AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Agrobacterium tumefaciens es una alfa-proteobacteria Gram negativa, de la familia

Rhizobiceae, que provoca tumores por transformacin en clulas vegetales; lo que se conoce
como la enfermedad de la agalla. Normalmente los tumores se forman en la parte baja del tallo,
sobre todo en plantas dicotiledneas. La capacidad infectiva de la bacteria se debe al plsmido
Ti (tumor inducing), siendo completamente avirulentas las cepas que carecen del plsmido.

I. PLSMIDO Ti
El plsmido Ti es replicativo, de doble cadena, circular y de gran tamao; que oscila mucho de
unas cepas a otras, pudiendo llegar a las 300Kb. Su tamao medio es cercano a las 200 kb. En l
se encuentran genes de virulencia, de sntesis y catabolismo de opinas (como octopina o
nopalina) y de sntesis de fitohormonas.
La regin del plsmido que se transfiere a la a la clula husped, se denomina t-DNA. En ella,
se encuentran genes para la sntesis de una o varias auxinas, de una o varias citoquininas y de
opinas. Las auxinas y citoquininas son las responsables de la formacin del tumor, por
proliferacin y crecimiento exacerbados de las clulas vegetales. Las opinas son derivados de
aminocidos, que sirven de principal de nutriente de Agrobacterium tumefaciens, sirvindole a
la bacteria de fuente de energa, por oxidacin aerobia. La regin t-DNA, se encuentra
flaqueada por dos secuencias constituidas por repeticiones directas de 23 nucletidos, en alguna
ocasin 25), que delimitan que zona del plsmido se va a movilizar. Estas secuencias se
denominan borde derecho e izquierdo del t-DNA. Todo lo ubicado entre ambas, pasar a la
clula vegetal.
Los genes de virulencia son los encargados de transferir y proteger el t-DNA. Se encuentran
como un opern.
En la regin que no se transfiere quedan los genes para el catabolismo de opinas.
Como todo plsmido, para poder permanecer en la bacteria sin perderse, porta el origen de
replicacin de Agrobacterium tumefaciens.
En conclusin, la funcin del plsmido es convertir a la planta en una factora productora de
opinas, para satisfacer los requerimientos energticos de la bacteria.

II. MECANISMO DE INFECCIN

Agrobacterium tumefaciens capta seales de tipo fenlico, por el receptor traducido a partir del
gen de virulencia virA; lo que le indica a la bacteria que se encuentra frente a una planta
susceptible a la transformacin.
Vir A presenta actividad sern-kinasa y al unirse a su ligando, fosforila, con gasto de ATP a Vir
G. Una vez fosforilado, Vir G acta como factor de transcripcin para el resto de genes de
virulencia. Por accin conjunta de Vir D1 y Vir D2 se escinde el t-DNA del resto del plsmido
de en la hebra que va de 5 a 3. Simultneamente, se transcribe una zona complementaria a la
que se separa del plsmido. Vir D2 se coloca en el extremo derecho del t-DNA. El t-DNA sale
de la bacteria a travs de un poro formado por Vir B. Mientras va saliendo, Vir D4 incorpora un
complejo formado por Vir E1 y Vir E2, a lo largo del t-DNA. El complejo formando por Vir D2,

VirE1-Vir E2 y t-DNA, entra en la clula vegetal, a travs de un mecanismo poco conocido, y

acompaado por VirF.
En el citoplasma vegetal, Vir E2 interacciona con VIP 1 y VIP2, lo que permite la unin de Vir
F al complejo. Vir D2 presenta una secuencia NLS (secuencia de direccionamiento al ncleo), la
cual es reconocida por importinas citoplasmtica, que dirigen al complejo al nucleoporo. El
nucleoporo formado por distintas protenas Nup, que permiten el paso del complejo, gracias a
que la importina establece uniones transitorias con las secuencias FG de las protenas Nup. Una
vez en el ncleo Ran cambia su unin a GDP por GTP para inducir la liberacin de la importina
y su liberacin al citoplasma. Una vez que el t-DNA se encuentra en el ncleo, se integra en
dentro del genoma vegetal. La integracin no es al azar. Existen zonas de integracin
preferencial.
Cada clula vegetal infectada, incorpora de una a cuatro regiones de t-DNA de distintas
bacterias. El t-DNA se mantiene estable une vez integrado en el cromosoma vegetal.

III.APLICACIONES DEL PLSMIDO Ti

El plsmido Ti ha sido el principal impulsor de la ingeniera gentica en plantas. Gracias a su
emple se ha conseguido multitud de variedades transgnicas. Continuamente, se han realizado
modificaciones en el plsmido Ti con objeto de mejorar sus caractersticas como vector.

Habitualmente se aade uno o ms genes resistencia a antibiticos, y se elimina el T-DNA no

esencial, y los genes que codifican el desarrollo del tumor. Se mantienen genes necesarios para
la infeccin de la clula vegetal. Tambin se ha insertado el T-DNA en el plsmido pBR32 de
Escherichia coli y en otros plsmidos para producir vectores de clonacin capaces de
desplazarse entre bacterias y plantas. El gen o los genes de inters se empalman en el t-DNA
entre las repeticiones directas, mediante empleo de enzimas de restriccin y ligasas. A
continuacin, se introduce el plsmido en Agrobacterium tumefaciens, se seleccionan por
resistencia a antibiticos las bacterias que incorporan el plsmido, y se infectan con la bacteria
clulas en cultivo de la planta a transformar. La bacteria se elimina empleando una mezcla de
antibiticos y se seleccionan los transformantes en funcin de su resistencia a antibiticos o
herbicidas (u otro rasgo codificado por el t-DNA). Finalmente, se regeneran plantas completas a
partir de las clulas en cultivo, mediante la utilizacin de auxinas y citoquininas que estimulan
la produccin de callos y brote. El motivo de eliminar el t-DNA no necesario, es porque las
fitohormonas para las que codifica, pueden interferir en la regeneracin de plantas.
Otra tcnica consiste en emplear un sistema binario con dos plsmidos. Uno de los plsmido
porta las secuencias necesarias para la integracin al genoma se encuentran en los bordes del TDNA, pudiendo ser reemplazado el resto de la secuencia del T-DNA. El otro plsmido.
Denominado Helper, porta los genes de virulencia (vir) responsables de la transferencia del TDNA, actan en trans, por lo que no tienen que estar situados en el mismo plsmido que el TDNA, por lo que no es oncognico pero es capaz de transferir el T-DNA presente en otro
plsmido.
Un plsmido vector que contiene los bordes del T-DNA. Este plsmido es pequeo y de fcil
manipulacin en E. coli para el clonado de secuencias. No presenta los genes para la produccin
de fitohormonas ni opinas. Presenta sitios de restriccin mltiples dentro de los bordes del TDNA para el clonado de secuencias. Contiene tambin un marcador para la seleccin de las
clulas transformadas, como por ejemplo, resistencia a kanamicina, herbicida o marcador
metablico.
Independientemente de emplear uno o dos plsmidos, se suelen construir genes en tndem con
la informacin deseada, precedidos de un promotor. Fraley y col, en 1993, trabajando para
Monsanto, usaron como marcadores genes que otorgaban resistencias a determinadas sustancias.
Estos genes se introducan en el ADN-T, junto con los genes deseados para la planta
transgnica. As, podan ver cuales eran las clulas transformadas. Destacan los genes de
resistencia a kanamicina, carbenicilina y a higromicina. Las clulas vegetales que sobrevivan al
ataque de estas sustancias, eran en las que se confirmaba una transformacin.
Uno de los marcadores ms usados hoy en da, es el gen -glucuronidasa (GUS). Se extrae de
Escherichia coli. Dicho gen codifica para una enzima que, al degradar un galactsido, aporta
pigmentacin azul. Las clulas que experimenten el cambio de color, sern las transformadas.
Otro ejemplo de marcador que induce cambios de color, es la protena fluorescente verde. Se
obtiene de la medusa Aequorea victoria. Esta protena se codifica en presencia de oxgeno, lo
que hace bastante sencilla la identificacin de los vegetales transformados.
El uso de discos foliares se volvera un mtodo estandarizado. Fue diseado en 1985, por
Horsch, para la compaa Monsanto. Consiste en introducir discos de hojas de tabaco en un
cultivo con Agrobacterium tumefaciens en un medio LB (caldo Luria Bertoni). Se agita para
asegurar la infeccin. Despus los discos se colocan en medios de cultivo que sustancias que

estimulan la aparicin de brotes. Luego se exponen los discos a un medio selectivo, para
eliminar las plantas no transformadas.
De todos modos, no se puede afirmar al 100% que todas las plantas resistentes, han sido
transformadas. Cabe la posibilidad de que la planta ya fuese resistente per se al agente elegido
como marcador. Las pruebas genticas sern las encargadas de desvelar cuales de las plantas
resistentes son realmente transgnicas. Para confirmarlo, se emplean Southern, Northern y
Western. As se confirma que hay ADN, ARN y protena, producto de la insercin. El uso de
GUS como marcador, si garantiza que los discos que tornan su coloracin a azul, son realmente
transgnicas.

IV.PROMOTORES
Se encargan de asegurar la expresin del transgn. Se suelen extraer de virus, porque presentan
una capacidad de expresin, debida a la naturaleza infectiva. Los del virus del mosaico de la
coliflor son los ms usados, cabe destacar el promotor 35S, el cual es usado por Monsanto. Esto
permite al transgn ser transcrito con prioridad ante el genoma celular; puede expresarse hasta
1000 veces consecutivas. El promotor, tambin indica el lugar de incorporacin del gen en el
genoma vegetal. Toda la secuencia de ADN introducido se denomina casete de expresin, que se
constituye de: Gen deseado

Promotor
ADN-T
Gen marcador

El promotor provoca una situacin de estrs en la planta, ante el intento de sta para
contrarrestar el efecto que tiene sobre ella.
Los resultados han sido excelentes en dicotiledneas, pero en monocotiledneas, la infeccin no
es tan efectiva. Ello ha llevado a disear nuevos mtodos para integrar el t-DNA en las clulas
vegetales.
No obstante, la infeccin por Agrobacterium tumefaciens suele ser el mtodo ms eficaz,
adems de presentar patrones de herencia mendeliana y dar un alto porcentaje de plantas
regeneradas frtiles.

V. BIOLSTICA
Su nombre significa balstica biolgica. Consiste en un mtodo de transferencia directa, que es
llevado a cabo por el bombardeo de microproyectiles. Fue introducido por Sanford en 1987. Se
usan partculas pesadas, tales como oro o tungsteno, con dimetro de una micra, recubiertas de
ADN. Estas partculas se disparan haca las clulas vegetales.
En 1988, Klein us para acelerar partculas de tungsteno un mecanismo que funcionaba con
plvora. Pero acarreaba daos celulares severos por la toxicidad del tungsteno, por
contaminacin acstica y por el impacto mecnico. La tcnica ha sido perfeccionada por Russel,
usando partculas de oro y un acelerador a base de helio.
Las ventajas del uso de biolstica radican en:

Facilidad de uso
Alta velocidad. Hasta doce plsmidos integrados por disparo.
Los genes que recubren la partcula recuperan su actividad biolgica
Se puede aplicar a cualquier tejido de la planta
Es capaz de alcanzar capas de clulas profundas
Como problemas se pueden mencionar:
El porcentaje de xito no es total y se pueden requerir varios intentos.
Las partculas deben alcanzar clulas competentes, que por lo general son escasas, con
la excepcin de tejidos embrionarios.
En cereales es complicada su aplicacin.
Es frecuente el insertado de varias copias del transgn, lo que supone un inconveniente
a la trabajar con las plantas.
Muchas veces no se consigue una introduccin estable.
Otra aplicacin de esta tcnica es el producir daos mecnicos, disparando proyectiles
sin ADN, para luego usar Agrobacterium tumefaciens como vector de transmisin
gnica.

VI.

VECTORES VIRALES

Se ha usado como vector, el virus del mosaico de la coliflor, el virus del mosaico del tabaco y
otros virus ARN. Una tcnica denominada ragroinfeccin consiste en introducir ADN vrico en
el ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, para provocar una infeccin sistmica y obtener as
plantas transgnicas.

Como ventajas, se pueden citar:

Facilidad de infeccin.
Afecta a un mayor nmero de hospedadores que Agrobacterium tumefaciens.
Como desventajas, aparecen:
Desarrollo de la enfermedad, la cual puede llegar a ser letal.
Alto nmero de errores en la secuencia del gen introducido.
No se suele transmitir a la descendencia, ya que para la transformacin no es necesario
el engarzado del gen dentro del genoma de la planta.

VII.

TRANSFERENCIA DIRECTA

Se introduce el ADN en el protoplasto, hacindole precipitar con fosfato clcico, se realiza una
electroporacin o se elabora un tratamiento con polietilenglicol (PEG). Se usa cuando las dems
tcnicas no ofrecen resultados positivos. Para fusionar protoplastos se utiliza polietilenglicol.
Con esto se consiguen hbridos interespecficos.
Otro mtodo, es el de fusionar liposomas a la clula o tejido que se quiere transformar. Se
trabaja con Lipofectina, que es un compuesto comercial estable, a diferencia de los liposomas
naturales. Los liposomas descargan ADN al medio intracelular, con la ventaja de tener una
membrana que protege al ADN. Su eficacia aumenta al tratarlo con polietilenglicol o por
electroporacin. Los resultados no han sido los esperados.

VIII. MICROINYECCIN

Destaca por ser de las tcnicas ms precisas para incorporar ADN en compartimentos celulares.
Se realiza mediante dispositivos microcapilares en conjunto a microscopa, para introducir el
ADN sin causar daos.
Las ventajas a destacar son:

Se puede decidir la clula a transformar.

Control visual
Aplicable a pequeas estructuras (microsporas y zigotos).
Al introducirlo en el ncleo, no se expone a agresiones propias del citoplasma (como
degradacin por DNAasas).

Desventajas:

Es un proceso lento, en el que se tiene que aplicar el mtodo clula a clula.

Requiere mayor habilidad e instrumental ms complejo.

IX.

EXPRESIN

Las plantas que se transforman tendrn comnmente diferentes niveles de expresin. Un

fenmeno que no siempre se correlaciona con el nmero de copias. La expresin diferencial de
los transgenes ha sido atribuida a efectos posicionales, donde la posicin del sitio de integracin
del ADN-T en el genoma receptor afecta el nivel de expresin del transgn.
El ADN-T se puede integrar en el genoma receptor en patrones alternativos al de copia nica en
un nico sitio. Tambin pueden ocurrir mltiples copias o repeticiones invertidas y otros
patrones complejos. La presencia de insertos de ADN-T multimricos, especialmente estructuras
repetidas invertidas, se correlaciona fuertemente con el fenmeno de silenciamiento del
transgn.La expresin variable de los transgenes o el silenciamiento gnico es un fenmeno
ubicuo en las plantas transgnicas. El silenciamiento gnico puede ser el resultado de las
interacciones entre las mltiples copias del transgn y genes endgenos relacionados, y est
asociado con mecanismos basados en homologa de secuencia que actan tanto a nivel
transcripcional como post-transcripcional. El silenciamiento que es resultado del impedimento
de la iniciacin de la transcripcin est usualmente asociado a la metilacin de las citosinas o a
la condensacin de la cromatina, mientras que el silenciamiento post-transcripcional involucra
una incrementada degradacin del ARN en el citoplasma.
Adems, el ADN vegetal flanqueante y/o la localizacin cromosmica desfavorable ejercen, en
ocasiones, un efecto de silenciamiento sobre el transgn.