TCNICAS DE IMAGEN EN BIOLOGA

TCNICAS DE IMAGEN EN BIOLOGA

Juan Luis Martnez (Ed.)

N. Anadn, A.M. Coto, J.M. Fraga, A. Gonzlez,

J.L. Martnez, A.M. Nistal, D. Tolivia

Vicerrectorado de Postgrado y Ttulos Propios. Universidad de Oviedo

Fotografa de cubierta: Lbulos ceflicos de Gyrodactylus sp. (Platyhelminthes:

Monogena), parsito de trucha.

Maquetacin: Delio Tolivia Cadrecha

ISBN
2002

AUTORES
Nuria Anadn Alvarez. Departamento de Biologa de Organismos y Sistemas.
Universidad de Oviedo.
Ana Mara Coto Montes. Departamento de Morfologa y Biologa Celular.
Universidad de Oviedo.
Ada Gonzlez Daz. Departamento de Biologa de Organismos y Sistemas.
Universidad de Oviedo.
Juan Luis Martnez Alvarez. Departamento de Biologa de Organismos y Sistemas.
Universidad de Oviedo.
Jorge Martnez Fraga. Departamento de Morfologa y Biologa Celular. Universidad
de Oviedo.
Angel Martnez Nistal. Servicio de Proceso de Imgenes y Tecnologas Multimedia.
Universidad de Oviedo.
Delio Tolivia Fernndez. Departamento de Morfologa y Biologa Celular.
Universidad de Oviedo.

PREFACIO
En Biologa, la forma es la funcin. Una de las caractersticas de
los organismos vivos es la capacidad de transformar la informacin en
los distintos niveles de organizacin. La informacin gentica, contenida
en la secuencia de nucletidos del ADN en forma lineal, se traduce en
una informacin tridimensional cuando la correspondiente cadena de
aminocidos adquiere su conformacin espacial, la cual, a su vez, da
lugar a una capacidad funcional especfica. La diferenciacin celular
comporta, simultaneamente, el desarrollo de unas caractersticas
estructurales, morfolgicas, y la adquisicin de una posibilidad
funcional determinada. As pues, en el caso de la materia viva, forma y
funcin son dos conceptos interrelacionados ntimamente. Cuando
estudiamos la forma de una estructura viva no lo hacemos por motivos
meramente estticos ni por simple ansia de conocimiento abstracto; lo
hacemos porque a partir del conocimiento morfolgico podemos entender
mejor cmo funciona esa estructura y, en definitiva, avanzar en su
comprensin global. El conocimiento de la forma implica, de una u otra
manera, la obtencin de una imagen que, dada la escala de los elementos
estructurales bsicos de la materia viva, en la mayora de los casos debe
ser obtenida por mtodos de microscopa. Desde Leeuwenhoek, en el
siglo XVII, el desarrollo de la ciencias biolgicas y el desarrollo de las
tcnicas que permiten la obtencin de imgenes han ido estrechamente
ligados. As fueron desarrollndose los distintos tipos de microscopa
ptica, la microscopa electrnica, la microscopa lser confocal... Por
otra parte, las tcnicas han incorporado la posibilidad de visualizar no
slo la forma, sino tambin la composicin qumica (histoqumica,
citoqumica...)
y,
en
cierta
manera,
la
propia
funcin
(inmunohistoqumica...). A finales del siglo XX, a los mtodos de
obtencin de imgenes se han sumado las tcnicas informticas que
permiten su almacenamiento, tratamiento y anlisis, aumentando
espectacularmente las posibilidades de la imagen como herramienta del
conocimiento. Adems, la imagen digital puede ser analizada
cuantitativamente, y la cuantificacin de los diversos parmetros de la
imagen y, por tanto, de los diversos componentes de la materia vivaincrementa notablemente las posibilidades de su estudio cientfico.
En este libro hemos tratado de reunir los aspectos bsicos de esos
dos mundos implicados actualmente en el estudio morfolgico de los
organismos vivos: el de la microscopa y el de la informtica aplicada al
anlisis de imgenes. No se trata en ningn caso de un texto en el que se
recopilen exhaustivamente protocolos concretos de las distintas tcnicas
(para eso deber recurrirse a la bibliografa citada en cada captulo); se
trata ms bien de ofrecer una informacin acerca de cules son las
principales tcnicas existentes hoy en da, qu posibilidades ofrece su

aplicacin en el campo de la biologa, y qu caractersticas debe tener la

muestra biolgica para poder ser estudiada con cada una de estas
tcnicas.
Aunque originalmente fue concebido como documentacin para el
Programa de Doctorado del Departamento de Biologa de Organismos y
Sistemas de la Universidad de Oviedo, este texto puede contribuir a
ayudar a todos aquellos estudiantes, tanto de Pregrado como de
Postgrado, que busquen informacin bsica sobre las posibilidades que
ofrece el mundo de la imagen en los estudios biolgicos, o que requieran
una orientacin preliminar sobre las tcnicas que, eventualmente,
podran ser de inters para su campo de investigacin concreto.
Juan Luis Martnez

NDICE

I.

MICROSCOPA FOTNICA.
1.- Conceptos previos
2.- Construccin de imgenes
3.- Imgenes reales y virtuales
4.- Campo de imgenes reales y virtuales
5.- Tamao de las imgenes reales
6.- Aumento visual
7.- Microscopio fotnico
7.1.- Los objetivos
7.2.- Los oculares
7.3.- El condensador
8.- Camino ptico
9.- Interferencias
10.- Difraccin e interferencia
10.1.- Discos de Airy
10.2.- Criterio de Lord Rayleigh
11.- Poder de resolucin
12.- Aumento y resolucin
13.- Poder de resolucin del microscopio
14.- Estimacin del aumento til
15.- Significado de la inmersin
16.- Control de la iluminacin
16.1.- Iluminacin de Khler
17.- Microscopa fotnica especial
17.1.- Microscopio de campo oscuro
17.2.- Microscopio de luz ultravioleta
17.3.- Microscopio de fluorescencia
17.4.- Microscopio de polarizacin
17.5.- Microscopio de contraste de fases
17.6.- Microscopios interferenciales

II.

TCNICAS HISTOLGICAS GENERALES.

1.- Preparacin del material
1.1.- Exmen de material vivo
1.2.- Narcotizacin
2.- Fijacin
2.1.- Cualidades que deben tener los fijadores
2.2.- Lquidos fijadores generales
2.3.- Frmulas para fijadores
2.3.1.- Bouin
2.3.2.- Formaldehdo al 4% en agua de mar
3.- Confeccin de preparaciones de animales in toto

3.1.- Frmulas para coloracin en bloque

3.1.1.- Carmn borcico
3.1.2.- Carmn ltico
3.2.- Montaje in toto
4.- Tcnicas de inclusin
4.1.- Inclusin en parafina
4.1.1.- Procedimiento de deshidratacin
4.1.2.- Impregnacin con parafina
4.1.3.- Mtodo de Celoidina-Parafina de Peterfi
4.1.4.- Inclusin en parafina dura y orientacin de las piezas
5.- Tallado de los bloques y realizacin de los cortes
5.1.- Extensin de los cortes
5.2.- Paso de los cortes al portaobjetos y pegado de los mismos
6.- Preparacin de cortes por congelacin
7.- Tincin de los cortes incluidos en parafina
7.1.- Desparafinado
7.2.- Hidratacin con agua
7.3.- Tincin
8.- Montaje de las preparaciones
9.- Cmo medir objetos microscpicos

III.

HISTOQUMICA, AUTORRADIOGRAFA Y CRIOMTODOS.

1.- Citoqumica y histoqumica
1.1.- Introduccin
1.2.- Conservacin de la muestra
1.3.- Tinciones
2.- Autorradiografa
2.1.- Introduccin
2.2.- Radioistopos
2.3.- Dosis de compuestos radiactivos
2.4.- Administracin del compuesto radiactivo
2.5.- Deteccin del radioistopo: emulsiones nucleares
2.6.- Mtodos en autorradiografa para MET
2.6.1.- Mtodo con rejilla
2.6.1.1.- Ultramicrotoma y montaje de las secciones
2.6.1.2.- Recubrimiento de las secciones con la emulsin
2.6.1.3.- Exposicin
2.6.1.4.- Revelado
2.6.2.- Mtodo sobre sustrato plano
2.6.2.1.- Ultramicrotoma y montaje de las secciones
2.6.2.2.- Recubrimiento de las secciones con la emulsin
2.6.2.2.a.- Tcnica dipping
2.6.2.2.b.- Tcnica del loop
2.6.2.3.- Revelado y exposicin
2.6.2.4.- Transferencia de las secciones a rejillas

3.- Criomtodos
3.1.- Introduccin
3.2.- Criofijacin
3.3.- Crioprotectores
3.4.- Crioultramicrotoma
3.5.- Criosustitucin
3.6.- Crioinclusin
3.7.- Criofractura

IV.

INMUNOHISTOQUMICA E INMUNOCITOQUMICA.
1.- Introduccin
2.- Por qu elegir el mtodo de inmunohistoqumica?
3.- Preparacin del tejido
3.1- Fijacin
4.- El primer anticuerpo
4.1- Comprobacin del anticuerpo
4.2.- Almacenamiento y manipulacin del anticuerpo
5.- Eleccin del mtodo de inmunodeteccin
5.1.- Peroxidasa anti-peroxidasa (PAP) y fosfatasa alcalina (ALP)
5.2.- Complejo Avidina-Biotina y Estreptavidina-Biotina (complejos ABC)
5.3.- Eleccin del marcador
5.3.1.- Isotiocianato de fluorescena (FITC)
5.3.2.- Peroxidasa de rbano (Horseradish peroxidase) (HRP)
5.3.3.- Fosfatasa alcalina (ALP)
5.3.4.- Oro
6.- Eleccin del mtodo
6.1.-Protocolo
7.- Inmunomarcaje para microscopa electrnica: Inmunocitoqumica
7.1.- Aspectos prcticos
7.1.1.- Marcaje con Oro
7.1.2.- Marcaje con protena A-Oro
7.1.3.- Mtodo de avidina-biotina
7.2.- Fijacin
7.3.- Resinas
7.4.- Dilucin de los anticuerpos para inmunocitoqumica
7.5.- Eleccin del mtodo de inmunocitoqumica
7.5.1.- Protocolo 1
7.5.2.- Protocolo 2
7.6.- Doble marcaje con oro para inmunocitoqumica
7.7.- Prevencin de la unin inespecfica
8.- Controles
8.1.- Control de los reactivos
8.2.- Control del tejido
8.3.- Control del primer anticuerpo

V.

MICROSCOPA LSER CONFOCAL.

1.- Introduccin
2.- Bases instrumentales
3.- Ventajas de la microscopa confocal
4.- Prestaciones del sistema
5.- Proceso de imgenes y microscopa confocal
6.- Aplicaciones de la microscopa confocal
7.- Perspectivas futuras

VI.

MICROSCOPA ELECTRNICA DE TRANSMISIN Y DE BARRIDO.

1.- Microscopa electrnica
1.1.- Principios generales
1.2.- Formacin de la imagen en el Microscopio Electrnico de Transmisin
(TEM)
1.3.- Formacin de la imagen en el Microscopio Electrnico de Scanning
(SEM)
2.- Preparacin de muestras para TEM
2.1.- Fijacin
2.1.1.- Fijadores
2.1.2.- Concentracin, Temperatura
2.1.3.- Tampones
2.1.4.- Osmolaridad
2.1.5.- Composicin inica
2.1.6.- Tiempo
2.1.7.- Aplicacin del fijador
2.2.- Lavados
2.3.- Deshidratacin
2.4.- Inclusin
2.4.1.- Medios de inclusin
2.4.2.- Procedimiento
2.4.3.- Criterios de buena preservacin de la muestra
2.5.- Ultramicrotoma
2.5.1.- Cuchillas
2.5.2.- Tallado
2.5.3.- Ultramicrotomo
2.5.4.- Secciones semifinas
2.5.5.- Secciones ultrafinas
2.5.6.- Rejillas
2.6.- Tincin
3.- Preparacin de muestras para SEM
3.1.- Desecacin por punto crtico
3.2.- Metalizacin

VII.

ANLISIS DE IMAGENES.
1.- Introduccin
2.- Fundamentos del proceso digital de imgenes
3.- Equipamiento de anlisis de imgenes
3.1.- Dispositivos de captacin de imgenes
3.2.- Ordenador
3.3.- Impresoras
4.- Archivo de imgenes
5.- Proceso de imgenes
6.- Clasificacin de imgenes
7.- Cuantificacin