Universidad Central De Venezuela

Facultad de Ciencias
Escuela de Qumica
Laboratorio Fusionado de Fisicoqumica






Practica N 7:
Estudio de las velocidades de reacciones qumicas catalizadas
por la enzima catalasa proponiendo un mecanismo cintico tipo
Michaelis-Menten.





Profesor: Alumnos:
Vincent Piscitelli Norge Viloria, CI: 20.520.037
Antonio Gonzlez, CI: 18.590.830

Fecha: 22 de Julio de 2014
Resumen:

La cintica de Michaelis-Menten describe la velocidad de reaccin de
muchas reacciones enzimticas. Este modelo slo es vlido cuando la
concentracin del sustrato es mayor que la concentracin de la enzima, y
para condiciones de estado estacionario, es decir, cuando la concentracin
del complejo enzima-sustrato es constante.
Para determinar la velocidad mxima de una reaccin enzimtica, la
concentracin de sustrato ([S]) se aumenta hasta alcanzar una velocidad
constante de formacin de producto. Esa es la velocidad mxima (V
mx
) de
la enzima. En ese caso, los sitios activos de la enzima estn saturados con
sustrato.
La velocidad V indica el nmero de
molculas del sustrato que se
convierten en producto por segundo. A
medida que aumentamos [S], la
enzima va acercndose
asintticamente a su velocidad
mxima V
mx
, pero nunca la alcanza.
Por esta razn, no hay un valor de [S]
determinado para la V
mx
.

Diagrama de velocidad de reaccin
y constante de Michaelis-Menten.
Las enzimas pueden caracterizarse mediante la concentracin de
sustrato a la cual la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad
mxima. Esta concentracin de sustrato se conoce como constante de
Michaelis-Menten (K
m
).
Para enzimas que exhiben una cintica de Michaelis-Menten simple
esta constante representa la constante de disociacin del complejo enzima-
sustrato [ES]. Valores bajos indican que el complejo ES est unido muy
fuertemente y raramente se disocia sin que el sustrato reaccione para dar
producto.
Sabiendo que la ecuacin de Michaelis-Menten es:

En donde la V
mx
= K
3
[E]
o
cuando [S]
0
K
m

Se puede reordenar esta expresin en una forma ms adecuada para
el anlisis de los datos por regresin lineal:
Deducindose que:

La cual corresponde a la ecuacin de Lineweaver-Burk, que
representa a una recta de

en funcin de

; donde de la pendiente es

, la interseccin con el eje y es

y la interseccin con el eje x es

y el valor de K
3
puede calcularse a partir de la ecuacin V = V
mx
= K
3
[E]
0
conociendo que

la concentracin inicial de la enzima ([E]
0
) se obtiene
del punto de corte con el eje y de la ecuacin de la recta de Lineweaver-
Burk:

Pudiendo conocerse de esta forma las constantes de formacin
involucradas en la reaccin de una enzima tipo Michaelis-Menten con un
sustrato para formar sus productos.
Introduccin:
Las enzimas constituyen la clase de molculas proteicas ms
numerosas y especializadas. Son los instrumentos primarios para expresar
la accin de los genes, ya que catalizan los millares de reacciones
qumicas, que colectivamente constituyen el metabolismo intermediario de
las clulas.
La cintica de las reacciones catalizadas enzimticamente sigue los
principios generales de la cintica de las reacciones qumicas, solo que
distinguindose por el llamado fenmeno de saturacin.
La catalasa es una de estas enzimas que tienen un gran valor
biolgico, el cual es un efecto que presentan todas las enzimas. Al igual que
en las reacciones qumicas existe una disminucin de la energa de
activacin causada por un efecto catalizador, en este caso la enzima
acelera la reaccin enzimtica, unindose al sustrato y formando un
complejo intermediario que reacciona muy rpido, generando los productos
deseados.
El estudio de este tipo de reacciones es muy importante y muy comn
en el anlisis de los procesos biolgicos que influyen en diferentes
sistemas: el cuerpo humano, la fabricacin de alimentos, la estabilidad de
materias primas etc, de aqu que se empleen tcnicas sencillas que
mezclan mtodos volumtricos y relaciones estequiomtricas basadas en
los principios de la cintica enzimtica.
La cintica enzimtica de una reaccin catalizada por una enzima
como la catalasa sigue el proceso de reaccin:

A partir de la cual se obtiene la expresin: V =

que es la
ecuacin de Michaelis Menten una relacin directa entre la velocidad de
reaccin frente a la concentracin del sustrato y la constantes cinticas
relacionadas con la constante de Michaelis de acuerdo a K
m
=

.
Procedimiento Experimental:

Se utilizaron las siguientes disoluciones:

S: agua oxigenada de 10 volmenes ([H
2
O
2
] 1.2348 M).
E: 2.0 cm
3
de sangre/2 litros de agua destilada.
H: 1.0 molar en H
2
SO
4
.
P: 0.10 molar en KMnO
4
.

Una muestra de solucin S se acidifica con 25 cm
3
de H y se titula con
P (por duplicado).
Se debieron hacer 4 series de corridas (e, s, t y h) en las que
sucesivamente se variaran la concentracin de enzima, la concentracin de
sustrato, la temperatura y el pH. Pero por cuestiones de tiempo solo se
pudieron hacer las dos primera corridas, la primera variando la
concentracin de la enzima y la segunda variando la concentracin del
sustrato (e y s, respectivamente).

Para todas las corridas se us el siguiente procedimiento:

1) La solucin S se diluy con el volumen adecuado de agua y se
termostatiz.
2) Se le agreg la solucin E.
3) A los cinco minutos (exactos) se agregaron 25 cm
3
de solucin H,
para detener la reaccin y proveer los H
+
necesarios para la titulacin.
4) Se titul con la solucin P.

En las series e y s se hacen 2 determinaciones para cada corrida (indicadas
como b y c). La determinacin b es un blanco en el que los pasos 2 y 3 se
invirtieron, de manera que no haya reaccin. La determinacin c se hizo
segn el procedimiento indicado arriba.
Las series se llevaron a cabo en las siguientes condiciones:
Serie e (V
s
= 5 cm
3
, Temp. = ambiente, pH = 7 )

CORRIDA e1(b/c) e2(b/c) e3(b/c) e4(b/c) e5(b/c) e6(b/c)
V
H2O
(cm
3
)
18 15 12 8 4 0
V
E
(cm
3
)
2 5 8 12 16 20

Serie s (V
E
= x cm
3
, temp. = ambiente, pH = 7 )

CORRIDA s1(b/c) s2(b/c) s3(b/c) s4(b/c) s5(b/c) s6(b/c)
V
H2O
(cm
3
)
22-x 21-x 20-x 18-x 15-x 10-x
V
s
(cm
3
)
3 4 5 7 10 15








Resultados y Discusiones:

1- De la serie e, se obtuvieron los siguientes resultados (sealados
en rojo):

Tabla 1. Variacin de la concentracin de la enzima
CORRIDA e1(b/c) e2(b/c) e3(b/c) e4(b/c) e5(b/c) e6(b/c)
V
H2O
(cm
3
)
18 15 12 8 4 0
V
E
(cm
3
)
2 5 8 12 16 20
V
pc
(cm
3
)
14.3 12.7 10.0 8.2 6.0 4.7
V
pb
(cm
3
)
14.8 14.4 14.4 14.5 14.1 14.6
V
p
(cm
3
)
0.5 1.7 4.4 6.3 8,1 9.9

La finalidad de esta tabla es describir el comportamiento de la enzima
en funcin de la cantidad de sustrato en el medio, debindose observar que
al aumentar la cantidad de V
E
la actividad enzimtica debera llegar a un
valor mximo (V
p
= Constante).

Con los datos proporcionados en la tabla 1, fue posible construir la
grfica V
E
vs V
p
y obtener el volumen de enzima ptimo [X(mL)] que se usara
para la siguiente corrida.



Grfica V
E
vs V
p


A pesar de tener una variacin muy inclinada cerca de los volmenes
finales de V
E
, la grfica mostr que Vp y V
E
son proporcionales, entre 5 y
9 mL de V
E
, por lo que se pudo hacer una aproximacin de un volumen de
7 mL para utilizar en las siguientes corridas. Las reacciones catalizadas con
enzimas se distinguen de las no enzimticas por el fenmeno de saturacin
por el sustrato en el cual se observa el crecimiento proporcional de la curva
velocidad de reaccin respecto a bajas concentraciones del sustrato
(reaccin de orden 1) y una disminucin de dicha velocidad con el
aumento de la concentracin del sustrato (orden mixto) hasta un punto
donde la velocidad de reaccin se hace constante e independiente de la
concentracin del sustrato. El factor limitante en este caso es el grado de
concentracin de la enzima.
1






y = 0.4922x - 0.185
R = 0.9669
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25

V
p

(
m
L
)

VE (mL)
2- Grfica V
0
Vs [E]
0
:




Relacionando la pendiente de esta funcin con la cintica de la
reaccin pudimos obtener K
3
de la reaccin:

k
1
k
3

E + S ES E + P
k
2
K
3
= 401.1, a travs de pendiente= K
3
[S]
0
/ (K
m
+ [S]
0
,donde Km es
25M
(2)
,

este valor nos indica una reaccin bastante rpida entre el sustrato
y la enzima catalasa dado por la disminucin de la energa de activacin
necesaria para la reaccin.



y = 26.663x - 0.8985
R = 0.9873
0
5
10
15
20
25
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
V
0

(
m
o
l
/
m
i
n
.

d
m
3
)

[E]0 (cm3/dm3)
3- Grfica 1/V
0
vs 1/[S]
0




Utilizando la ecuacin de Lineweaver-Burk
(3)
/V
mx
=(K
m
/ V
mx
)(1/[S] ) +
1/V
mx

Se obtuvieron V
mx
=833,3 y Km=29,3. Comparando la constante de
michaelis terica: 25, con la experimental: 29,3, se pudo observar cierta
diferencia en sus valores atribuidos al tiempo inexacto de reaccin durante
la experimentacin (en algunos experimentos se dej un tiempo de reaccin
de entre 5 min 10 s 5 min 20 s). Para la velocidad mxima se obtuvo un
valor aceptable, pues la mayora de enzimas tienen ese valor basados en la
velocidad para el D- Aminocido
(4)

4- Obtencin de los valores de K
3
, a partir de K
m
y V
mx

Conociendo la ecuacin de la recta: y = 0.0012 + 0.0352x, podemos
interpretar que cuando X = 0 (1/[S]
o
= 0) la concentracin inicial de la
enzima es 0.0012. V= V
mx
= K
3
[E]
o
de manera que sabiendo que V
mx
=
833,3 y [E]
o
= 0.0012 entonces K
3
= 6.944x10
5
s
-1


y = 0.0352x + 0.0012
R = 0.9999 0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 2 4 6 8 10
1
/
V
0


1/[S]0
Conclusin:

A travs de la aplicacin del experimento pudimos comprobar que las
principales caractersticas de las reacciones catalizadas por enzimas como
la catalasa son las siguientes:

1- Para una concentracin inicial de sustrato determinada, [S]
0,
la
velocidad inicial de formacin de producto es proporcional a la
concentracin total de la enzima, [E]
0
.
2- Para una [E]
0
dada y valores bajos de [S]
0
, la velocidad de
formacin de producto es proporcional a [S]
0
.
3- Para [E]
0
dada y valores elevados de [S]
0
, la velocidad de formacin
de productos se hace independiente de [S]
0
y alcanza su velocidad mxima.

El comportamiento de la actividad enzimtica de la catalasa puede ser
descrito segn un mecanismo de Michaelis-Menten y observando la
variacin de su velocidad de reaccin en funcin de la concentracin del
sustrato, de la enzima, de la temperatura y del pH en el medio se pueden
conocer las condiciones ideales donde esta presenta un desenvolvimiento
ptimo, es decir las condiciones donde la enzima tiene un funcionamiento
correcto.

El estudio experimental de la actividad enzimtica de la catalasa y de
casi de cualquier enzima se realiza mediante el registro de la velocidad
inicial de la formacin de los productos en una solucin en la cual se halla
presente la enzima a una concentracin muy baja. Enzimas como la
catalasa son tan eficientes que se pueden observar aceleraciones
significativas aun cuando su concentracin es ms de tres rdenes de
magnitud menor que la del sustrato.

Finalmente, el experimento llevado a cabo en el laboratorio sirvi
adems para observar la forma como las enzimas son sensibles a
pequeos cambios fisicoqumicos en su entorno, de manera que alterar la
cantidad de sustrato, alterar la temperatura o el equilibrio acido-base del
medio donde encuentra una enzima puede significar detener su actividad
enzimtica y provocar la desnaturalizacin de la estructura que la compone,
rompiendo los enlaces inicos y puentes de hidrgeno primordiales para su
adecuado funcionamiento, siendo estos tpicos muy importantes en campos
como la biologa, la bioqumica, la farmacutica y la medicina, entre otros.














Bibliografa:

Lehninger, A. L. Bioqumica. Las bases moleculares de la estructura y
funcin celular. 2da Edicin. Ediciones Omega S.A. 1972
1
Paginas: 165-166
2
Pginas: 168 (Tabla 8-4)
3
Pginas: 169
4
Pginas: 169 (Tabla 8-5)