A pesar que en general los resultados obtenidos tanto para la prueba ANOVA 1
va (Seccin 5.3.2.1) y como los resultados de la prueba de Kruskall- Wallis
(Seccin 5.3.2.2) no indicaron diferencias importantes entre los grupos, los
resultados
deben
analizarse
con
ms
detenimiento
para
identificar
los
esto puede dar una indicacin que ambas tcnicas estaran correlacionadas y que
definitivamente el patrn observado para este cido tiene una relacin con la cada
del pH.
A pesar de estas diferencias en cuanto al carcter de la distribucin, en ambos
casos hubo diferencias entre los grupos debido a las caractersticas del
comportamiento de la concentracin del cido mlico en dependencia del pH y en
base a la prueba de contrastes que se realizaron a los datos de reflectoquant
(Tabla 40). La literatura (Flament, 2002) reporta que este cido es responsable de
la acidez junto con los cidos actico y ctrico. Por lo general el . mlico se asocia
con notas de sabores acaramelados.
Algunos de los grupos dentro del cido propinico tampoco se ajustaron a una
distribucin normal, por lo tanto se realiz una prueba no paramtrica y los
resultados de esta indicaron que no haba diferencias entre los grupos.
Esto
.33
(a)
.48
(b)
.32
.31
Mean of CON_ACE
Mean of CONC_FOR
.46
.44
.42
.40
"6.1-6.3"
.26
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
.30
.29
.28
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
4.2-4.4
3.7-4
11.0
(d)
(c)
10.8
10.6
Mean of C_gal
Mean of CON_CIT
.25
.24
.23
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
(e)
4.5-4.8
(f)
.136
.24
.22
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
Mean of CON_PROP
Mean of CONC_MAL
10.0
"6.1-6.3"
.138
.26
.20
"6.1-6.3"
10.2
.140
.30
.28
10.4
.134
.132
.130
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
Vistos los comportamientos para todos estos cidos, se puede decir que en
trminos generales para la prueba ANOVA 1 va, los resultados no arrojaron
diferencias significativas entre todos los grupos. Los grficos de concentracin en
de
cido
galacturnico
fueron
inferiores
(a)
(b)
12.00
10.00
6.00
C (mg/ml)
8.00
4.00
2.00
Galacturnico
Propinico
Ctrico
Actico
Mlico
Frmico
Promedio
0.00
6.1- 4.56.3 4.8 4.2- 3.74.4 4-0
pH de interrupcin
de fermentacin
.4
(a)
(b)
14
.3
12
10
.2
C_MALIC
Gal_Acid
8
6
4
N=
.1
N=
.5
.34
(c)
.32
(d)
.30
.4
.28
.26
C_CITRIC
C_ACETIC
.3
.2
N=
.22
.20
N=
.18
.17
.24
.7
(e)
.6
(f)
.16
.5
.15
.14
C_FORMIC
.4
C_PROP
.13
.12
.11
N=
.3
.2
N=
(a) A. galacturnico, (b) A. mlico, (c) A. actico (d) A. ctrico (e) . Propinico
(f) . Frmico. Eje X presenta los experimentos.
Figura 29 - Grfica y tabla con el coeficiente de correlacin para cido mlico, tcnica del
reflectoquant y HPLC.
.20
.18
Correlations
.16
.14
M_Refl (mg/ml)
M_Refl (mg/ml)
.12
M_HPLC (mg/ml)
.10
.08
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
M_Refl
M_HPLC
(mg/ml)
(mg/ml)
1
.598**
.
.000
36
36
.598**
1
.000
.
36
36
.06
.04
.1
.2
.3
.4
M_HPLC (mg/ml)
medida que avanza el proceso fermentativo, este incremento fue reportado por
Wootton (1963b) y comprobado por Avallone et al (2001b).
Figura 30 - Concentraciones de cido lctico a medida que disminuye el pH en que se
interrumpe la fermentacin
120
100
Mean of C_L_FIEL
80
60
40
20
0
"6.1-6.3"
"4.5-4.8"
"4.2-4.4"
"3.7-4"
Correlations
80
C_L_FIEL
60
C_L_LAB
C_L_LAB
40
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
C_L_FIEL C_L_LAB
1
.877**
.
.000
34
34
.877**
1
.000
.
34
34
20
0
0
100
200
300
400
C_L_FIEL
Una causa de estos cambios es el factor de dilucin empleado para disolver las
muestras en agua destilada, a pesar que se trat de emplear un factor de dilucin
similar para ambas fases, se obviaron mediciones cuantitativas con instrumentos
volumtricos en la fase experimental, en su defecto se utilizaron recipientes de
plstico graduados para representar el lmite mximo de granos o de agua
purificada (tratando de representar al mximo las condiciones en que los
cafetaleros utilizaran el mtodo). Por otro lado en la fase de laboratorio las
mediciones se realizaron con frascos volumtricos y tambin se llev un registro
ms estricto de las masas y volmenes con que se diluy cada muestra.
6.0
PH_STRIP
5.5
PH_REF_F
5.0
PH_STRIP PH_REF_F
1
.986**
.
.000
27
27
.986**
1
.000
.
27
27
4.5
PH_REF_F
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
4.0
3.5
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
PH_STRIP
Figura 33- Grfica y tabla de correlacin (Pearson) entre las mediciones de pH, fase
experimental y fase de laboratorio
6.5
Correlations
6.0
PH_FIELD
5.5
PH_LAB
5.0
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
PH_FIELD
PH_LAB
1
.903**
.
.000
34
34
.903**
1
.000
.
34
34
PH_FIELD
4.5
4.0
3.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
PH_LAB
7 CONCLUSIONES
Por otro lado, los promedios de las concentraciones de cada cido dentro de cada
grupo (tomando en cuenta todos los valores) indican un incremento conforme
avanza la fermentacin para cidos representativos como actico, ctrico y mlico.
Los datos de Reflectoquant obtenidos para el . mlico se correlacionaron con los
obtenidos con HPLC y la correlacin fue altamente positiva, lo cual valida la
tcnica del Reflectoquant.
Los datos de Reflectoquant tambin fueron tiles para conocer el comportamiento
del . lctico, el cual, como se explic con anterioridad, no pudo ser detectado
mediante HPLC. Para este cido se comprob un comportamiento de aumento de
la concentracin conforme avanza el proceso fermentativo.
8 RECOMENDACIONES
Los resultados del mismo estudio (Jackels et al, 2006), pero con los experimentos
realizados de forma independiente por productores de caf con los kit distribuidos
en sus fincas, indicaron mejoras remarcables en la calidad del caf cuya
fermentacin fue interrumpida en un pH cercano a 4.6. Dichas mejoras fueron
destacables en aquellos productores que midieron adecuadamente el pH y
registraron los valores de forma correcta.
Los anteriores resultados, as como el patrn identificado para determinados
cidos (actico, ctrico y lctico) en la presenta investigacin, adems de la
correlacin muy buena entre la tcnica cualitativa de las cintas de pH y la tcnica
cuantitativa de medicin de pH mediante Reflectoquant, permite recomendar
futuras prcticas con el uso del kit para controlar el pH de fermentacin. Un
aspecto fundamental es la utilizacin correcta del kit: la lectura adecuada de los
pH indicados por los colores de las cintas, anotar los datos correctos. Se ha
discutido la posibilidad de capacitar en la realizacin de esas tareas a los
miembros ms jvenes de las familias, tomando en cuenta que estn envueltos en
el sistema educativo y que conjugan los conocimientos heredados de sus mayores
en cuanto al procesamiento del caf con una apertura personal para aceptar
modificaciones a las tcnicas con que procesan el caf.
La longitud de onda del detector UV (214 nm) detect interferencias en el tiempo
de retencin del c. Lctico. El c. interferente fue cido ascrbico, se recomienda
por tanto realizar ensayos con longitudes de onda diferentes con el fin de
comparar la deteccin excluyente del cido ascrbico.
Como se apreci, la tcnica HPLC tiene sus limitantes al realizarse anlisis con
caf verde. Las comparaciones de calidad basadas en las concentraciones de
determinados cidos se podran mejorar al utilizar caf tostado y la tcnica de
Cromatografa de Gas (GC). Ambas experiencias podrn desarrollarse con
instrumentos ya existentes en la Universidad como parte de futuros proyectos de
tesis.
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231-234.
isolated
from
coffee
wet-processing
wastewater.
Applied
Policy Research
10 ANEXOS
La finca tiene una produccin diversificada: los cafetales bajo sombra albergan rboles frutales, otras actividades
econmicas implican la ganadera mayor (con reas de pastos importantes) y la ganadera menor. El rea total de
la finca es de 178 manzanas (125.42 Ha), y se han destinado 36 manzanas (26 Ha) para el cultivo de caf
orgnico.
Archivo
Roberto 36
Roberto 11
Carlos 13
Roberto 30
Roberto 17
Roberto 24
Newinternal 02
2
3
4
5
6
7
8
Mezcla de cidos
(mg/mL)
0.4
1.2
2.4
4
6
8
Archivo
Coffee_nic 91
Coffee_nic 92
Coffee_nic 95
Coffee_nic 98
Coffee_nic 101
Coffee_nic 105
Orden en el set de
cromatogramas
1
2
3
4
5
6
10.5 CROMATOGRAMAS
CORRESPONDIENTES
LAS
Experimento
B
Cdigo
5082
8189
8410
3470
2585
6053
2837
6053
1510
5307
1293
5122
6346
3727
9370
7118
9296
6181
8071
5000
9801
6615
2935
5169
2935
Beneficio
8507
6319
6319
5583
6832
6174
6174
7060
3539
8548
pH (papel)
4.5
3.9
6.3
4.3
4.2
4.7
4.2
6.3
4
3.7
4.2
3.9
4.8
4.2
3.8
4.4
4.7
3.9
6.1
4
4.2
4.4
6.1
4.5
4.6
4
3.8
6.1
4.3
3.9
4.7
6.1
4.2
3.9
3.8
archivo
coffee_nic140
coffee_nic79
coffee_nic88
coffee_nic85
coffee_nic82
coffee_nic149
coffee_nic146
coffee_nic152
coffee_nic143
coffee_nic112
coffee_nic118
coffee_nic115
coffee_nic134
coffee_nic131
coffee_nic128
coffee_nic137
coffee_nic159
coffee_nic156
coffee_nic168
coffee_nic171
coffee_nic174
coffee_nic180
coffee_nic183
coffee_nic186
coffee_nic189
coffee_nic192
coffee_nic198
coffee_nic195
coffee_nic201
coffee_nic227
coffee_nic230
coffee_nic233
coffee_nic236
coffee_nic239
coffee_nic242
coffee_nic245
10.6 MATRICES
DE
CONCENTRACIONES
RESULTADOS
DE
CIDOS
CON
LAS
CARBOXLICOS
En las siguientes matrices se presentan las mediciones realizadas para los cidos
mlico y lctico mediante Reflectoquant .
La configuracin de las matrices es igual a la utilizada para recolectar los datos
mediante HPLC, con las filas indicando las separaciones entre experimentos y las
columnas las separaciones entre pH.
Para las mediciones de estos parmetros se utilizaron las mismas muestras que
para el anlisis mediante HPLC.
Tabla 45- Matriz de concentraciones determinadas para los cidos mlico y lctico mediante
reflectoquant
. Mlico Concentraciones (mg/ l)
Exp.
Benef.
Inicial
6.3
6.1
4.8
139.00
C
D
E
F
G
H
J
K
L
125.00
C
D
E
F
G
H
J
K
L
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
Exp.
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
190.00
198.00
80.00
166.00
186.00
159.00
159.00
Grupo 2 (pH =4.4-4.1)
4.4
4.3
4.2
65.00
62.00
135.00
102.00
93.00
151.00
79.00
83.00
61.00
118.00
145.00
95.00
86.00
73.00
60.00
74.00
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
3.9
3.8
84.00
3.7
150.00
136.00
104.50
52.00
73.00
72.00
103.00
97.00
75.00
Benef.
4.5
128.00
4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L
Inicial
4.5
36.00
31.00
3.7
56.00
10.8 CROMATOGRAMAS
PARA
LA
DETERMINACIN
DE