Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
PRINCIPIOS DE COLORIMETRA
Toda medicin fotocolorimtrica consiste en la determinacin de la
concentracin de una sustancia por la cantidad de color que posee
naturalmente o que puede producir luego de una reaccin cromtica,
convenientemente elegida. Este procedimiento est basado en el hecho que
toda sustancia coloreada absorbe luz de una determinada longitud de onda ().
Cuando un tomo, ion o molcula absorbe un fotn, la energa agregada
produce una alteracin del estado, y se dice que las especies estn excitadas.
La excitacin puede involucrar alguno de los siguientes procesos:
1. transicin de un electrn a un nivel mayor de energa.
2. cambio en el modo de vibracin de las molculas con enlaces covalentes.
3. alteracin de su modo de rotacin alrededor de los enlaces covalentes.
La absorcin de la energa radiante por una solucin puede describirse por
medio de una grfica de absorbancia en funcin de la longitud de onda. Esta
grfica se denomina espectro de absorcin.
Por ejemplo para el caso de la oxihemoglobina:
Transmitancia = T = Is /Io
Usualmente esta razn se describe como un porcentaje (%T).
El concepto de transmitancia es importante porque slo puede medirse la luz
transmitida.
Cuando la concentracin de un compuesto en solucin aumenta, ms luz es
absorbida por la solucin y menos es transmitida. El porcentaje de T vara
inversamente y logartmicamente con la concentracin.
Sin embargo, es ms conveniente usar la absorbancia, A, la cual es
directamente proporcional a la concentracin.
Por lo tanto:
A = log Is/Io = log T = log (1/T)
Grficamente, si se grafica A o %T en funcin de la concentracin de la
solucin con el compuesto que absorbe energa, se obtienen los siguientes
grficos:
Ley de Lambert-Beer
La ley de Lambert-Beer o comnmente conocida como ley de Beer, establecida
en 1852 por Beer, quien postul que la reduccin de la energa radiante de un
haz de radiacin monocromtica es proporcional a la intensidad del haz y a la
cantidad de sustancia absorbente situada en su trayectoria. O sea que
establece que la concentracin de una sustancia es directamente proporcional
a la cantidad de energa radiante absorbida o inversamente proporcional al
logaritmo de la energa radiante transmitida. Si la concentracin de una
solucin es constante y la longitud del paso de luz que atraviesa una solucin
se duplica, el efecto sobre la absorbancia es igual duplicar la concentracin, ya
que habr dos veces ms molculas absorbentes presentes en el paso de
energa radiante. De este modo la absorbancia tambin es directamente
proporcional a la longitud de la trayectoria que atraviesa la energa radiante a
travs de la celda. La relacin matemtica entre la absorcin de energa
radiante, la concentracin de la solucin, y la longitud del paso ptico se
demuestra por la ley de Beer:
A = a.b.c
donde A es la absorbancia o densidad ptica; a, absortividad; b, paso de luz de
la solucin en centmetros; y c, concentracin de la sustancia de inters.
Esta ecuacin forma las bases del anlisis cuantitativo por fotometra de
absorcin o espectroscopa de absorcin. Los valores de absorbancia no tienen
unidades.
La absortividad es una constante de proporcionalidad relacionada con la
naturaleza qumica del soluto y tiene unidades que son recprocas con las de b
y c.
Cuando c se expresa en moles por litro y b en centmetros, el smbolo e,
llamado absortividad molar (o coeficiente de extincin molar), se usa en lugar
de a y es una constante para un compuesto dado a una determinada longitud
de onda, bajo condiciones especficas de solvente, pH, temperatura, etc. Tiene
unidades de L/mol.cm (o sea: M -1.cm-1). Mientras mayor es la absortividad
molar, mayor es la absorbancia para la misma concentracin en trminos de
masa de dos compuestos.
Una vez probado que la sustancia sigue la ley de Beer a una longitud de onda
especfica (es decir, una grfica lineal de A contra c conteniendo el punto 0;0),
la concentracin de una solucin desconocida puede ser determinada midiendo
su absorbancia e interpolando su concentracin en la grfica de calibracin.
Por el contrario, cuando el %T se grafica frente a la concentracin (en un papel
milimetrado), se obtiene una relacin curva (similares a las mostradas
previamente).
La ley de Beer es una relacin matemtica ideal que contiene varias
limitaciones.
Por lo tanto existen desviaciones de la ley de Beer, que implican variaciones en
la linealidad de la absorbancia contra la concentracin, y una de estas causas
es cuando se miden concentraciones muy elevadas de una sustancia.
Entonces la ley de Beer es aplicable slo a soluciones diluidas.
Tambin es sabido que si dos o ms compuestos absorben a la longitud de
onda de la energa radiante incidente, cada uno con diferente absortividad, no
se cumplir la ley de Beer.
Los instrumentos que miden la absorbancia de soluciones contienen siete
componentes bsicos:
(1) una fuente estable de energa radiante;
(2) una hendidura de entrada para el enfoque de la luz;
(3) un selector de longitud de onda;
(4) una hendidura de salida para el enfoque de la luz;
(5) un dispositivo para mantener el recipiente transparente (cubeta) que
contiene la solucin a ser medida;
(6) un detector de energa radiante;
(7) un dispositivo para leer la seal elctrica generada por el detector.
ureasa
UREA + H2O
CO2 + 2 NH3
0,6 mM
0,8 mM
1,0 mM
1,2 mM
1,5 mM
UREA
(ml)
5
4
3
2
1
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
REACTIVO
1
(ml)
1
1
1
1
1
Tiempo
Incubacin
(Min)
30
20
10
5
0
REACTIVO Desarrollo
2
de color
(ml)
(Min)
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
INFORME
GRUPO DE TRABAJO (ANOTE N DE GRUPO Y LOS APELLIDOS Y
NOMBRES DE LOSPARTICIPANTES DEL ENSAYO)
RESULTADOS PROPIOS: GRFICO producto= f (t)
CONCENTRACIN
(COMPLETAR)
TUBO N
1
2
3
4
5
DE
SUSTRATO
UTILIZADO
Tiempo de Incubacin
(Min)
0
5
10
20
30
SUSTRATO=
Absorbancia
530 nm
Eje Y
(NH3)
(mM)
Eje X
Tiempo de Incubacin
(minutos)
0
5
10
20
30
RESULTADOS DE LA COMISIN:
GRFICOS Vo en funcin de (sustrato) Y 1 / Vo en funcin de
(1/ sustrato)
Completar la siguiente tabla (indicar las unidades).
Eje Y
Vo
Eje X
UREA
Eje Y
1/Vo
Eje X
UREA
Km =
Vmx =