Escuela de Nivel Medio Superior de Celaya

Vzquez Herrera Claudia Ivonne

27 de Febrero del 2015.
6ACNE

PRACTICA III: SEMBRADO Y TINCION DE GRAM

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La
principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de
aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes
de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas,
cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin.
Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas
como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores
cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre
un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La
fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas
aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o
teidas no pueden realizarse con mucha precisin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales
celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se
combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos
y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la
safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes
celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina
cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se
combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas
o depstos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn.
Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que
no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnco.
El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el
colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los
procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las
clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es
especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del
material no celular no se tie.
La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se colorea
en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la
tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente
rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina
(un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de

BIBLIOGRAFIA: http://www.solociencia.com/biologia/microbiologia.htm
http://curiosidades.batanga.com/2011/06/30/clasificacion-de-las-bacterias-segun-su-forma

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las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de
las clulas bacterianas.
Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden conducir a
errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras
celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales
estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no
nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

Preparacin de frotis
Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teir (si es lquido) o se
hace rodar el hisopo con que se tom la muestra. Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos,
que no est estril, ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estril
para transferir una pequea cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es
suspendido en una gota de agua o solucin salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de
colonias muy pequeas que pueden perderse en una gota de lquido se emplea una varilla delgada de madera
estril con la cual se toca la colonia obtenindose as una fraccin apreciable del desarrollo. El material se frota
directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos
se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que
el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero no queme.

Tincin Gram
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico y con el que
el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo
microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la
morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc)
se

basan justamente en la tincin de GRAM

Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis
fijado con calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre
con solucin Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua, decolorar
con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de
contraste) durante 20 seg. Lavar y secar.

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:

1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad
con las clulas.

BIBLIOGRAFIA: http://www.solociencia.com/biologia/microbiologia.htm
http://curiosidades.batanga.com/2011/06/30/clasificacion-de-las-bacterias-segun-su-forma

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2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas. EI
proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados
satisfactorios.
3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo.
El carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos son ms
grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos.

CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS

Las bacterias son microorganismos unicelulares, los cuales slo pueden visualizarse adecuadamente a travs del
microscopio. Se presentan en las ms diversas formas y su tamao es tan diminuto que se miden en micrmetros,
es decir, la millonsima parte de un metro. Algunas bacterias pertenecen a formas diferentes, las cuales son ms
complejas que las mencionadas anteriormente. Las bacterias varan tanto en tamao como en forma. La ms
pequea mide entre 100 y 200 nm. de dimetro, el tamao que tienen aproximadamente los virus ms grandes
que existen. En la actualidad se sabe que algunas bacterias son mucho ms largas que las clulas eucariotas
promedio. Conozcamos un poco ms sobre los 3 tipos de bacterias ms frecuentes de acuerdo a su forma.

Bacilos: bacterias con forma de barras

Con forma de barras o varillas, los bacilos suelen ser bacterias de tipo Gram positiva o
negativa. Los ejemplos ms populares son los de las bacterias de E.Coli y la salmonella, que
comnmente, tambin son las responsables de males como la intoxicacin por alimentos y la
fiebre tifoidea. Dentro de los bacilos tambin podemos nombrar a dos de las bacterias ms
peligrosas que existen: el Bacillus anthracis, que causa la mortal enfermedad pulmonar del
ntrax y el Clostridium, que causa el botulismo, el ttanos y la gangrena.

Cocos: bacterias con forma de esferas

Con su caracterstica forma esfrica, las bacterias conocidas como cocos tienen la capacidad de vivir como clulas individuales o
bien de enlazarse hasta forman cadenas y racimos. El Staphylococcus y el Streptococcusson los dos tipos de bacterias ms
comunes dentro de esta clasificacin y ambas suelen ser Gram positivas. Igualmente, stas bacterias no suelen tener beneficios,

BIBLIOGRAFIA: http://www.solociencia.com/biologia/microbiologia.htm
http://curiosidades.batanga.com/2011/06/30/clasificacion-de-las-bacterias-segun-su-forma

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sino que por el contrario, siempre nos resultan perjudiciales. Pueden causar infecciones en la piel,
intoxicacin alimenticia y tambin amigdalitis, entre otras cosas.

Espirilos: bacterias con forma de espirales

Los espirilos, como bien nos indica su nombre, poseen una marcada forma de espiral. stas
son bacterias Gram negativas y terribles para la salud. Un claro ejemplo es la Treponema, que
causa la enfermedad de transmisin sexual de la sfilis.

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