Manipulacin y manejo de ratones (Mus musculus), observacin de estructuras internas,

macrfagos alveolares, intraperitoneales, mdula sea y esplenocitos estimulados con

tioglicolato.
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE.
Departamento de Ciencias de la Vida
Carrera de Ingeniera en Biotecnologa
Inmunologa
Gabriela Sevillano
06 de marzo de 2015
RESUMEN
La presente prctica se llev a cabo usando ratones (Mus musculus) un animal fcil de manipular y
muy utilizado para experimentos de laboratorio. Para esto se necesita conocer los reglamentos
necesarios para una manipulacin correcta, la forma de administracin peritoneal e intradrmica,
adems de los mtodos de necropsia para obtener macrfagos y esplenocitos. Los macrfagos son
clulas mononucleadas que se caracterizan por su capacidad de fagocitar y degradar material
particulado, los esplenocitos son clulas que se encuentran en el bazo, y constituyen la primera lnea
de defensa contra agentes extraos y controlan procesos degenerativos eliminando clulas
anormales e inhibiendo su divisin dentro del organismo. El presente trabajo tiene como objetivo
manipular ratones machos de 6 semanas, para obtener macrfagos de lquido peritoneal, alveolar y
de la mdula sea, adems de esplenocitos del bazo para su posterior observacin en microscopio
invertido y conteo celular empleando cmaras de Neubaer, respectivamente. Los resultados
obtenidos demostraron la presencia de macrfagos al estimular al ratn con tioglicolato, y de
esplenocitos, de los cuales se realiz un conteo mediante cmara de Neubauer, teniendo un total de
2,25x106 macrfagos/ml en la mdula sea, 3,08x10 6 macrfagos/ml en el lquido peritoneal y
8,75x105 esplenocitos/ml del bazo
Palabras clave: Macrfagos, esplenocitos, Mus musculus.

ABSTRACT
This practice was carried out using mice (Mus musculus) easy to handle and very animals used for
laboratory experiments. For this we need to know the regulations necessary for the proper handling,
how to peritoneal and intradermal administration, besides autopsy methods for macrophages and
splenocytes. Macrophages are mononuclear cells that are characterized by their ability to phagocytose
and degrade particulate material, splenocytes are cells found in the spleen, and are the first line of
defense against foreign organisms and eliminating control degenerative processes and inhibiting

abnormal cell division within the organism. This paper aims to manipulate male mice of 6 weeks, for
peritoneal macrophages, alveolar fluid and bone marrow, spleen plus splenocytes for further
observation inverted microscope and cell counting using cameras Neubaer, respectively. The results
obtained showed the presence of macrophages by stimulating the mouse thioglycolate, and
splenocytes, of which a count was performed using a Neubauer chamber, having a total of 2,25x106
macrophages / ml in the bone marrow, macrophages 3,08x106 / ml in peritoneal fluid and 8,75x105
splenocytes / ml spleen.

Keywords: macrophages, splenocytes, Mus musculus.

1. INTRODUCCIN
Los modelos experimentales son herramientas
biolgicas que en los ltimos aos facilitan el
conocimiento de los procesos naturales y
patolgicos. En las primeras fases de
experimentacin se implementa el uso de
animales de laboratorio, los cuales son
utilizados como instrumentos de investigacin
cientfica (Prez, 2007).
Un animal de laboratorio es aquel que es
engendrado y producido bajo condiciones
controladas, mantenido su entorno controlado
como
la
alimentacin,
ambiente,
antecedentes microbiolgicos y genticos
conocidos y existe una comprobacin
sistemtica de estos antecedentes (Instituto
Nacional de Salud, 2008).
Los animales deben ser manejados
adecuadamente para poder realizar diferentes
mtodos como los siguientes: administracin
de substancias las cuales pueden ser por
varias vas como subcutnea, intravenosa,
intradrmica, intraperitonial, intramuscular,
entre otras (Fuente, 2010).
La eleccin de la va depende del objetivo de
la investigacin que se va a realizar y el uso

de sustancias de administracin deben ser

apropiadas para la va elegida puesto que
estos incluyen solubilidad, viscosidad, pH,
pureza y estabilidad las cuales pueden afectar
al ratn por lo que antes de inyectar la
sustancia debe conocerse lo que esta tiene; la
absorcin de la misma depende de estas
caractersticas incluidas la vas de
administracin (Mortn, 2001).
1.1.

MACRFAGOS

Los macrfagos son clulas mononucleadas

que se caracterizan por su capacidad de
fagocitar y degradar material particulado,
presentan caractersticas como: son clulas
fusiformes o estrelladas, que poseen una gran
plasticidad de 30-40 micras de dimetro,
tienen un ncleo arrionado, tienen cromatina
laxa, su citoplasma es acidfilo, emiten
pseudpodos,
sus
orgnulos
estn
desarrollados o no segn la actividad de la
clula, tienen acmulos de glucgeno y
vacuolas lipdicas en el citoplasma, sintetizan
y liberan interleuquina-1 (IL-1), factor de
necrosis tumoral (TNF), factor de crecimiento
de fibroblastos(FGF), interleuquina-6, factor
pirgeno, peroxidasas, lisozima, hidrolasas
(Universidad Catlica de Chile, 2013).

Los macrfagos alveolares (MA) son las

clulas presentadoras de antgenos ms
abundantes en las vas areas y espacios
alveolares, donde juegan un rol importante en
la regulacin del sistema inmune y en cuadros
de inflamacin. El macrfago tiene su origen
en las clulas germinales pluripotenciales
(CGp-GM) de la mdula sea (Lambrecht,
2006).
Tienen funciones como: fagocitar clulas
envejecidas, muertas o inactivas, presentar
mecanismos de defensa del organismo en la
invasin bacteriana, por ello se presentan en
las inflamaciones de tipo crnico (Universidad
de Valencia, S/A).
En cuanto a la obtencin de la poblacin
celular peritoneal rica en macrfagos se puede
mencionar que es imposible obtener una
poblacin peritoneal compuesta solo por
macrfagos, pero se puede conseguir
poblaciones altamente enriquecidas en estas
clulas. Una de las tcnicas empleadas con
este fin es la adherencia de estas clulas al
plstico o vidrio, este procedimiento permite la
separacin de las clulas de una suspensin
celular en adherentes (ricas en macrfagos) y
no adherentes (ricas en linfocitos)
(Universidad Catlica de Chile, 2013).
El procedimiento llevado a cabo siguiendo el
mtodo antes descrito consiste en suspender
las clulas peritoneales en medio RPMI 1640
compuesto por 25mM de HEPES buffer, Lglutamina y bicarbonato de sodio (Villanueva,
2002).
1.3 ESPLENOCITOS
Los esplenocitos son clulas mononucleares
fagocitarias presentes en el seno del bazo,
que identifican agentes extraos que ingresan

al organismo y los destruyen por lo que los

estas clulas constituyen una de las lneas de
defensa del organismo contra infecciones
(Roitt et al, 2008).
Para la obtencin de esplenocitos es
necesario sacrificar los ratones mediante
dislocacin cervical, seguida de la extraccin
del bazo, est se debe realizar con cuidado y
bajo condiciones de esterilidad, para
maximizar los niveles de bioseguridad, la
extraccin se realiza empleando cabina de
flujo laminar. El rgano es depositado en una
caja de Petri con medio RPMI suplementado
con suero fetal bovino (SFB) al 10%. La
perfusin de los bazos se realiza con jeringa y
en condiciones de esterilidad hasta obtener
ms del 90% del contenido celular. Los
esplenocitos mononucleares se separaran con
gradiente de densidad (Sikora&Smedley,
2000).
Por lo cual el presente estudio pretende
realizar la obtencin de macrfagos y
esplenocitos a partir de fluidos peritoneales,
alveolares y de la mdula sea, adems del
bazo respectivamente, mediante la utilizacin
de diversas tcnicas de ratones in vivo.
2. METODOLOGA
2.1 Material Biolgico
Se obtuvieron 5 ratones machos de 6
semanas de edad, de la tienda Okypet
ubicada en el Barrio San Vicente, Quito
Ecuador. Se las mantuvo majo condiciones
controladas de alimentacin, su dieta constaba
de zanahoria, gelatina sin sabor y agua.
2.2. Manejo y manipulacin de los ratones

Para el manejo de los ratones se realiz una

sujecin con una mano, se sac al ratn del
vaso de precipitacin tomndolo de la cola y
se lo apoy en una rejilla, se estir la cola
hacia atrs, posteriormente se agarr un
pliegue de la piel en la parte trasera del cuello
con los dedos pulgar e ndice. Luego se gir
la mano hacia adelante colocndose al ratn
con su lado ventral hacia arriba y finalmente
se sujet la cola. La cabeza y el cuerpo se
colocaron en una posicin recta y cmoda de
espaldas apoyada en la palma de la mano.
(Imagen 1).

Figura 1. Manejo y manipulacin del ratn

(Llamuca, 2015)
2.3. Inmunizacin
La inmunizacin se realiz a los 0 das, se
realiz una simulacin de inmunizacin con
0,2 mL de PBS 1X administrados a los ratones
por va intraperitoneal. Despus de 10 minutos
se realiz la inmunizacin inoculando 0,2 mL
de medio tioglicolato por va intraperitoneal
como se observa en la imagen 2.

Figura 2. Administracin de tioglicolato por va

intraperitonial. (Llamuca, 2015)
2.4. Obtencin y cultivo de los macrfagos
en lquido peritoneal
Cinco das luego de la inmunizacin, se
sacrificaron 2 ratones por dislocacin cervical,
se realiz cortes en la piel para exponer el
rea del peritoneo y se us medio 10 ml de
RPMI para llenar toda la cavidad peritoneal y
realizar un lavado, despus se recuper el
medio lquido con la misma jeringuilla
obtenindose aproximadamente 8ml, ver
imagen 3, luego se verti el medio con los
macrfagos en una caja Petri y se llev la
incubacin en CO2 al 5%, y 37C durante 4
horas, posteriormente se observ los
resultados en el microscopio invertido.
A parte de la recuperacin de los macrfagos
se retir los rganos principales del ratn entre
ellos cerebro, intestino, corazn, pulmones y
bazo y se midi el tamao de estos.

Figura 3. Lavado de la cavidad peritoneal con

medio RPMI para obtencin de macrfagos.
(Llamuca, 2015)
2.5. Obtencin de macrfagos de la mdula
sea
Se realiz el corte del fmur y el peron del
ratn, obtenindose el hueso libre de tejido
muscular, a continuacin se cortaron las
cabezas, y se colocaron en tubos eppendorf
de 2ml, y se llev a centrifuga a 1000 rpm por
10 min, una vez obtenido esto se retir en
sobrenadante y el pellet se mezcl 1ml de
RPM1, se prepar la disolucin con BLUETRIPAN 10l de muestra-90l del reactivo. S
coloc en la cmara de Neubauer, y se
observ al microcopio ptico.
2.6. Obtencin de macrfagos alveolares
Se procedi a realizar una microciruga
traqueal, siguiendo las consideraciones
indicadas, estas son la fijacin del ratn la
superficie, y el corte en la zona del cuello, se
identific la trquea, y se inyect 1ml de RPMI,
despus se recuper el medio lquido con la
misma jeringuilla, a continuacin luego se
verti el medio con los macrfagos en una
caja Petri y se observ los resultados en el
microscopio invertido.

Figura 4. Administracin de tioglicolato por va

traqueal. (Llamuca, 2015)
2.7. Obtencin de esplenocitos
Para la obtencin de esplenocitos se sacrific
2 ratones por dislocacin cervical, se recuper
el bazo y se lo tritur mecnicamente con el
pistn de una jeringa, hasta obtener pedazos
pequeos. Para purificar lo esplenocitos se
utiliz una gasa para filtrar el lquido como se
observa en la imagen 4. Posteriormente se
centrifug el preparado por 8 minutos a 1200
rpm y se suspendi el pellet en 5mL de medio
RPMI, debido a que existe contaminacin por
glbulos rojos se aadi el buffer lisis y se
realiz aspiracin sucesivas por 1 min, se
volvi a centrifugar por 10 minutos y el pellet
se resuspendi en medio RPMI, se prepar la
disolucin con BLUE-TRIPAN 10l de
muestra-90l del reactivo. S coloc en la
cmara de Neubauer, y se observ al
microcopio ptico.
Para determinar la cantidad de esplenocitos se
aplic la siguiente frmula:
C=

clulas x factor de dilucin x 100000

cuadrculas x volumen de un muestra

Para hacer una estimacin real se multiplic,

por el factor de dilucin 1 en 10, y un volumen
inicial de 0,1.

Peso de ratones vs. Tiempo

No.
ratn
A

Figura 5. Trituracin del bazo con el pistn de

la jeringa. (Torres, 2014)
3. RESULTADOS
Tabla. 1. Resultado de datos individuales de
supervivencia (%) vs. Tiempo.
Supervivencia de ratones (%) vs.
Tiempo.
Tiempo
No.
Porcentaje
(das)
Ratones
de ratones
vivos
vivos (%)
0
5
100
5
3
60
7
3
60
12
0
0

Tabla. 2. Resultado de datos individuales de

peso (%) vs. Tiempo.

Tiemp
o en
das
0

Peso
ratn
(g)
15

13,2

14,6

15,5

13,8

12

12,7

13,9

14,3

13,5

12

12,5

17

14,4

18,8

16,5

15,3

12

13,9

% disminucin

PROME
DIO

12

13,01

10,07

15,29

26,06
15,29

Tabla. 3. Resultados de las mediciones de

cerebro, intestino, bazo, corazn y pulmones.
Mediciones de rganos de los
ratones
No. Ratn
A

Estructur
as
Cerebro
Intestino

PROMEDIO

Tamao
(cm)
1,2
34

Bazo

1,2

Corazn

0,8

Pulmone
s
Cerebro

1,7

Intestino

36

Bazo

1,5

Corazn

0,9

Pulmone
s
Cerebro

1,2

Intestino

35

1,1

Bazo

1,35

Corazn

0,85

Pulmone
s

1,45

Tabla. 4. Resultado del conteo de clulas de

macrfagos en dilucin y con trypan blue.

Peso vs tiempo
20
18

Clulas/ml
MACROFAG
OS

16

5,5*10^6

10

2,25*10^
6
1,5*10^6

RATN

14
12

Liquido
peritoneal
Medula
Liquido
peritoneal

10

12

14

6000000
4000000
Numero de macrofagos
2000000

Tabla 4. Conteo de esplenocito por clulas/ml

RATN

Clulas/ml
ESPLENOCI
TOS

B
E

RATONES

1*10^6
7,5*10^5

Grfico 1.
Tiempo.

Grfico 3. Nmero de clulas/ml en relacin

de macrfagos para los ratones A, C, D.

Grfico de mortalidad (%) vs.

Supervivencia de ratones (%) vs. Tiempo.

1000000
500000
Numero de esplenocitos
0

Ratones

4
2
0

10

12

Grfico 3. Grfico Peso vs Tiempo.

14

Grfico 3. Nmero de clulas/ml en relacin

de esplenocitos para los ratones B, E.

Figura 7. Observacin de macrfagos

alveolares en el microscopio invetido (Torres,
2015).

Figura 5. Observacin de macrfagos mdula

sea (Llamuca, 2015). Las clulas ms
oscuras representan aquellas que no son
viables.

Figura 8. Observacin de esplenocitos en el

microscopio invertido (Guerra&Sevillano,
2015).

4. DISCUSIN

Figura 6. Observacin del conteo de

esplenocitos con trypan blue en el microscopio
ptico realizada en la cmara de Neubauer
(Llamuca, 2015). Las clulas ms oscuras
representan aquellas que no son viables.

La variacin del porcentaje en peso de cada

ratn en los 12 das es evidente, la tendencia
de todos los ratones en transcurso de este
tiempo fue de disminuir de peso, obtenindose
un porcentaje promedio de disminucin de
15% esto se debe al cambio de alimentacin
y a los hbitos alimenticios y a la falta de
lquidos. Segn Quezada (2008), el alimento
para los ratones destinados a la
experimentacin, debe ser colocado en
cantidad y calidad suficientes para sus
necesidades y para conservar su salud;
adems, el acceso al alimento debe ser libre y
dosificado en base con los requerimientos,
minimizando la competencia por el alimento en
caso de tener grupos de ratones por jaula.
Los ratones sobrevivieron durante el
transcurso de la investigacin. Segn
Brockmann (2010), los ratones tienen un tipo

generacional muy corto, son muy prolficos y

se adaptan fcilmente a la vida en los
bioterios, mejorando su capacidad de
supervivencia, adems de esta manera se
pueden controlar las variables ambientales en
las experimentaciones.
Se observ que los ratones al da 17
presentaron inflamacin del intestino delgado
a nivel del leon, adems de heces de color
rojizo. Segn Velasco, (2012), la inflamacin
causada en el intestino delgado, impide la
absorcin de componentes importantes de los
alimentos, razn por la cual se produjo la
perdida excesiva de peso. El dao a la
mucosa del intestino proviene de una reaccin
a la ingestin de gluten, que se encuentra en
el trigo, la cebada, el centeno, y posiblemente
la avena, y en alimentos elaborados con estos
ingredientes. Esto adems ocasiona la falta de
absorcin de nutrientes debido a un dao en
las vellosidades intestinales. Por lo tanto, los
animales resultan desnutrida sin importar
cunto alimento consuma. Este trastorno es
ms comn en los organismos de raza blanca.
El fenotipo es un componente esencial para el
desarrollo de modelos animales y se
determina por la interaccin entre los factores
genticos y ambientales, de esta manera el
peso corporal y el desarrollo de los rganos en
ratones de laboratorio presentan diferencias
significativas cuando los animales son
producidos en condiciones distintas (Fuentes,
2012). En la Tabla.3., se observa la longitud de
los diferentes rganos de los ratones
sacrificados para las mediciones. Las
longitudes promedio fueron: cerebro 1.1 cm,
bazo 1.35 cm, intestino 35 cm, corazn 0.85
cm, y pulmones 1.45 cm.

La inoculacin con caldo Tioglicolato estimula

un incremento en la poblacin de macrfagos
peritoneales, y alveolares permitiendo
recolectar mayor cantidad de estas clulas, el
medio acta como un estmulo inflamatorio no
especifico. Al realizar el conteo de estos se
obtuvo 3,08x106 macrfagos/ml en el lquido
peritoneal, despus de la incubacin a 4
horas, para la viabilidad celular se evalu por
exclusin con azul de Tripano y las clulas se
contaron con una cmara de Neubauer
utilizando un microscopio ptico. Brockmann
(2010) dice que la observacin de macrfagos
debe realizarse despus de 4 horas de
incubacin y para visualizarlos de mejor
manera se puede realizar tincin con guiensa.
Al realizar el recuento de macrfagos
obtenidos de la mdula sea se obtuvo
2,25x106 macrfagos/ml, segn Lambrecht,
(2006), los macrfagos tiene su origen en las
clulas germinales pluripotenciales (CGp-GM)
de la mdula sea, por esta razn se los pudo
visualizar en la cmara de Neubuer.
El aislamiento de esplenocitos se lo realiz del
bazo del ratn, puesto que este rgano es en
donde encontramos gran cantidad de este tipo
de clulas, segn Martnez (2008), los
esplenocitos totales aislados mediante la
misma tcnica de esta prctica, da como
resultado 25x106 esplenocitos/ml, cuando se
correlacion este parmetro con los resultados
obtenidos en la prctica, el promedio de
esplenocitos es de 8,75x105 esplenocitos/ml,
se observ una gran diferencia con los
resultados de Martnez (2008). Se debe tomar
en cuenta, que el nmero de esplenocitos por
mililitro puede variar o ser ajustado a una
densidad celular especfica (Sierra, 2012).
5. CONCLUSIONES

Los ratones fueron manejados e inoculados de

manera correcta, evitando daos tanto al
operario como al ratn y el mnimo dolor.
La variacin de peso entre los diferentes
ratones, se relaciona a la disponibilidad y
dosificacin del alimento, adems de factores
ambientales y genticos.
Las longitudes de los diferentes rganos estn
relacionadas directamente al peso y desarrollo
del animal, se debe en gran parte, a los
factores externos introducidos por el hombre
para estudios cientficos.
El tioglicolato inoculado produce una
inflamacin dentro de la cavidad del peritoneo
que estimula y aumenta la cantidad de
macrfagos del ratn.
El conteo de esplenocitos, presenta un amplio
margen de variacin, la media de esplenocitos
por mililitro es muy alta en relacin a la
referencia de la cantidad extrable con una
misma tcnica.
Los macrfagos se pueden encontrar tanto en
el
lquido
intraperitoneales,
alveolos
pulmonares y mdula sea. Encontrndose
que existe una mayor cantidad en las
encontradas en los alveolos pulmonares.
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