INTEGRANTES:

• AGUIRRE PABLO

• ALMEIDA ALEXANDRA

• CHICAIZA SANDRA

• CUICHÁN CRISTINA

• FLORES MIRYAN

• HUERTAS PATRICIA

9 no
SEMESTRE
 AISLAMIENTO, SELECCION Y PRESERVACION DE CEPAS FERMENTADORAS DE
PAJA DE TRIGO PARA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL

Resumen

El presente estudio se llevo a cabo con la finalidad de obtener cepas fermentadoras

productoras de etanol, presentes en la paja de trigo, el cual es un residuo no utilizado por
la industria, a través de un tratamiento que ofrece además de buenos rendimientos, un
producto libre de componentes tóxicos. El proceso se basa en la obtención de
microorganismos lignocelulolíticos fermentadores, capaces de degradar la pared celular
de la paja de trigo en la que se encuentra los componentes celulosa y lignina.
Investigaciones realizadas para obtener etanol a partir de la degradación de materia
lignocelulósica se han realizado en Ecuador por la Universidad Católica.

Los materiales lignocelulósicos a partir de la paja de trigo son un recurso relativamente

abundante y ubicado fuera de las cadenas alimenticias lo que los hace una materia prima
poco costosa para la fabricación de etanol industrial con un buen rendimiento y una
alternativa a la quema de rastrojos dejados después de las cosechas de cereales.

Palabras clave: Cepas fermentadoras, microorganismos lignocelulolíticos, paja de trigo.

INTRODUCCIÓN:

La celulosa es un polisacárido muy abundante en la naturaleza que en combinación con la

hemicelulosa y la lignina constituye la fracción lignocelulósica la cual se genera en
grandes cantidades durante las actividades agrícolas madereras y del procesamiento
industrial y artesanal de los alimentos. Estos residuos han sido objeto de muchas
investigaciones conducentes a su utilización como sustratos en los procesos
fermentativos, principalmente para la producción de combustibles y alimentos alternativos
que aminoren los problemas derivados de la crisis energética, la escasez de proteínas y la
contaminación ambiental.

Los procesos agrícolas comprenden el 54% de las emisiones de metano,

aproximadamente el 80% de las emisiones de óxido nitroso, y prácticamente todas las
emisiones de dióxido de carbono vinculadas a la utilización de la tierra; cerca de un tercio
del calentamiento de la atmósfera y el cambio climático obedece a la agricultura.

La producción mundial de trigo totaliza 567 millones de toneladas, en Ecuador en el 2008

se cosechó 629.601 toneladas, con un desecho aproximado de 1500 toneladas, siendo la
mayor parte paja de trigo.
La mayor producción de esta gramínea a nivel nacional se concentra en la provincia de
Pichincha y específicamente el 40% corresponde al cantón Rumiñahui en los sectores de
Rumipamba, Patichubamba y San Antonio.

Tabla 1. Parámetros de Biomasa del trigo en Ecuador en el año 2008

Rubro % Toneladas métricas
PAJA 67.30 1295.73
TRIGO CON CASCARA SECO Y LIMPIO 32.70 629.65
TOTAL BIOMASA 100 1925.38

La paja de trigo normalmente se deja en el campo, son arados, enterrados y se quema

después de las cosechas, lo que representa 1295.73 toneladas métricas de paja que
acrecientan las emisiones de dióxido de carbono a la atmosfera.

Los materiales lignocelulósicos a partir de la paja de trigo son un recurso relativamente

abundante y ubicado fuera de las cadenas alimenticias lo que los hace una materia prima
poco costosa para la fabricación de etanol industrial con un buen rendimiento y una
alternativa a la quema de rastrojos dejados después de las cosechas de cereales.

El etanol es una fuente de bioenergía que no produce emisiones de gas; la proporción de

emisiones de CO2 evitada a través del etanol constituye aproximadamente el 85% del
total de emisiones. Esta sustitución equivale a la retirada de la atmósfera de un
promedio de 2036010 toneladas de CO2 al año. Estados Unidos envía a la atmósfera
anualmente 5.739.3 millones de toneladas de CO21.

En el mundo se llevan a cabo estudios para desarrollar a gran escala la producción de

etanol a partir de biomasa lignocelulósica. Se considera que la denominada biomasa
lignocelulósica, que incluye residuos agrícolas, forestales, así como residuos
agroindustriales, comprende aproximadamente el 50% de la biomasa en el mundo, la
misma que puede ser procesada de diferentes formas para la obtención de una gran
variedad de productos además del EtOH, el metanol, hidrógeno y electricidad.

El objetivo de este trabajo fue aislar, seleccionar y preservar cepas fermentadoras del
suela a partir de la paja que se encuentra en varios puntos de Rumipamba, Patichubamba
y San Antonio, cantón Rumiñahui, provincia de Pichincha; para la posterior producción de
bioetanol.

MARCO TEORICO:

El etanol se produce típicamente a partir de melazas de caña de azúcar y almidón de

granos y cereales, o a partir de la celulosa; que es el componente principal de las paredes
de célula de las plantas y el compuesto orgánico más abundante en la tierra. La
1
http://www.ecologiaverde.com/emisiones-de-co2-en-todo-el-mundo-paises
http://www.scribd.com/doc/6389405/Produccion-de-BioEtanol
fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado por las levaduras,
básicamente (Tabla 2).

Tabla 2. Principales microorganismos productores de etanol.

Bacterias Levaduras
Zymomonas mobilis. Saccharomyces cerevisiae.
Clostridium acetobutylicum Pichia stipitis
Klebsiella oxytoca Pachysolen tannophilus
Escherichia coli Candida shehatae

Entre los constituyentes estructurales de la paja de trigo (Tabla 4) se encuentra la lignina

que no contiene azúcares, pero encierra a la celulosa y hemicelulosa que sí los contienen.

Tabla 3. Composición de la paja de trigo.

Componente % en peso
Celulosa 53.5
Lignina 21.0
Hemicelulosa 7.5
Agua 10.0
Cenizas 8.0

Los materiales lignocelulósicos ofrecen un mayor potencial para la producción de

bioetanol, por lo cual el uso de residuos de procesos agrícolas, forestales o industriales,
con alto contenido en biomasa como la paja o cáscara de cereales es cada vez más
frecuente.

Degradación de la celulosa

La celulosa, al igual que otros compuestos de alto peso molecular, no puede ser tomada
directamente por la célula, sino que tiene que ser hidrolizada fuera de la célula por
despolimerasas que son segregadas en forma de exoenzimas.

Entre las bacterias que son capaces de degradar la celulosa destacan algunas especies
de los géneros: Clostridium, Streptomyces, Thermomonospora y Thermobifida. En el caso
de los clostridios, hidrolizan la celulasa en condiciones anaeróbicas; en tanto que las
especies de Streptomyces, Thermomonospora y Thermobifida la degradan en un
ambiente aeróbico.

METABOLISMO DE LOS MICROORGANISMOS CELULÍTICOS

Los microorganismos capaces de degradar celulosa secretan un sistema complejo de

enzimas extracelulares, celulasas y xilanasas, que actúan sinergísticamente en la
degradación de celulosa y hemicelulosa.
 MICROORGANISMOS QUE DIGIEREN CELULOSA

DEGRADACIÓN DE LIGNINA

La degradación de lignina ocurre en presencia de oxígeno y glucosa. El sistema

enzimático contiene peroxidasas. La formación de peroxidasas es promovida por la
limitación de nitrógeno y la descomposición de la lignina.

La lignina en la madera confiere una protección física a la celulosa y hemicelulosa contra

el ataque enzimático. Los únicos organismos descritos con la capacidad de degradar y
mineralizar la lignina son un grupo de basidiomicetes.

MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE LIGNINA

Entre los degradadores de lignina están los microorganismos que causan la podredumbre
parda que degradan celulosa y hemicelulosas dejando la lignina como residuo y los que
provocan la podredumbre blanca que degradan lignina. Entre estos últimos se encuentran
Stereum, Phanerochaete, Pleurotus, Ganoderma, Polyporus, Xylaria.

Grupo Trófico:

• Fuente de Energía: química (quimiotrofo)

• Fuente de electrones: compuestos orgánicos (organotrofo)
• Fuente de Carbono: compuestos orgánicos (heterótrofo)
Cepas Quimioheterorganotrofas

Fórmula Maestra:
Hemicelulosa C5H10O5 + C6H12O6 + Otros azúcares
  →
pretratamiento

Xilosa Glucosa

endoglucanasas y
− glu cos idasa
(C6H10O5)2n
→ n C12H22O11
   
celobiohidrolasas a → 2n C6H12O6
Celulosa Celobiosa Glucosa
C6H12O6 + 2NH3 + O2 Cepas
→ 2C2H6O + CH1.79O0.5N0.2 + CO2 + 2H2O
fermentado ras

Par oxido reductor:
Donador de electrones: Glucosa
Aceptor de electrones: Oxígeno
MARCO METODOLÓGICO:
Identificación de la fuente
Fuente de Energía: Celulosa
Fuente de Carbono: Celulosa
Fuente de Nitrógeno: Extracto de
levadura y peptona

Muestreo
Las muestras (paja de trigo) se recolectan en varios puntos de los sectores de
Rumipamba, Patichubamba, Santo Domingo y San Antonio, cantón Rumiñahui, provincia
de Pichincha; obteniéndose 5 muestras patrones representativas, tomadas básicamente
en los cuatro extremos y en el centro de la zona de cultivo. Se recogen las pajas y se
conservan en fundas estériles.

Para la caracterización de las muestras se realiza análisis de cenizas y humedad,

celulosa y lignina. Las determinaciones se realizaron en base a los métodos establecidos
por la AOAC, excepto las de celulosa, lignina las cuales no se realizaron porque
recurrimos a citas bibliográficas en cuanto a la composición de la paja de trigo.

Preparación de las muestras

La paja es secada por 4 horas a 100 °C, posteriormente se pica manualmente y se
tamiza, se selecciona y conserva en fundas estériles.

Hidrólisis ácida
La paja es sometida a hidrólisis ácida mediante ebullición a reflujo a presión atmosférica,
empleando ácido sulfúrico al 2% p/p durante 4 horas en una relación ácido: paja 30:1.

El material hidrolizado se filtra y se ajusta el pH con hidróxido de sodio 1N. Consiguiendo

con esto la obtención de lignina, para su posterior utilización en el medio de cultivo.

Diseño de medio de cultivo (medio base)

 Medio de cultivo (Líquido):

INGREDIENTES CONCENTRACIÓN
Agua destilada 1 litro
K2HPO4 1g
KH2PO4 1g
NaNO3 3g
MgSO4.7H2O 0,2 g
FeSO4.7H2O 0,01g
CaCl2 0,01g
MnCl2.2H2O 0,002g
(NH4)MoO4.2H2O 0,001g
Peptona 4g
EDTA 0.2 g
Celulosa 7g
Lignina 3g
Extracto de levadura 3g
 • Medio de cultivo (Sólido)

INGREDIENTES CONCENTRACIÓN
Agua destilada 1 litro
K2HPO4 1g
KH2PO4 1g
NaNO3 3g
MgSO4.7H2O 0,2 g
FeSO4.7H2O 0,01g
CaCl2 0,01g
MnCl2.2H2O 0,002g
(NH4)MoO4.2H2O 0,001g
Peptona 2g
EDTA 0.2 g
Celulosa 10 g
Lignina 4g
Extracto de levadura 3g
Agar-Agar 20 g

Enriquecimiento
Se pesa 10 gramos de cada muestra y se deposita en 90ml de medio base (caldo CMC),
llevando las muestras al shaker orbital por un tiempo de 48 horas a 180 rpm y 37ºC.

Se obtienen 20 cepas, y posteriormente son inoculados en placas de agar

carboximelticelulosa (CMC).

Aislamiento, Selección e Identificación de los microorganismos

Luego del enriquecimiento se siembra en el medio base con agar por el método de
estriado, se incuba de 48 a 72 horas a 35ºC se evaluó su actividad sobre la celulosa, cabe
recalcar que de las 20 cajas, 10 contenían agar CMC y gentamicina garantizando el
crecimiento neto de levaduras e inhibiendo las bacterias, mientras que las otras 10 solo
contenían agar CMC permitiendo el crecimiento de las bacterias. De esta etapa se logró
clasificar levaduras y bacterias.

Las cepas se purifican por medio de repiques sucesivos; la selección se realiza mediante
la variación de los siguientes parámetros:

pH
Los microorganismos lignocelulósicos prefieren pH 6.5 y 8, el crecimiento se hace a pH de
6.5 - 8.5
Temperatura
La temperatura ideal para el crecimiento es de 21 a 37º C, las temperaturas que se
utilizan para la selección son: 30- 35º C.
Concentración de nutrientes
La celulosa en concentraciones de 10- 20 g/l, y la lignina en concentraciones de 4- 8 g/l.
La identificación de las cepas se realiza mediante tinción gram, morfología, y pruebas
bioquímicas.

Preservación de los microorganismos

Se utiliza la técnica de criopreservación mediante el uso de caldo infusión cerebro
corazón (BHI)+20% de glicerol, compuesto que actúa como crioprotector para evitar la
formación de cristales de hielo que puedan dañar las cepas.

Se preserva tres cepas (Bacillus, Pseudomona y Levadura).

RESULTADOS:

Selección de microorganismos:

De un total de 5 muestras se aislaron y purificaron 20 cepas celulolíticas de las cuales se

variaron tres parámetros: pH, temperatura y concentración de CMC.

Se seleccionaron 3 cepas celulolíticas como las más prominentes por presentar mayor
crecimiento en el medio mínimo con CMC.

Parámetros óptimos de crecimiento:

CMC: 10 g/l
pH: 7
Temperatura óptima: 35 OC

pH TEMPERATURA
pH CEPAS 30 OC
CEPAS
6.5 8.5 3 XX
1 --- ---
5 XXX
2 X ---
3 XX XXX
8 ---
4 12 XX
5 XXX XX 13 X
6 --- --- 15 XXX
7 --- X 18 XXX
8 XXX XXX 19 ---
9 --- --- 20 ---
10 X ---
11 --- ---
12 XXX XX
13 XXX XX
14 --- X
15 XXX XXX
16 --- ---
17 --- X
18 XXX XXX
19 XXX XXX
20 XXX XXX
 CONCENTRACIÓN CMC

CEPAS 20 g CMC/l
3 XXX
5 XXX
12 ---
15 ---
18 XXX
X = CRECIMIENTO BAJO
XX = CRECIMIENTO MEDIO
XXX = CRECIMIENTO ALTO
--- = AUSENCIA

ESCALA

Tabla 5. Resultados del análisis de Microorganismos Celulolíticos capaces de

degradar la Celulosa de la Paja de trigo para producir bioetanol

PRUEBAS BIOQUIMICAS
CEP CARACTERIST VOGES
TINCION CATALA OXIDA GENERO
A ICAS FISICAS O/F PROSKAU
GRAM SA SA
ER
Pequeñas con Bacilos Gram Pseudom
+ + + -
3 fluorescencia Negativos ona
5 Colonias grandes Gram Positivos
blanquecinos rugosas en forma de + + - Bacillus
bastón
Grandes, redondas, Nitratos
18 - Cándida
de color crema + +

DISCUCIONES

• Debido a que la degradación de la Celulosa de la paja de trigo transcurre en un

tiempo muy prolongado se utiliza carboximetilcelulosa (CMC) como fuente de
carbono, logrando acelerar el proceso de obtención de cepas fermentadoras
lignocelulolìticas; optimizando tiempo y recursos.

• De los parámetros tomados en cuenta para la selección, la temperatura es la más

difícil de controlar debido a los frecuentes apagones y la constante utilización de
las estufas por los alumnos haciendo crítico este factor.
 • El poco tiempo disponible no permitió que nuestro trabajo culmine, no se pudo
realizar la cinética de crecimiento, así como tampoco comprobar la degradación de
la paja de trigo ni verificar rendimientos.

RECOMENDACIONES

• Se recomienda realizar un tratamiento previo por medios químicos de la paja de

trigo para remover la mayor cantidad posible de material no celulósico, facilitando
así el ataque enzimático.

• La selección de cepas se las realizó a partir de cinco muestras de suelos

diferentes obteniendo 3 cepas, por lo que si se aumenta el número de muestras
existiría la probabilidad de encontrar cepas con mayor poder degradatorio de
celulosa y lignina.

• Evaluar las cepas seleccionadas en cultivos con otras fuentes de carbono,

variando las concentraciones, hasta hallar el sustrato más adecuado para cada
cepa así como la concentración requerida para lograr la mejor producción
enzimática.

• Emplear en el aislamiento de cepas degradadoras y fermentadoras el método de

acumulación de cultivo en sustratos ligniliticos pero con dos medios de cultivo en
forma paralela, con el fin de evaluar mejoras en los resultados.

• Optimizar las condiciones de cultivo de las cepas seleccionadas para la producción

de bioetanol evaluando otras fuentes nitrogenadas, variaciones de temperatura y
pH.

• Todo bioproceso debe ser diseñado, controlado y ejecutado tomando en cuenta el

tipo de materia orgánica con la que se trabaja, el tipo de flora activa, conocer muy
bien los requerimientos nutritivos específicos para permitir el crecimiento de la
flora activa, y por último crear las unidades experimentales.

CONCLUSIONES

• Se identificó el género al que pertenecen las cepas celulolíticas utilizadas durante

la ejecución del proyecto planteado y son las siguientes;

TIPO DE CEPA GENERO

Bacteria Pseudomona
Bacteria Bacillus
Levadura Cándida

• Las cepas que presentaron mayor capacidad para metabolizar celulosa y lignina
son las que crecieron a temperatura 35 OC, pH de 6.5, y una concentración de
celulosa de 20 g/l; estas cepas fueron aisladas de la paja de trigo proveniente del
sector de Santo Domingo.
 • El medio diseñado en base a los requerimientos nutricionales para
microorganismos quimioheteroorganotróficos fue efectivo, ya que se pudo a lo
largo de todo el bioproceso tener óptimos aislamientos y crecimientos.

• Se diseñó un bioproceso de acuerdo a los parámetros óptimos obtenidos tras la

experimentación los cuales deben ser considerados y controlados para que el
biorreactor actúe de forma eficiente en la degradación.

BIBLIOGRAFIA:
• http://redalyc.uaemex.mx/pdf/304/30400802.pdf

• http://www.fuhem.es/media/ecosocial/File/Boletin%20ECOS/Boletin%201/dossier
%20agro%20combustibles/Art.Sastre%20et%20al._def.pdf

• http://www.bibliodigital.udec.cl/sdx/UDEC2/tesis/2006/maturana_c/doc/maturana_c
.pdf

• http://www.inaut.unsj.edu.ar/Files/1815_08.pdf

• www.creas.bligoo.com/.../Publicaciones_cientificas.html

• www.plataformasinc.es/.../Los-expertos-estiman-en-500-las-revistas-cientificas-
espanolas-de-calidad -

• Proyecto de Biotecnología realizado por Guanoquiza Galo y Oña Nathalia.

• http://www.scribd.com/doc/6389405/Produccion-de-BioEtanol

• http://www.ecologiaverde.com/emisiones-de-co2-en-todo-el-mundo-paises

ANEXOS:

Enriquecimiento de las cepas

Aislamiento de las cepas

Cepas puras

Selección de las cepas

Pruebas Bioquímicas

Preservación de las cepas