METODOLOGA

Las muestras a analizar son transportadas aspticamente hacia el laboratorio

para su posterior anlisis microbiolgico; seguidamente se registran y se rotula
el material a utilizar con el cdigo correspondiente a cada de las muestra por
analizar (colocando fecha, cdigo interno y dilucin segn el caso).

El material utilizado para el anlisis ha sido esterilizado con anterioridad al

procesamiento o anlisis de las muestras; as mismo se han preparado los
caldos y medio de cultivo de acuerdo con las indicaciones de su
correspondiente casa comercial.

DETERMINACIN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS

Determinar el nmero de clulas viables o de UFC (unidades formadoras de
colonias) en un producto. Incluye todos los gneros aerobios y facultativos que
crecen en medios simples a una temperatura entre 20C y 45 C. Su presencia
indica el grado de contaminacin de los alimentos en cualquier etapa del
proceso de produccin y permite obtener informacin sobre la alteracin
incipiente de los alimentos y su probable vida til.
Aplica a materia prima (leche cruda, termizada, pasteurizada) leche
condensada, insumos, material de empaque
Procedimiento: Preparar las diluciones necesarias a partir de la primera
dilucin, teniendo en cuenta que cada dilucin sucesiva disminuir 10 veces la
concentracin.

1. Transferir una alcuota de 1ml de las diluciones en cajas de petri

estriles, debidamente rotuladas.
2. Verter en las cajas de 12 a 15 ml de agar plate count fundido y
atemperado a 45C.
3. Mezclar el inculo con el medio de cultivo, con movimientos de vaivn
(mover la caja hacia arriba y hacia abajo 5 veces, rotar la caja cinco
veces en el sentido de las agujas del reloj, rotar la caja cinco veces en el
sentido contrario de las agujas del reloj).
4. Realiza control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja
que contenga agar plate count, y control de esterilidad del agua
peptonada 0.1% incubando una caja con 1 ml de agua peptonada y agar
plate count.
5. Incubar las cajas invertidas a 35 +/-2C, una vez solidificado el medio
durante 24 a 48 horas.
6. Pasado el tiempo correspondiente hacer la lectura e interpretacin de
resultados.
Rango de medicin: 30 a 300 UFC/ gr/ml.

DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES

Determina la presencia de Coliformes Totales presentes en el alimento por
malas condiciones de manipulacin o deficiencias en los procedimientos de
limpieza y desinfeccin.
Aplica a todos los productos fabricados en FRESKALECHE S.A. y a las
materias primas de los mismos (Insumos, material de empaque) y personal
manipulador.

Protocolo:
1. Preparar la dilucin, y transferir 1 ml a una caja de petri.
2. Agregar de 12 a 15 ml del medio V.R.B.A, fundido y mantenido a una
temperatura de 45 a 50C a las cajas de petri con las diluciones de la
muestra.
3. Mezclar agitando el inoculo suavemente y en diferentes direcciones,
dejando solidificar el medio.
4. Realizar control de esterilidad del medio de cultivo y del agua peptonada.
5. Una vez solidificado el medio, invertir las placas e incubar a 37C+/-2C,
durante 18 a 24 horas transcurrido este tiempo hacer recuento del nmero
de colonias y registrar resultados.

Rango de medicin
15 a 150 UFC/ml.gr.

DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES POR NMP (nmero ms

probable)
Determinar la presencia de Coliformes Totales presentes en el alimento por
malas condiciones de manipulacin o deficiencias en los procedimientos de
limpieza y desinfeccin.
Aplica a producto terminado (quesos, leche en polvo)

Protocolo:
1. Preparar las muestras y las diluciones tal como se ha indicado; hasta
obtener las correspondientes a 10-1, 10-2 ,10-3.
2. Pipetear 1 ml de cada una de las diluciones del homogenizado en tubos
que contengan 10 ml de caldo fluorocult, utilizando tres tubos por cada
dilucin.
3. Agitar suavemente los tubos e incubar a 37C por 24 horas.
4. Pasadas las 24 horas, anotar los tubos que muestren produccin de
color azul.
5. Para obtener el NMP, se procede de la siguiente manera:
Ver en cada una de las tres diluciones seleccionadas el nmero de tubos en
los que apareci el color azul.
Buscar en la tabla del NMP y anotar los resultados correspondientes al
nmero de tubos positivos de cada dilucin.
El valor encontrado en la tabla es el resultado correspondiente, que se
expresa como NMP de Coliformes /g o ml.

DETERMINACIN DE MOHOS Y LEVADURAS

Se determina la presencia de mohos y levaduras, que pueden crecer en los
productos lcteos en condiciones desfavorables para el crecimiento bacteriano:
pH bajo, alto contenido de sales y azcares, bajo contenido de humedad y baja
temperatura de almacenamiento afectando su inocuidad.
Aplica a insumos, material de empaque, producto terminado
arequipe, leche en polvo ) y personal manipulador,

(quesos,

Protocolo
1. Transferir 1 ml de cada dilucin a cajas de petri estriles debidamente
marcadas con su cdigo correspondiente.
2. Agregar 12 a 15 ml de agar YGC, fundido y mantenido a una
temperatura de 45 a 50C a las cajas de petri con las diluciones de las
muestras.
3. Mezclar agitando el inoculo suavemente y en diferentes direcciones,
dejando solidificar el medio.
4. Realizar control de esterilidad del medio, y del agua peptonada 0.1%.
5. Solidificado el medio, invertir las placas e incubarlas a 22C+/-2C,
durante 5 a 7 das.
6. Realizar recuento microbiolgico e interpretacin de resultados.
Rango de medicin:
20 y 100 colonias

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE LAS CEPAS SELECCIONADAS

Ya obtenidos los resultados correspondientes seleccionbamos segn la

persistencia de esta en las diferentes muestras o aquellas que por sus
caractersticas macroscpicas tenan relevancia para la investigacin del
laboratorio.

Se toma una colonia y se repica por agotamiento en el medio segn donde la

hallamos obtenido (SPC, VRB, YGC) seguidamente se incuba por 24 horas;
transcurrido ese tiempo se realiza tincin de gran y observamos al microscopio.
Si se observan colonias puras realizamos la identificacin correspondiente
utilizando el BBL Crystal (Gram positivo o Gram negativo segn el resultado de
la tincin).
Si aun no se observan cultivos puros repetimos la siembra por agotamiento
hasta obtener un cultivo puro.
Para el asilamiento de las cepas fungicas repicamos en otra caja de YGC e
incubamos pro 7 das a una temperatura de 25- 28C hasta obtener cepas
totalmente aisladas.

Identificacin de la microbiota utilizando la tcnica del BBL Crystal

Se toma una o dos colinas del microorganismos a identificar y se adiciona en la

solucin buffer propia del cristal agitamos en el vortes y la servimos en los
paneles correspondientes e incubamos por 24 horas, transcurrido ese tiempo
se realiza la lectura correspondiente y se introducen los datos surgidos al
software de identificacin y este nos arroja el resultado obtenido.
Identificacin de la microbiota fngica
Ya aisladas las cepas fungicas se identifican por su morfologa macroscpica y
microscpica y se comparan los resultados con la bibliografa correspondiente.

MATERIALES

MATERIAL BIOLOGICO:
o MUESTRAS A ANALIZAR
o CEPAS SELECCIOANDAS

MEDIOS DE CULTIVO:
o YGC
o SPC
o VRB
o AGUA PEPTONADA
o CALDO FLUOROCULT
o CALDO BHI
o GLICEROL

EQUIPO Y UTENCILIOS:
o INCUBADORAS
o CABA
o GRADILLAS
o ASAS
o TUBOS DE ENSAYO
o CAJAS DEPETRI
o CINTA DE ENMASCARAR
o PAPEL VINIPEL
o MECHERO
o GUANTES