UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR
DISEO DE HERRAMIENTAS BIOQUMICAS
PARA LA INGENIERIA MOLECULAR DE DERIVADOS
INMOVILIZADOS DE RENINA Y fJ-GALACTOSIDASA
GUADALUPE PENZOLALONSO
1996
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR
DISEO DE HERRAMIENTAS BIOQUMICAS
PARA LAINGENIERA MOLECULAR DE DERIVADOS
INMOVILIZADOS DERENINA Y fJ-GALACTOSIDASA
MEMORIAque para optar
al grado de Doctor en Farmacia presenta
GUADALUPEPENZOLALONSO
Director:
Dr. Jos Manuel Guisn Seijas
Departamento de Biocatlisis
LC.P. - C.S.I.C.
Tutor:
Dr. Angel Jimnez Solves
Departamento de Bioqumica
Facultad de Farmacia- U.C.M
INSTITUTO DE CATALISIS Y PETROLEOQUMICA
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTFICAS
MADRID-1996
~ 1 ~
INDICE
INDICE
ABREVIATURAS
PRODUCTOS COMERCIALES
INTRODUCCION GENERA 1
1. INTERES INDUSTRIALPOR LA UTILIZACION DE ENZIMAS 2
1.1. INMOVILIZACION DE ENZIMAS 2
1.1.1. INMOVILIZACIONDE ENZIMAS POR UNION COVALENTEASOPORTES
SOLIDOS PREEXISTENTES 6
> Inmovilizacin covalente de enzimas sobre soporte glioxfl-agarosa 6
1.2. UTILIZACION DE ENZIMAS EN INDUSTRIA LACTEA 8
OETIVOS GENERALES 12
CAPITULO 1:
Inmovilizacin de enzimas que actan sobre substratos macromoleculares:
Inmovilizacin de renina de Mucor miehei para la hidrlisis de casena s
INTRODUCCION 16
1. INMOVILIZACIONDE PROTEINAS/ENZIMAS QUE AC~UANSOBRE
LIGANDOS/SUBSTRATOS MACROMOLECULARES 16
2. RENINA, ENZIMA-MODELO PARA EL DESARROLLO DE TECNICAS DE
INMOVILIZACIONDE ENZIMAS QUEACTUAN SOBRE SUBSTRATOS
MACROMOLECULARES 24
2.1. COAGULACIONDE LA LECHE: ESTABILIDAD MICELAR, MECANISMOS DE
LA COAGULACION Y ENZIMAS COAGULANTES 24
2.2. UTILIZACION DE DERIVADOS INMOVILIZADOS DERENINA 2 ?
2.3. RENINA DE Mucor miehei 29
1
3 . 1
INDICE
METODOS 30
1. ACTIVACION DE LOS SOPORTES 30
1.1. DISTINTAS AYCTIVACIONES DEL SOPORTEDE AGAROSA 30
1.1.1. PREPARACION DEL SOPORTEGLIOXIL-AGAROSA 30
112. PREPARACIONDEL SOPORTEMANA-AGAROSA 30
1.1.3. PREPARACION DELSOPORTE GLUTARALDEHIDO-AGAROSA 31
1.1.4. PREPARACION DE SOPORTES BDE-AGAROSA 31
1.1.5. PREPARACIONDE SOPORTES DEXTRANO-AGAROSA 32
~Preparacin del soporte dextrano-agarosa-I 32
>~Preparacin del soporte dextrano-agarosa-Il 33
1.2. ACTIVACIONDE SOPORTES TIPO RESINA 34
1.2.1. ACI IVACION DELSOPORTE RESINATOYOPEARL. PREPARACION
DE SOPORTEGLIOXIL-TOYOPEARL 34
1.2.2. ACTIVATIONDE LOS SOPORTES RESINAELZPERGJT
Y RESINABIOSYNTH 34
Preparacin de glioxil-resinas 34
Preparacin de MANA-resinas 35
2. ENSAYOS PARA LA DETERMINACION DE LASACTIVIDADES ENZIMATICAS 35
2.1 ENSAYOS DEACTIVIDADENZIMATICA DE LA RENINA 35
2.1.1. ENSAYO DE ACI IVlDAD HIDROLIT1CA 35
2.1.2. ENSAYO DEACTIVIDAD COAGULANTE 36
2.2. ENSAYO DE ACTIVIDAD ENZIMATICADETRIPSINA 36
3. SEMIPURIFICACION DE LA SOLUCION DE RENINA DEMucor ,niehei COMERICAL 37
4. OXIDACION DELAS CADENAS GUCOSIDICASDE RENINA DEMucor miehel 37
6. PREPARACION DE DERIVADOS ENZIMATICOS PORINMOVILIZACION 38
6.1. PREPARACION DE DERIVADOS DERENINA DEMucor miehei 38
6.1.1. PREPARACION DEDERIVADOS DE RENINA SOBRE GLIOXIL-SOPORTES
(AGAROSA, TOYOPE4RL Y BiOS>WTH) 38
6.1.2. PREPARACION DE DERIVADOS DERENINA SOBREMANA-SOPORTES 39
u Inmovilizacin de renina a travs de su fraccin proteica a gel MANA-soportes 39
> Inmovilizacin de renina a travs de su fraccin glicosidica a MANA-soportes 40
6.1.3. PREPARACION DE DERIVADOS DE RENINASOBRE GEL
GLUTARALDEHIDO-AGAROSA 40
II
~L1 1
INDICE
6.1.4. PREPARACION DE DERIVADOS DE RENINA SOBRE
SOPORTES BDE-AGAROSA 41
6.1.5. PREPARACION DE DERIVADOS DE RENINA SOBRE GELES
DEXTRANO-AGAROSA 41
6.2. PREPARACION DE DERIVADOS DE TRIPSINA SOBRE GLIOXIL-
SOPORTES (AGAROSA, TOYOPE4RL, EUPERGITYBIOSYNTH) 41
RESULTADOS Y DISCUSION 43
1. ENSAYO PARA LA DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD COAGULANTE
DE LA RENINA 43
2. CARACTERIZACIONDEL EXTRACTO COMERCIALDEMucor miehei 46
3. ESTRATEGIAS PARA LA INMOVILIZACIONDE ENZIMAS QUE ACTUAN
FRENTE ASUBSTRATOS MACROMOLECULARES 48
3.1. Primera estrategia: MODULACION DE LA ORIENTACIONRELATIVA DE LA
ENZIMA SOBREEL SOPORTE 48
3.1.1. INMOVILIZACIONATRAVES DE LAS GRUPOS e-AMINO SUPERFICIALES
(Lys) DELA ENZIMASOBRE SOPORTES GLIOXIL-AGAROSA 48
3.1.2. INMOVILIZACIONATRAVES DE LOS GRUPOS CARBOXILO SUPERFICIALES
(Mp y/o Chi) DELA ENZIMA SOBRE SOPORTE MANA-AGAROSA 51
u Efecto de la modificacin qumica con carbodiimida (CDI> sobre la actividad y
estabilidad de la enzima en solucin 51
u Efecto de la fuerza jnica del medio sobre la actividad de la enzima en solucin 53
3.1.3. INMOVILIZACIONATRAVES DE LOS GRUPOS AMINO DE BAJO pRDE
LAENZIMA SOBRE SOPORTE GLUTARALDEHIDO-AGAROSA 57
3.1.4. INMOVILIZACION ATRAVES DE LAS CADENASOLICOSIDICASDE
LAGLICOENZIMA SOBRE SOPORTE MANA-AGAROSA 59
u Efecto de la senilpuriticacin y posterior oxidacin con NaO
4sobre la
actividad y estabilidad de la enzima en solucin 59
3.2. Segunda estrategia: UTILIZACION DE SOPORTES CON DIFERENTE
MORFOLOGIA INTERNA(Toyopearl, Eupergit y Biosynth) 64
3.2.1. DETERMINACION DELGRADO DE CONGRUENCIA GEOMETRICA
DE SOPORTES CON DIFERENTE MORFOLOGIA INTERNA 65
u Estudio de las posibilidades de multiinteraccin de cada soporte 67
3.2.2. CONTROL Y OPTIMIZACION DELA INMOVILIZACIONDE RENINA
SOBRE SOPORTES DE MENOR CONGRUENCIA GEOMETRICA 70
u Inmovilizacin de renina de Mucor miehei a travs de sus grupos amino
superficiales (Lys) sobre soportes activados con grupos glioxilo 70
III
INDICE
u Inmovilizacin de renina de Mucor miehel a travs de sus cadenas
glicosdicas sobre MANA-soportes 71
3.3. Tercera estrategia: UTILIZACION DE SOPORTES CON GRUPOS REACTIVOS
CONVENIENTEMENTE DISTANCIADOS DE SU SUPERFICIE 72
3.3.1. UTILIZACION DE 1,4-butanodiol-digLicidoxi-ter (DDE) COMO
AGENTEESPACIADOR 73
Preparacin y optimizacin de soportes BDE-agarosa 73
u Estudio y control de la inmovilizacin 74
3.3.2. UTILIZACION DE DEXTRANO COMO AGENTE ESPACIADOR 75
Preparacin y optimizacin de soportes dextrano-agarosa 75
u Estudio y control de la inmovilizacin de renina de Mucor miehel
sobre soportes dextrano-agarosa 79
5. COMPARACION DE LAS TRES ESTRATEGIAS. DISCUSION GENERAL 81
CAPITULO II:
Inmovilizacin-estabilizacin de glicoenzimas: Inmovilizacin-estabilizacin
de la 13-galactosidasa de Asvergillus ovzae para la hidrlisis de lactosa 88
INTRODUCCION 89
1. ESTABILIZACION DE ENZIMAS 89
2. INMOVILIZACION-ESTABILIZACIONDEGLICOPROTEINAS 92
2.1. PROPUESTA DE ESTABILIZACION DE ENZIMAS GLICOSILADAS 93
3. $-GALACTOSIDASA DEAspergillus oryzae 95
OBJETIVOS 97
METODOS 99
1. ACTIVACION DEL SOPORTE DE AGAROSA 99
2. ENSAYO DE ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA3-GALACTOSIDASA
DEAspergillus oyzae 99
3. SEMIPURIFICACION DE LA3-GALACTOSIDASA DEAspergillus oryzae 99
4. MODIFICACION QUMICA DE LA ENZIMANATIVA CON ETILENDL4MINA
(1,2-diaminoetano) 100
5. PREPARACION DE DERIVADOS DE3-GALACTOSIDASA DEAsperg/tus oryzae 101
Iv
INDICE
6. MODIFICACION QUIMICA CON NaIO, DE LOS DERIVADOS ENZIMATICOS
7. ENTRECRUZAMIENTO INTRAMOLECULAR
8. ENSAYOS DE ESTABILIDAD ENZIMATICA
101
102
103
RESULTADOS Y DISCUSION 104
1. SEMIlURIFICACION DEL EXTRACTO ENZIMATICO COMERCIAL
2. INMOVILIZACION DE LA P-GALACTOSIDASA DE A. oryzae POR UNION
COVALENTE SOBRE SOPORTE GLIOXII>-AGAROSA
3. ENRIQUECIMIENTO DE LA GLICOPROTEINA EN GRUPOS
REACTIVOS SUPERFICIALES
3.1. MODIFICACION QUIMICA CON EDA DIi LA ENZIMA EN SOLUCION
3.2. INMOVII~IZACION COVALENTE SOBRE SOPORTE GLIOXIL-AGAROSA
DE LA ENZIMA MODIFICADA CON EDA
104
105
108
109
+ Estabiliz&h trmica frente Ia correspondiente derivado unipuntml
3.3. EFECTO GLOBAL: MODIFICACION QUIMICA CON EDA + INMOVIIdZACION
COVALENTE MUL,TIPUNTUAL
111
116
4. ENTRECRUZAMIENTOS INTRAMOLECULARES
4.1. ACTIVACION DE LAS CADENAS GLICOSIDICAS DE LA ENZIMA POR
MODIFICACION QUIMICA CON NaIO,
4.2. ENTRECRUZAMIENTO INTRAMOLECULAR ENTRE LAS CADENAS
GLICOSIDICAS OXIL>ADAS Y LOS RADICALES AMINO DE LAFRACCION
PROTEICA DE LA GLICOPROTEINA INMOVILIZADA
5. DISCUSION GLOBAL
ll8
120
121
123
126
* * *
CAPITULO III:
Inmovilizacin-estabilizacin de enzimas oligomticas: Inmovilizacin-
estabilizacin de las /3-galactosidasas de Kluyveromyces lactis y
de Escherichi coli. para la hidrlisis de lactosa 130
INTRODUCCION 131
1. PROPUESTAS PARA L4 ESTABILIZACION DE ENZIMAS
OLIGOMERICAS 134
2. ESTABILIZACION DE ENZIMAS OLIGOMERICAS DEPENDIENTES
DE CATIONES DIVALENTES 138
3. DOS ENZIMAS OLIGOMERICAS DE INTERES INDUSTRIAL 139
V
4. .r~
4~.~!F~,.1I2iJJt.,<. ,Tu. ... ~ U 1SdI U
INDICE
3.1. /3-GALACI7OSIDASA DEKuyveromyces tactis 140
3.2. /3-GALACTOSIDASA DE Escherk/zz cot 141
OBJETIVOS 143
METODOS 144
1. ACTIVACION DELSOPORTE AGAROSA 144
2. PREPARACION DE DERIVADOS ENZIMATICOS 144
2.1. PREPARACION DE DERIVADOS DE 3-GAIACTOSIDASA DEKluyverotnyces tacs 144
2.1.1. PREPARACION DEL DERIVADO GLUTARALDEHIDO-AGAROSA-3 144
2.1.2. PREPARACION DEL DERIVADO GLUTARALDEHIDO-AGAROSA-75 145
2.1.3. PREPARACION DEL DERIVADO GLIOXIL-AGAROSA-75 145
2.2. PREPARACION DE DERIVADOS DE 3-GALACTOSIDASADE Escherichia col 145
2.2.1. PREPARACION DELDERIVADO GLIOXIL-AGAROSA 145
2.2.2. PREARACION DEL DERIVADO MANA-AGAROSA 146
2.2.3. PREPARACION DELDERIVADO GLUTARALDEHIDO-AGAROSA.75 146
2.2.4. PREPARACION DEL DERIVADO GLUTARALDEHIDO-AGAROSA-3 146
3. PREPARACION DE AGENTES POLWUNCIONALES 147
3.1. PREPARACION DE POLIMEROS POLIALDEHIDICOS 147
3.2. PREPARACION DE POLIMEROS POLIAMINICOS 147
4. ENTRECRUZAMIENTO INTRAMOLECULAR CON AGENTES POLIFUNCIONALES
DE LA ENZIMA INMOVILIZADA 148
4.1. ENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIALDEHIDICOS 148
4.2. ENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIAMINICOS 148
5. ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMATICA 149
5.1. ENSAYO DE LAACTIVIDAD ENZIMATICA DE 3-GALACTOSIDASADEK ladis 149
5.2. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE3-GALACTOSIDASA DE E. coli 149
6. ENSAYOS DE ESTABILIDAD ENZIMATICA 149
6.1. ESTUDIODEL EFECTO DE LADILUCION SOBRE LA ESTABILIDAD
ENZIMATICA 150
7. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN GELESDE ACRILAMIDA CON SDS 150
RESULTADOS Y DISCUSION 152
1. 3-GALACTOSIDASA DEKluyveromyces lacs 152
1.1. ESTUDIO DEL COMPORTAMIENTODE LA ENZIMA SOLUBLE 152
1.2. DERIVADO PREPARADO SOBRE GELGLUTARALDEHIDO-AGAROSA-3 154
1.3. DERIVADO PREPARADO SOBRE GEL GLUTARALDEHIDO-AGAROSA-75 158
VI
INDICE
1.4. DERIVADO PREPARADO SOBREGELGLIOXIL-AGAROSA-75 160
> Efecto de la dilucin y de la presencia de cationes divalentes sobre
la estabilidad del derivado glioxll-agarosa-75 162
1.5.~ ESTUDIO COMPARATIVO DE LOS DERIVADOS ENZIMATICOS OBTENIDOS.
DISCUSION 164
2. 3-GALACTOSIDASA DE Eseherichia cot 166
2.1. INMOVILIZACION MULTIPUNTUAL SOBRE DIFERENTES SOPORTES 167
u Inmovilizacin sobre soporte glioxil-agarosa-75 167
u Inmovilizacin sobre soporte MANA-agarosa-75 168
u Inmovilizacin sobre soporte glutaraldehido-agarosa-75 168
u Evaluacin de las diferentes estrategias de inmovilizacin 168
2.2. ENTRECRUZAMIENTO CON AGENTES POLIFUNCIONALES DE ENZIMAS
OLIGOMERICAS 171
2.2.1. ENTRECRUZAMIENTO SOBRE UN DERIVADO UNIPUNTUAL 171
u Inmovilizacin unipuntual sobre soporte glutaraldehdo-agarosa 171
u Entrecruzamiento con polmeros polialdehdicos 172
Entrecruzamiento con polneros poliamnicos 173
2.2.2. ENTRECRUZAMIENTOS SOBRE UN DERIVADO MULTIPUNTUAL 174
Entrecruzamiento con polmeros polialdehdicos 175
Entrecruzamiento con polmeros poliaminicos 175
2.3. TERMOESTABILIDAD DE LOS DIFERENTES DERIVADOS INMOVILIZADOS 175
3. DISCUSION 179
DISCUSION GLOBAL Y CONCLUSIONES 182
BIBLIOGRAFIA 188
VII
INTRODUCCION GENERAL
1
INThODUCCIONGENERAL
INTRODUCCION GENERAL
La tecnologa enzimtica entendida como la utilizacin por el hombre de la
capacidad biocataltica de las enzimas es tan antigua como el propio ser humano. La
coagulacin de la leche por su almacenamiento en recipientes fabricados con los
estmagos de animales, el enternecimiento de la carne por tratamiento con hojas y frutos
de determinadas plantas o la produccin de bebidas alcohlicas son algunos de los
procesos desarrollados antes de que se conociera tan siquierala existencia de las enzimas
o el proceso que catalizan. Fue en 1913 cuando L. Michaelis y M. L. Menten asentarn
las bases de la enzimologa con sus hiptesis sobre los mecanismos de las reacciones
enzimticas (1), dando el primer paso firme para la transformacin de un arte
transmitido de generacin en generacin en una tecnologa con base cientfica.
1. INTERES INDUSTRIAL POR LA UTILIZACION DE ENZIMAS
Las enzimas son biomolculas de naturaleza proteica que actan como
catalizadores en procesos orgnicos intra o extracelulares. La complejidad de los medios
biolgicos en las que ejercen su funcin hace que sean molculas muy especificas en
relacin al substrato con el que interaccionan, muy selectivas en cuanto a la reaccin que
sobre ste producen, y capaces de actuar, en general, en medios acuosos, a temperaturas
moderadas, pHs cercanos a la neutralidad y presin atmosfrica.
Estas caractersticas han planteado la posibilidad de la aplicacin de las enzimas
fuera de su medio natural en procesos qumicos como alternativa a la utilizacin de los
catalizadores qumicas convencionales. Su elevada actividad en condiciones suaves de
pH, temperatura y presin es importante para su empleo en procesos en los que
intervienen substratos y/o productos lbiles; su gran selectividad evita la formacin de
productos secundarios, ofreciendo buenas espectativas de uso en reacciones de Qumica
Fina; y su alta especificidad permite su actividad en mezclas complejasy as su aplicacin
en mtodos analticos, en el procesamiento de alimentos o en reacciones en las que
intervienen compuestos quirales. Adems su uso permite reducir ostensiblemente los
2
INTRODUCCION GENERAL
costes del proceso, tanto por el ahorro de energa como por eliminacin de etapas
posteriores de purificacin.
Hasta ahora la implantacin de las enzimas como catalizadores en procesos
qumicos a gran escala se ha visto condicionada por la dificultad de control de los
procesos de catlisis homognea, el alto coste del extracto enzimtico, la prdida de
actividad enzimtica durante las reacciones, la contaminacin del producto final por la
presencia del catalizador en solucin, la dificultad de su eliminacin de la mezcla de
reaccin y la imposibilidad de su reutilizacin. Todos estos inconvenientes derivan de
trabajarcon un catalizador homo2neo, que se solubiliza en la mezcla de reaccin, y i~kil
en reacciones prolongadas. Por ello se han desarrollado multitud de estrategias para la
inmovilizacin de las molculas de catalizador activas en un sistema que permita la
difusin de los substratos hasta alcanzar la molcula de enzima, de forma que sta pueda
ejercer su actividad sin salir de su recinto.
LI. INMOVILIZACION DE ENZIMAS
Bajo la denominacion de tcnicas de inmovilizacin de protenas se recogen todos
aquellos mtodos que logran el confinamiento o localizacin de las molculas de enzima
en cieno espacio definido y limitado de forma que retengan su actividad cataltica y que
permitan su uso repetido. Las estrategias desarrolladas con este fin se pueden organizar
en dos grupos (Figura 0.1) segn consistan en la retencin fisica de la molculas en un
espacio limitado sin sufrir modificacin alguna (A) o en la insolubilizacin por unin
quunica de la molculas entre s o a una estructura slida (B). Dentro del primer grupo
de tcnicas de inmovilizacin se agrupan aquellas que han desarrollado sistemas de
confinamiento de la solucin proteica dentro de un recinto semipermeable como los
reactores de membrana, las fibras huecas o la microcpsulas (Al) y otros mtodos en los
que las molculas se encuentran atrapadas en micelas reversas o en redes polimricas
(A2). El segundo gran grupo de estrategias para la inmovilizacin de protenas a travs
de la insolubilizacin de la molculas por interaccin qumica se clasifican segn la
naturaleza de la citada interaccin en: procesos no covalentes, o inmovilizacin por
adsorcin, en los cuales las uniones son mayoritariamente de tipo hidrofbico o
electrosttico (B1), y en sistemas de insolubilizacin por formacin de enlaces covalentes
en los que participa la molcula de enzima (B2), que abarcan tanto procesos de
3
INTRODUCCION GENERAL
(Al)
entrecruzamiento intermolecular con agentes bifuncionales de pequeo tamao, como
copolimerizaciones durante la formacin de una matriz polimrica, o como la unin
covalente a solidos preexistentes.
(B1)
111111
u
Iltilil
II
(B2)
Figura 0.1. Tcnicas de inmovilizacin de enzimas (E): (A) Confinamiento; (B) Insolubilizacion.
La eleccin de una u otra estrategia de inmovilizacin para la obtencin de
derivados enzimticos para ser utilizados comocatalizadores en un determinadoproceso
qunnico depender de todos los factores que en l intervienen, es decir de las
propiedades y caractersticas intrnsecas de la enzima (actividad, condiciones ptimas
4
(A2)
INTRODUCCIONGENERAL
de estabilidad, estructuras terciaria y cuaternaria), del tipo de reaccin a catalizar
(naturaleza, caractersticas y propiedades de substratos y productos, condiciones ptimas
de la reaccin), de los condicionantes de tipo industrial dependientes del diseo del
reactor enzimtico (requerimientos operacionales, costes) y, en general, de las ventajas
y propiedades adicionales que se deseen conseguir con dicho proceso de inmovilizacin.
Los mtodos fsicos y las uniones a soportes slidos por adsorcin favorecen una
inmovilizacin suave y no distorsionante por la ausencia de interacciones qumicas que
afecten a la enzima, y permiten la inmovilizacin de varias enzimas e incluso de su
correspondiente cofactor. El inconveniente de todas estas tcnicas es la mnima o nula
estabilizacin lograda por los derivados enzimticos resultantes pues las molculas se
encuentran libres en el medio o unidas de forma reversible a la matriz, la nica
estabilizacin permitida se logra cuando se limitan las interacciones intermoleculares
(agregacin o proteolsis) o procesos de disociacin de subunidades o prdida del
cofactor, por ello estrategias ms agresivas en la que tiene lugar la participacin de la
enzima en uniones covalentes son la estrategias de eleccin cuando se pretende limitar
las inactivaciones y/o la libreracin de la enzima al medio de reaccin.
La inmovilizacin de una enzima por formacin de enlaces covalentes entre ella
y el soporte o la matriz en la que se integra supone la ineversibilidad de la unin y, en
consecuencia, grandes ventajas frente a otros sistemas de inmovilizacin de enzimas
cuando se pretende conseguir no slo un catalizador heterogneo sino suficientemente
estable. Si adems el proceso permite la formacin de numerosos enlaces en cada
molcula de enzima, lo que se ha denominado multiinteraccin, la fijacin de la posicin
relativa de varios puntos de la molcula en el espacio, implica el aumento de la rigidez
de su estructura terciaria y por lo tanto una importante limitacin a posibles distorsiones
de la conformacin activa del biocatalizador provocadas por el medio, las condiciones
o la duracin de la reaccin.
La idea de que la inmovilizacin a travs de varios puntos a un determinado
soporte debera ejercer un importante efectoestabilizador propuesta por Klivanov (2, 3),
fue desarrollada con xito por Mozhaev et aL (4, 5) y Martinek et aL (6) para enzimas
copolimerizadas. Ante las limitaciones en cuanto a carga enzimtica, propiedades
mecnicas y problemas difusionales planteadas por la estructura porosa cerrada de los
derivados preparados por copolimerizacin, as como la imposibilidad de control del
grado de multiinteraccin, se ha propuesto la unin covalente de enzimas sobre soportes
5
INTRODUCCION GENERAL
slidos preexistentes como la ms adecuada para la obtencin de derivados enzimticos
inmovilizados y estabilizados.
1 .1 .1 . INMOVILIZACION DE ENZIMAS POR UNION COVALENTE A SOPORTES
SOLIDOS PREEXISTENTES
La unin covalente de enzimas a soportes slidos preexistentes es la estrategia
ms utilizada debido principalmente a tres importantes propiedades conferidas a los
derivados enzimticos obtenidos por este sistema, adems de las derivadas de la propia
inmovilizacin. Estos atributos caractersticos son el caracter covalente y por lo tanto
estable de la unin, la estabilizacin adicional que puede conferir la interaccin cuando
sea multipuntual y el pennitir manipulaciones posteriores con el fin de modificar
propiedades qumicas o catalticas, provocar cambios de especificidad de substratos,
realizar estudios de desplegamento-replegamiento, de la presencia de cosolventes o
cosolutos, etc.. Adems, en muchos casos es posible la eleccin del soporte adecuado
segn el precio, el tipo de reactor o la capacidad de carga enzimtica deseados.
Sin embargo cada tipo de enzima y cada reaccin a catalizar presentaran
condicionantes especficos al establecimiento de estrategias generales de inmovilizacin
covalente, surgiendo problemas de congruencia geomtrica enzima-soporte, los cuales
limitaran la posibilidad de multiinteraccin y de estabilizacin adicional, el nmero de
uniones de cada molcula de enzima con el soporte podra provocar distorsiones y
conducir a derivados enzimticos inactivos, o bien, algn grupo del centro activo
imprescindible para su actividad cataltica podra participar en launin al soporte, lo cual
supondra la inactivacin de la enzima.
> Inmovilizacin covalente de enzimas sobre soporte glioxil-agarosa
Este mtodo consiste en la inmovilizacin covalente controlada y poco
distorsionante de enzimas sobre un soporte slido preexistente tipo supe,ficie
polifuncionalizado con grupos aldehdo moderadamente separados del soporte (7, 8).
El proceso de inmovilizacin se inicia con el ataque nucleofilico del N de un
residuo de Lys superficial de la enzima sobre el C carbonlico de uno de los grupos
6
INTRODUCCION GENERAL
glioxilo con los que se encuentra activado el soporte, dando lugar a una base de Schiff
Esta base de Sc/tiff es una forma reversible y por ello ser necesaria la posterior
reduccin con NaBH< para que resulte un enlace covalente sencillo y por tanto estable
entre enzima y soporte. Esta reduccin, adems provoca el bloqueo o inactivacin del
soporte, por convertir los gruposglioxio reactivos remanentes en grupos hidroxilo inertes.
Las caractersticas ms importantes tanto del tipo degrupo reactivo como del tipo
de unin enzima-soporte se resumen a continuacin. En primer lugar, los geles de
agarosa son estructuras tridimensionales ms o menos compactas integradas por la
asociacin de filamentos de cadenas polisacridas organizadas, cada uno de estos
filamentos de gran densidad exhibe una gran superficie ante una enzima, posibilitando
una buena congruenciageomtrica entre ambas. El mtodo de activacin permite el fcil
control del grado de activacin superficial y con ella se puede conseguir una elevada
densidad superficial de grupos activos accesibles en el soporte. Estos grupos reactivos
obtenidos son muy estables tanto durante el almacenamiento prolongado como en el
transcurso de la reaccin de inmovilizacin de protenas. El grupo con el que se ha
activado el soporte, grupo glicol, presenta gran reactividad hacia un grupo qumico
abundante sobre la superficie de las protenas como es el grupo amino de los residuos
de Lys y la interaccin entre ellos no presenta ningn impedimento de tipo estrico. El
resultado del proceso es la formacin de un enlace reversible tipo base de Sc/tiff, esto es
muy importante pues los enlaces que se formarn mayoritariamente sern aquellos que
supongan la mnima distorsin de la estructura tridimensional de la enzima, siempre que
las condiciones de reaccin no sean muy drsticas. Cuando la densidad de grupos
reactivos sobre cada una de las especies (soporte y enzima) es suficiente para que
puedan tener lugar varias interacciones sobre la misma molcula, la formacin de dos
enlaces tipo base de Sc/tiff entre ellos supone la inmovilizacin irreversible a pesar de la
reversibilidad de cada uno de estos enlaces, pues la probabilidad de que los equilibrios
de disociacin de ambos enlaces se encuentren en el mismo instante desplazados hacia
forma disociada son muy bajas (Figura 0.2). El tratamiento posterior con un agente
reductor como el NaBH
4 no slo supone la irreversibilidad de los enlaces formados sino
la inactivacin de los grupos reactivos del soporte que no hubiern interacccionado, que
pasan a convertirse en hidroxilos, lo cual supone la obtencin de un derivado enzimtico
inmovilizado en el que la enzima se encuentra unida covalentemente a un soporte slido
inerte.
7
INTRODUCCION GENERAL
Estas caractersticas confieren al sistema de inmovilizacin buenas posibilidades
de que entre enzima y soporte tengan lugar una interaccin intensa, a travs de varios
puntos, pero poco distorsionante, y prometen una inmovilizacin rpida, extensible a
todo tipo de enzimas y duradera, como lo demuestra la aplicacin a enzimas tan
diferentes como la lipasa de Candida rugosa (9), tripsina (8), quimotripsina (10),
penicilina G acilasa (11), ferredoxin-NADP
4 reductasa (12), etc. que han dado lugar a
derivados con una alta carga enzimtica e importante estabilizacin.
o
OCH
2-C
o
e
oCH2--C
o
e-
OCH2--C
1.2. U TILIZACION DE ENZIMAS EN INDUSTRIALACTEA
La aplicacin de enzimas para la Industria del procesamiento de alimentos
lquidos ha avanzado rpidamente debido a que los procesos de la industria alimentaria
en general son degradativos y en muchos de ellos la industria tradicional ya utilizaba
o
-e
OCRrC\
OCHrCH
o
8
INTRODUCCION GENERAL
extractos enzimticos, por lo tanto la introduccin de nuevas tecnologas supone la
adaptacin de los procesos utilizando la misma herramienta (biocatalizador).
La industria lctea ofrece un campo muy interasante para la utilizacin de
enzimas inmovilizadas en el procesamientode sus productos o en su anlisis. Muchos de
los procesos que se realizan hoy en da requieren el uso de enzimas que en la actualidad
se usan en forma de extractos solubles con los problemas econmicos, tcnicos y de
posibles contaminaciones que ello conleva, por tanto la utilizacin de derivados
enzimticos inmovilizados sobre los numerosos derivados lcteos fluidos supondra
interesantes oportunidades tanto por la posibilidad de substituir las etapas enzimticas
clsicas por sistemas en continuo, como por la posibilidad de introducir nuevos
tratamientos enzimticos que den lugar a nuevos productos y de mayor calidad. Desde
que ha sido planteada esta posibilidad se han estudiado numerosas reacciones de inters
potencial:
- Utilizacin de catalasa inmovilizada para la degradacin del perxido de
hidrgeno (11202) usado en la esterilizacin de la leche en fro.
- Utilizacin de peroxidasa inmovilizada como agente antiiinicrobiano.
- Utilizacin de papana inmovilizada para el estudio de la estructura de las
micelas.
- Utilizacin de proteasas inmovilizadas para la coagulacin de la leche.
- Utilizacin de (3-galactosidasas inmovilizadas para la hidrlisis de lactosa.
- Utilizacin de lipasas y esterasas inmovilizadas para la produccin de aromas
naturales.
Dos de la enzimas para las que sera de gran inters su inmovilizacin para el
empleo de los derivados en la industria lactea son: renina y 3-galactosdasa.
Las reninas son proteasas cidas que catalizan la hidrlisis de una nica protena
lctea, la casena ic, lo cual desencadena una cadena de procesos que culminan con la
formacin de un precipitado denominado cuajada, primera etapa en la produccin del
queso. Estas enzimas son de las ms usadas hoy en da a nivel industrial y su adquisicin
supone grandes sumas de dinero para las industrias consumidoras. Por ello se han
9
INTROBUCCION GENERAL
realizado numerosos estudios para determinar el modo de utilizacin ms eficiente. El
desarrollo de las tcnicas de inmovilizacion de enzimas ha orientado mucho de estos
estudios a la inv~stigacin de las posibilidades de inmovilizacin impulsados por dos
factores: el enorme incremento de la demanda que llev a perodos en los que la
disponibilidad de los extractos utilizados, principalmente quimosina, disminua
considerablemente y la laboriosidad y dificultad de control de proceso industrial. Por lo
tanto, la obtencin de derivados inmovilizados de estas enzimas permitira el
procesamientoen sistemas en continuo con el consiguiente ahorro en catalizador, adems
se facilitada el control del proceso, se limitaran de reacciones secundarias sobre los
productos de la coagulacin o de menor especificidad que la hidrlisis de casena, y se
podran obtener sueros libres de enzima (ricos en lactosay en protenas solubles) lo cual
permitira su aprovechamiento posterior.
Al tratarse de una endoproteasa y tener que actuar sobre un substrato
macromolcular la inmovilizacin puede plantear condicionantes de tipo esttico dando
lugar a la prdida de sus propiedades coagulantes. Por ello, la preparacin de derivados
presenta una mayor complejidad que la de otras enzimas cuyos substratos son de
pequeo tamao.
Las f3-D-gakwtosWasas (fS-D-galactsido galactohidrolasas, EC 3.21.23) son
disacaridasasque catalizan la hidrlisisy transgalactosilacin de 13-galactopiransidos. Su
substrato natural es la lactosa y por ello tambin son denominadas lactasas, siendo
responsables de la hidrlisis de su enlace /3-(1-4) rindiendo como productos: galactosa
y glucosa. Son, por tanto, enzimas especficas para el anillo D-piransido y el enlace /3-
glicosdico.
El inters industrial de estas enzimas reside en la posibilidad de su utilizacin
para la eliminacin de la lactosa en numerosos productos y subproductos lcteos.
La lactosa (4-O-f3-D-galactopiranosil-D-glucosa) es el azucar mayoritario de la
leche y su presencia en los productos lcteos supone importantes limitaciones a la hora
de su manipulacin o del consumo humano de los productos. En primer lugar, la
insuficiencia enzimtica intestinal que presenta una sub-poblacin de individuos nada
despreciable, hace que desarrollen intolerancia a la lactosa por lo que, en muchos casos,
no pueden consumir leche ni sus derivados. En segundo lugar, la baja solubilidad de este
disacrido limita considerablemente muchos de los posibles tratamientos a aplicar sobre
lo
INTRODUCCION GENERAL
los productos lcteos, dificultando y encareciendo los procesos industriales. Y en tercer
lugar, la presencia de lactosa en los sueros supone un importante contaminante de las
aguas residuales de las plantas procesadoras de leche.
La aplicacin de estas enzimas en la industria lctea, adems de eliminar los
citados inconvenientes derivados de la presencia de este componente en los productos
elaborados, supondra un atractivo modo de aprovechamiento de los sueros comojarabes
de glucosa y galactosa que podran ser utilizados como edulcorantes en productos
propios o en diferentes industrias alimentarias. Tambin permitira introducir
modificaciones en los procesos lo cual dara lugar a derivado lcteos diferentes.
Las caractersticas estructuralesy propiedades enzimticasde cada/3-galactosidasa
dependen de su origen, por eso en cada captulo del presente trabajo se hace una
descripcin breve de la lactasa objeto de estudio. Las diferentes lactasas han mostrado
variadas propiedades cinticas que condicionaran su posible aplicacin en funcin de las
propiedades del substrato, de los rendimientos requeridos y de los condicionantes
tecnolgicos del proceso. As, las enzimas de origen fngico disponibles comercialmente,
conioAspergillus o,yzae yAspergiilus niger permiten buenos rendimientos en la hidrlisis
de lactosa en suero debido a su pH ptimocido (pH 4,5) apropiado para este substrato;
para su utilizacin en la hidrlisis de lactosa en leche, se ha compensado su menor
actividad enzimtica a pH 6,0-6,5, utilizando cantidades mayores de enzima. Tambin se
han estudiado fuentes enzimticas de tipo bacteriano como Escherichia cok o Badillus
circulans por tener un PH ptimo de actividad adecuado para su utilizacin en leche, sin
embargo debido a su origen su aplicacin en procesos alimentarios no es considerado
seguro y por tanto su uso no est permitido.
El proceso de hidrlisis de lactosa se debe realizar preferentemente a
temperaturas altas para eliminar probiemas de contaminacin bacteriana y para
aumentar la velocidad de reaccin pues es preciso procesar grandes cantidades de
substrato (leche o suero). Por ello, la obtencin de derivados enzimticos ptimos para
su empleo a nivel industrial obliga a que stos sean muy activos y muy estables. Esta
estabilizacin podr venir de la mano de la propia inmovilizacin o por el desarrollo
posterior de estrategias de establizacin sobre los derivados inmovilizados.
fi
OBJETIVOS GENERALES
12
i j , ~i ! ~
OBJETIVOS GENERALES
OBJETIVOS GENERALES
De un modo muy general, el primer objetivo de la presente Tesis Doctoral es el
desarrollo de herramientas bioquimico-fsicas para optimizar el diseo molecular de
derivados de enzimas inmovilizadas tiles en tecnologa de alimentos y ms
concretamente de derivados de una renina y de diferentes lactasas de inters en
tecnologa lctea. Sin embargo, al abordar dicho objetivo surgen dificultades, poco
estudiadas en Tecnologa Enzimtica, y no exclusivas de la Tecnologa de los Alimentos.
Los problemas a resolver para disear buenos derivados de renina y lactasa se solapan
perfectamente con otros, no los ms comunes pero s muy frecuentes, que se manifiestan
en las enzimas de inters industrial, como son: la utilizacin de enzimas inmovilizadas
que actan sobre substratos macromoleculares, la inmovilizacin y estabilizacin de
enzimas altamente glicosiladas o la estabilizacin estructural y funcional de enzimas
oligomricas.
As pues se decidi, en contraposicin a la tecnologa ms comn de enzimas
sencillas que actan sobre substratos de bajo peso molecular y tomando como modelo
las citadas enzimas de marcado inters industrial, fijar como objetivo primordial del
trabajo: la inmovilizacinyla estabilizacin de enzimas de estructuray/ofuncin complejas.
Como mtodo de trabajo se continu la linea de investigacin clave en nuestro
laboratorio para el desarrollo de nuevas tecnologas de enzimas industriales a travs de
la aplicacin de estrategias de bioqumica y biofsica de fase slida. Es decir, servirse de
la inmovilizacin de la posterior modificacin de los derivados resultantes, para el diseo
de nuevos sistemas de estabilizar y modular las propiedades de la enzimas industriales.
13
I I
OBJETIVOS GENERALES
Son tres los problemas a resolver y a ellos se
de la Memoria:
1 .- Inmovilizacin de enzimas/protenas que
macromoleculares.
dedicacada uno de los tres captulos
actan sobre substratoslligandos
1 1 .- Inmovilizacin y estabilizacin de enzimas altamente glicosiladas.
iii.- Inmovilizacin y estabilizacin estructural y funcional de protenas de estnctura
oligomrica.
En cada uno de los captulos se discuten las nuevas metodologas a utilizar y en
la Discusin Global se realiza una evaluacin conjunta ya que, a pesar de los diferentes
temas planteados, el nucleo de los problemas y las herramientas para resolverlos tienen
numerosos puntos en comn. El problema global es la inmovilizacin de una enzima
para ser reutilizada sin que las molculas se liberen del soporte, al mismo tiempo retener
un gran porcentaje de actividad cataltica, tanto hacia substratos pequeos como hacia
substratos macromoleculares, y aumentar su estabilidad cuanto sea posible frente a la
disociacin de subunidades, frente a la distorsin de la estructura 3D, etc.. Las soluciones
vendrn de la mano de la eleccin de las estrategias adecuadas, de la eleccin del
soporte para la inmovilizacin, de la eleccin de la qumica de activacin, de la
utilizacin de brazos espaciadores, de la eleccin de los agentes entrecruzantes, del
diseo de los procesos de inmovilizacin y de modificaciones qumicas, etc..
14
CAPITULO 1
Inmovilizacin de enzimas que actan sobre
substratos macromoleculares: Inmovilizacin de renina
de Mucor miehel para la hidrlisis de casena ic.
15
CAPITULO 1
INTRODUCCION
INTRODUCCION
1 . INMOVILIZACION DE PROTENAS/ENZIMAS QUE ACTUAN SOBRE
LIGANDOS/SUBSTRTOS MACROMOLECULARES
La inmovilizacin de enzimas y otras protenas de inters que una vez en fase
slida deben actuar sobre substratos macromoleculares supone un problema general
tanto para el desarrollo de tcnicas de cromatografa como para reacciones industriales.
Este es el caso de la inmovilizacin de antgenos para unin especfica del
correspondiente anticuerpo, de nucleasas para hidrlisis de cidos nucleicos, de lectinas
o, como en el caso que se ha elegido como ejemplo, deproteasas como la renina (39.000
D) para la hidrlisis de casena ic (19.000 D), en los cuales la zona de la superficie de la
enzima involucrada en el reconocimiento del substrato y en la catlisis debe ser muy
amplia (Figura 1.1). Ello trae consigo dos problemas crticos en el proceso de
inmovilizacin:
-por un lado, pequeas distorsiones en la estructura tridimensional de la enzima
que se pueden producir durante el proceso de inmovilizacin, por la unin
covalente multipuntual, por interacciones fisico-quimicas entre la enzima y el
soporte, etc. pueden tener ahora efectos negativos muy importantes sobre las
propiedades catalticas de la enzima inmovilizada.
- por otro lado, la posibilidad de que tras la inmovilizacin de la enzima su centro
activo pueda quedar parcialmente orientado hacia la superficie del soporte,
impondraseveras restriccionespara el acceso delos substratos macromoleculares.
Estos problemas han recibido poca atencin en la literatura cientficas ya que en
la mayora de los sistemas enzimticos de inters industrial las enzimas deben actar
sobre substratos pequeos y la incidencia de los problemas planteados es mucho menor.
16
44Y4~ ~ ~ - w~u**1Jp0mup.I4Iq!lv~sb <.14
CAPITULO 1 INTRODUCCION
S S-E
Figura1,1. Representacin esquemtica de la interaccin de unaenzima con un substrato macromolecular.
As pues, para optimizar la preparacin de estos derivados de protenas que
actan frente a substratos macromoleculares, en la presente Memoria de Tesis Doctoral
se ha estudiado la influencia de algunas caractersticas, tanto del soporte como de los
mtodos de activacin de los mismos que, en este caso pueden ser crticas. As:
* se inmovilizar la enzima sobre soportes activados con diferentes grupos
funcionales para forzar la unin de las molculas de protena al soporte a travs de
diferentes zonas de su superficie externa. De este modo se pretende modificar la
orientacin relativa del centro activo de la enzima con respecto a la superficie del
soporte, hasta lograr una orientacin en la cual no se vea restingida la accesibilidad de
los substratos voluminosos,
* se inmovilizar la enzima sobre soportes activados en los que los grupos
funcionales reactivos se encuentren alejados de la matriz del soporte por medio de
brazos espaciadores inertes,
* y, por ltimo, se inmovilizar la enzima sobre soportes con morfologa interna
diferente que supongan menor impedimento estrico.
E
17
CAPY~U LO 1
INTRODUCCION
(A)~
(B)
(C)
Figura 1.2. Estrategias dc inmovilizacin propuestas para la inmovilizacin de enzimas que actan sobre
substratos macromoleculares: (A) Anclaje de la enzima al soporte con distintas orientaciones relativas,
(E) Utilizacin de soportes activados con brazos espaciadores y (OUtilizacin de soportes con diferente
morfologa interna.
18
CAPITULO 1
INTRODUCCION
* en general, se disearn inmovilizaciones muy suaves para reducir al mximo
las distorsiones de la enzima durante la inmovilizacin y para conservar lo ms intacta
posible toda la zona involucrada en el reconocimiento de los substratos
macromoleculares. Es decir, utilizando soportes con un bajo grado de activacin, se
intentarn reducir al mximolas posibilidades de que cada molcula de enzima se pueda
unir al soporte a travs de varios enlaces. Al mismo tiempo, cuando la inmovilizacin
requiera algn tipo de modificacin qumica previa de la enzima (la activacin de sus
residuos cidos, la oxidacin de sus cadenas glicosdicas con pexyodato, etc.) se
emplearn los soportes con los grupos funcionales adecuados para que el grado
requerido de modificacin de la protena sea lo menor posible.
Acontinuacin se comentan en detalle las distintas alternativas propuestas para
estudiar cada uno de los parmetros indicados y la orientacin dada a su desarrollo.
Estas tres estrategias no son en modo alguno excluyentes, pudiendo ser utilizadas de
forma complementaria para abordar el problema de la obtencin de derivados
enzimticos con buena actividad cataltica frente a substratos macromoleculares.
* ANCLAJE DE LA ENZIMAALSOPORTE CON DISTINTAORIENTACION
RELATIVA.
Este estudio utiliza un mismo soporte, variando el tipo de grupos reactivos con
los que se activa, de forma que la unin de la enzima tenga lugar a travs de grupos
superficiales de diferente naturaleza. Con ello se intenta que la orientacin mayoritaria
que adoptarn las molculas inmovilizadas para cada funcionalizacin suponga una
diferencia llamativa con respecto a la mayoritaria con otro tipo de activacin.
Se han desarrollado cuatro mtodos de inmovilizacin que se representan
graficamente en la figura 1.3:
19
CAPITULO 1 INTRODU CCION
o
CH
O
C
H
RO
[1 0
O 0 0>4
O o OH
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 1.3. Mtodos de inmovilizacin de enzimas por unin covalente a soportes de agarosa que permiten
la diferente orientacin de la molcula con respecto a la superficie del soporte: (A) Inmovilizacin
covalente atravs de lazona de la enzima ms rica en gruposamino; (B) Inmovilizacin covalente a travs
de los grupos carboxilo de la enzima; (C) Inmovilizacin covalente a travs del residuo amino terminal de
la enzima y (D> Inmovilizacin covalente a travs de las cadenas glicosdicas de la glicoenzima.
20
[1
CAPITULO 1
INTRODUCCION
- Inmovilizacin de enzimas a travs de su area ms rica en grupos amino a
soportes activados con grupos glioxilo (A). Los grupos aldehdo del soporte
al rea9conar con un grupo amino superficial de la protena forman bases
de Shiff lo cual supone la insolubilizacin reversible. Para que la unin
enzima-soporte sea estable, en la interaccin han de estar involucrados al
menos dos pares amino-aldehdo. La reaccin bipuntual ha de tener lugar
sobre un soporte muy activados y en un medio suficientemente alcalino
(pH=10,0). Con esta estrategia las molculas de enzima se inmovilizarn
por la zona de su superficie que presente mayor densidad de residuos de
Lys ya que sern los que ms fcilmente puedan dar lugar a este tipo de
inmovilizaciones bipuntuales.
- Inmovilizacin de enzimas a travs de sus grupos carboxilo a soportes
activados con grupos amino (B). La posibilidad de preparar un soporte
activados con grupos amino de muy bajo pK permite realizar la
inmovilizacin en condiciones experimentales muy suaves utilizando bajas
concentraciones de carbodiimida como agente activador de grupos
carboxilo de Asp o Glu. Por ello la enzima se inmovilizar
mayoritariamente a travs de la zona de su superficie de la enzima ms
enriquecida en este tipo de residuos cidos.
- Inmovilizacin de enzimas a travs de su s reslilaos amino trminales a
soportes activados con gru pos glu taraW ehu do (C). Estos soportes reaccionan
irreversiblemente con las molculas de protena de modo que stas quedan
insolubilizadas nada ms producirse la primera reaccin entre un grupo
amino superficial de la protena y un residuoglutaraldehido del soporte. Si
se tiene en cuenta que el pK de los grupos amino terminales de una
protena es de 7,5-8.0 y, por el contrario, el pK de los residuos de Lys
expuestos al medio del orden de 10,7, se puede preveer que la reactividad
del residuo amino terminal a pH 7,0-8,0 es muy superior a la de cada
residuo de Lys. Por ello, cuando se inmoviliza una protena a pH prximo
a la neutralidad sobre este tipo de soportes, la reaccin entre cada
molcula de enzima y el soporte va a tener lugar principalmente a travs
de este residuo amino terminal, siempre y cuando se encuentre accesible
en la superficie de la molcula.
21
CAPITULO 1
1NTRODUCCION
- Inmovilizacin de enzimas a travs de su s cadenas glicosidicas a soportes
activados con gru pos amino (D). En el caso de enzimas o protenas
glicosiladas la presencia de sus cadenas polisacridas permite un nuovo
tipo de inmovilizacin. El bajo pK de los soportes MANA-agarosa ha
posibilitado la insolubilizacin de glicoprotenas, previamente oxidadas, en
condiciones suaves.
* UTILIZACION DE BRAZOS ESPACIADORES.
La utilizacin de brazos espaciadores entre ligandos y soporte se desarroll
principalmente en cromatografa de afinidad para lograr que el ligando en fase slida
pudiese interaccionar con el centro de reconocimiento de las protenas, generalmente
situado en una cavidad, ms o menos expuesto. En estos casos las cadenas alifticas de
6-9 tomos de carbono suelen ser suficientes para lograr un perfecto acoplamiento entre
el ligando inmovilizado y la protena en solucin. En el caso de enzimas y substratos
macromoleculares, el problema podra ser mucho ms complejo ya que un
distanciamiento de pocos A promovido por brazosespaciadores alifticos podrano ser
suficiente cuando la orientacin de la molcula de enzima en relacin al soporte no sea
buena para la insercin del substratovoluminoso. Por ello se han propuesto la utilizacin
de dos tipos de espaciadores un diepoxido lineal de 12 tomos, y cadenas polialdehdicas
obtenidas por oxidacin de dextrano.
* UTILIZACIONDESOPORTES CONDIFERENTEMORFOLOGIAINTERNA.
La naturaleza qumica del soporte as como el mtodo de sntesis industrial del
mismo, determinarn la disposicin estructural de las cadenas polimricas que lo
componen, dando lugar a estructuras porosas ms o menos abiertas (Figura 1.4). La
morfologa interna del soporte determinar el tipo de >conexiones geomtricas enzima-
soporte que sudan en la inmovilizacin: interacciones enzima-cadena molecular, enzima-
red tridimensional, enzima-superficie o situaciones intermedias. La eleccin de un tipo
u otro de soporte ser decisiva pues la conguencia geomtrica enzima soporte
determinar la accesibilidad del substratovoluminoso promovido por laproximidad entre
la superficie del soporte y el centro activo de la enzima.
22
CAPITULO INTRODUCCION
1
(A)
(B)
(C)
Figura 1.4. Soportes con diferente morfologia interna.
As, los soportes con poros cilndricos como siica, vidrio, alumina, algunos
polmeros sintticos como las resinas SEPABEADS de la casa Mitsubishi, etc. (A) o los
soportes tipo agarosa o celulosa constituidos por fibras de unos 200 A de dimetro (B)
podran presentar una gran congruencia con la enzima inmovilizada y dificultar su
interaccin con substratos voluminosos. Sin embargo, muchos polmeros sintticos
obtenidospor entrecruzamiento qumicode cadenas polimricas aisladascomolas resinas
de tipo acrlico o de tipo polivinilo presentan una estructura interna porosa similar a un
entramado de cadenas moleculares aisladas (C) y la inmovilizacin de molculas de
enzima podra presentar menores problemas estricos para la unin de los substratos
(Figura 1.4).
23
CAPITULO 1
INTRODUCCION
2. RENINA, ENZIMA-MODELO PARA EL DESARROLLO TECNICAS DE
INMOVILIZACION DE ENZIMAS QUE ACTUAN SOBRE SUBSTRATOS
MACROMOLECULARES
2.1 . COAGULACION DE LA LECHE: ESTABILIDAD MICELAR, MECANISMO DE
LA COAGULACION Y ENZIMAS COAGULANTES
La coagulacin de la leche consiste en la formacin de un entramado proteico
(cogulo o cuajada), producto de las modificaciones fisicoqumicas de las micelas de
casena por la accin de enzimasproteolticas y/o acidificacin, y supone la primera etapa
del proceso de transformacin de la leche en queso a Ja que siguen la separacin del
suero (fraccin soluble) para obtencin de la cuajada (precipitado), el salado, y el afinado
o maduracin, que recoge todas las transformaciones bioqumicas que se producen sobre
los constituyentes de la cuajada por la accin enzimas, en general de origen microbiano.
La micela de casena est formada por la asociacin de protenas (casenas:
a
8,ag,/
3 y lc), de fragmentos peptdicos y de constituyentes inorgnicos (Co y P). Las
caractersticas fricas de estas partculas (volumen, densidad, grado de hidratacin) les
confieren gran estabilidad en medio acuoso.
Entre las casenas, destaca la fraccin ic por su escasa afinidad al Ca, por ser la
nica que puede encontrarse glicosilada, pero sobre todo, por su importante papel dentro
del complejo micelar (13). La estructura primaria de su cadena peptdica revela la
existencia de dos regiones: la regin N-tenninal (segmento peptdico 1-105), bsica e
hidrofbica, y la regin C-tenninal (segmentopolipeptdico 106-169), cuyo caracter cido
e hidrofilico se ve acentuado por la presencia de las cadenas glicosdicas. La presencia
de Ja casena ic en Ja micela es la que permite Ja formacin de complejos estables con las
casenas ay /3 debido precisamente a su naturaleza anfiptica: el ncleo de la micela se
encuentra formado por intensas asociaciones polimricas de naturaleza exclusivamente
proteica con bajo contenido en casena ic, unidas entre s por enlaces hidrofbicos y
electrostticos en los que participarn los grupos fosfoserilo de la protenas y el Ca. Por
el contrario, en la zona externa de la micela se dispondrn las subunidades ricas en
casena ic, que actuarn estabilizando el complejo, exponiendo al medio su regin C-
terminal hidrofilica (14) (Figura 1.5).
24
CAPITULO 1
INTRODUCCION
Mo lecu las de k-caser, a

Gru po s PO
4
rJu cleo hdro to bco
RaeLmo s de Ca9 (PO4>6
Figura 1.5. Representacin esquemtica de la estructura propuesta para las micelas (14): (A) subunidad
mcelar y (8) micela.
La gran estabilidad de la leche como coloide es consecuencia de la carga elctrica
superficial negativa de las micelas, cuya repulsin electrosttica evita la agregacin, a
pesar de la gran densidad, manteniendo la dispersin micelar.
Apesar de la gran estabilidad de la micela de casena, la alteracin de alguno de
los parmetros que controlan su dispersin en el medio provoca la insolubilizacin de
la fraccin proteica de la leche o coagulacin. Los mtodos ms sencillos para
desestabilizar la dispersin son:
- la acidificacin del coloide, que provoca el aumento de la solubilidad del Ca en
la fase acuosa, con la consecuente desmineralizacin de la micela, as como la
disminucin de la ionizacin de las casenas y, como resultado, la disminucin de su
capacidad de complejacin,
- y la accin de enzi~nas proteoliticas que actan sobre las protenas micelares
provocando la desestabilizacin y ruptura del complejo micelar.
Aunque existe un gran nmero de proteasas capaces de deshacer el complejo
casenico, las ms interesantes son aquellas que, por su especificidad, permiten la
obtencin de un adecuado precipitado slido o cuajada. El coagulante ms utilizado y
E 3
25
CAPITULO I
INTRODUCCION
estudiado ha sido el cuajo o rennet, extracto enzimtico obtenido del estmago de
ternero cuyo componente enzimtico mayoritario es la quimosina o renina aunque
puede contener en pequea cantidad pepsina bovina (15-17). La renina es la proteasa
cida que acta especficamente sobre K-casena.
Todos los coagulantes adecuados como substitutos del cuajo para la fabricacin
de queso contienen una enzima perteneciente a las proteasas cidas, denominadas en
general reninas (EC 3.4.23 EC 3.4.4.3). Tanto las enzimas secretadas en forma de
zimgenos por las clulas del estmago de vertebrados, como las de origen microbiano
secretadas al medio en su forma activa, muestran una considerable homologa estructural,
as como similares mecanismos catalticos (18). Sus pesos moleculares oscilan entre
30.000 y 40.000 D, y muestran especificidad hacia la hidrolsis del enlace Phe
105-Met1~ de
casena K (19), aunque postenormente podrn participar en hidrlisis menos selectivas.
El estudio de la coagulacin por accin del cuajo ha permitido entenderla como
un proceso en dos rases. La primera fase o fase enzimtica en la que tiene lugar la
hidrlisis selectiva del enlace peptidico Phe105-Met,<,<~ de la casena ic. Como productos se
obtienen el caseinomacropptido, correspondiente al segmento 106-169, soluble en el
suero y la paracaseina ic de marcado carcter hidrofbico que, al contrario de lo que
ocurre con la casena ic , ya no es capaz de estabilizar al complejo casenico en presencia
de Ca. La segunda fase es la de coagulacin propiamente dicha, que consiste en el
desplegamientode las cadenapolipeptdicas, consecuenciade la solubilizacin de la zona
hidrofilica de la casena ic, que deja expuesto al medio el interior hidrofbico del
complejo micelar.
El resultado final de todo el proceso es la desestabilizacin del sistema
El trmino renina , utilizado para denominar a la citada enzima coagulante 14 crea
(rennin ~ en ingls> puede llevar a confusiones debido a que coincide con el dado a otra enzima sin
ninguna relacin como es la producida en el rin que desempea una importante funcin en el
mantenimiento de la tensin sanguinea <renin 9. Por ello Foltmann propuso el nombre de
quimosina (chymosin 9, introducido por Deschamps en 1940.
Fokmann, fi. <970) en Methods iii Enzymology. (Ed. Perlmann, IE. y Lorand, L)
Accademic Press, vol. XIX, 421-436
Deschamps, i.M. (1940). J. Pharmacie et Sciences Accesories, ParIs, 6, 412-420.
26
CAPITULO 1
INTRODUCCION
inicialmente homogneo y la formacin de dos fases una acuosa o suero en la que
permanecen solubles sales, azcares y algunas protenas y pptidos y un precipitado o
cuajada jnayoritariamente proteico.
Aunque en lamayora de las condiciones la hidrlisis de casena 1< y la coagulacin
tienen lugar prcticamente solapadas en el tiempo, es importante remarcar que la
coagulacin no es la consecuencia directa de la hidrlisis de casena ic, sino de las
interacciones entre las protenas cuando no se encuentran en equilibrio con el medio.
Por ello existen determinadas condiciones en la que el medio es capaz de estabilizar las
cadenas proteicas altamente hidrofbicas evitando su precipitacin. El incremento del
pH por enzima de 6,5, la disminucin de la temperatura por debajo de 15
0C o la
reduccin de la concentracin de Ca evitan la coagulacin a pesar de que la etapa
enzimtica haya tenido lugar en las citadas condiciones.
2.2. UTILIZACION DE DERIVADOS INMOVILIZADOS DE RENINA
Apesar de lo complejo del proceso de coagulacin de la leche, la posibilidad de
separar en el tiempo la etapa enzimtica de la de coagulacin propiamente dicha,
convierte al proceso en susceptible de la utilizacin de derivados inmovilizados de
enzimas. As, tratando la leche a menos de 150C con el derivado enzimtico tiene lugar
exclusivamente la hidrlisis enzimtica y el simple calentamiento provoca de forma
inmediata la coagulacin, siempre que el rendimiento de la etapa anterior haya sido
suficiente (Figura 1.6).
Desde el punto de vista industrial, la utilizacin de derivados enzimticos
inmovilizados en la produccin de queso ofrece dos ventajas muy importantes: permitir
la separacin del catalizador de la mezcla de reaccin en cualquier momento y evitar que
la enzima permanezca en el producto de la reaccin. De este modo:
- se puede ejercer un mejor control de la fase Inicial del proceso de coagulacin
pues, al alterar el tiempo que dure la proteolisis, se puede modificar el grado de
proteolisis inicial de la leche previa a la coagulacin, factor importante en el rendimiento
de la cantidad de cuajada por litro de leche,
- se facilita el control del proceso posterior de afinado del queso, pues la ausencia
del cuajo en el cogulo evita proteolisis no especificas,
27
CAPITULO 1 INTROBUCCION
- pennite obtener lactosueros libres de proteasas, cuya presencia dificulta el
procesamiento de estos productos secundarios para su posterior reutilizacin en
alimentacin animal, para enriquecer otros productos lcteos o para el aprovechamiento
de los componentes disueltos en l (lactosa, pptidos solubles, etc.).
- se abaratan los costes de produccin, ya que permite la reutilizacin de los
catalizadores al ser recuperados de la mezcla de reaccin por filtracin o centrifugacin,
o bien la posibilidad de realizar la primera fase del proceso en continuo con lo cual se
simplifica enormemente la produccin.
En definitiva, la utilizacin de derivados inmovilizados de estas enzimas facilita
la estandarizacin de la produccin y la homogeneizacin de las propiedades
organolpticas de los productos, permitiendo la reutilizacin del biocatalizador.
a D.E.
o~ 0
00 0
o
Suero
Cuajada
leche
0~
0D.E
00
o Q
nO
o
Figura 1.6. Sistema propuestopara la coagulacin de leche utilizando un derivado enzimtico inmovilizado:
DLc~ Derivado Enzimtico.
1 0C
lO C
lo < .c
4
20
0C
28
CAPITULO 1 INTRODUCCION
2.3. RENINA DE Mucor miehel
Son las enzimas fngicas de Mucor miehei, Mucorpusillus o Endothiaparasitica las
que presentan propiedades comparables o incluso mejores que las del propio cuajo (14).
Al comparar el extracto enzimtico obtenido del cultivo de Mucor miehel con el cuajo
se pueden citar que:
- el extracto de Mucor miehei es ms resistente que el cuajo al aumento de la
temperatura, as como a la alcalinizacin del medio.
- la intensidad y la especificidad de la actividad proteoltica hacia las distintas
casenas son del mismo orden en ambos extractos.
- la distribucin de la enzima entre cuajada y lactosuero es diferente: Mucor
miehei mantiene mayor actividad residual en suero y el cuajo presenta mayor
tendencia a permanecer en el precipitado.
La renina de Mucor miehei es una glicoproteina de peso molecular 34.000-39.000
D, con un 5,4% de azcares de los cuales los monoscaridos mayoritarios son glucosa
y galactosa (20). En su composicin de aminocidos 7 residuos corresponden a Lys y 42
y 15 respectivamente a Asp y Glu. Posee puentes disulfuro, sobre su centro activo no
aparecen Ser ni grupos sul/hidrilo (20). Su composicin en aminocidos muestra enormes
semejanzas con las de otras reninas.
Su actividad ptima la desarrolla a pH bajos (5,5-7,5) y es marcadamente ms
estable a pH entre 4,0 y 6,0.
Para la determinacin de la actividad hidroltica de las reninas se utiliza el
hexapptido Leu-Ser-Phe(NO,)-Nle-Ala-Leu-Ome que reproduce la secuencia de la
casena ic sobre la cual actan especficamente estas proteasas (21). De este modo se
evitan los mtodos indirectos de deteccin dela coaguacin que utilizan como substratos:
leche, leche semidesnatada, soluciones de casena, etc..
La actividad enzimtica ptima frente al hexapptido sinttico la ejerce a 63
0Cy
pH 4,7, obtenindose unos valores para sus parmetros cinticos de K,, 0,129 mMy K~
5,2 s (22).
29
CAPITULO 1
METODOS
METODOS
1 . ACTIVACION DE LOS SOPORTES
1 .1 . DISTINTAS ACTIVACIONES DEL SOPORTE DE AGAROSA
1 .1 .1 . PREPARACION DEL SOPORTE GLIOXIL-AGAROSA
El proceso de activacin consiste en la esterificacin de los grupos hidroxilo de la
agarosa comercial con glicidol (2,3-epoxzipropanol) y la posterior oxidacin de los grupos
glicol resultantes para dar lugar a gruposglioxio reactivos (7). La etapa de oxidacin es
la que permite el control estequiomtrico del proceso de activacin para obtener los
geles de agarosa con la densidad de grupos reactivos deseada.
Se procede del siguiente modo: A 150 ml de soporte agarosa (comercial)
empaquetado y suspendido en 30 ml de agua se le aaden 50 ml de NaOH 1,7 M con
28,5 mg/ml de NaB!
4. A continuacin se agrega, lentamente y con agitacin suave,
glicidol hasta una concentracin final de 2 M, controlando que la temperatura de la
mezcla se mantenga entre 20 y 25
0C. Transcurridas 18 horas con agitacin constante, se
filtra y lava el gel con agua abundante. En una segunda etapa se suspende el soporte
obtenido anteriormente en 1,5 1 de agi.ia y se le agrega la cantidad apropiada de una
solucin de NaJO
4 0,1 Mpara oxidar estequiomtricamente sus gruposglicol y obtener
la densidad de grupos glioxilo deseada. El consumo del agente oxidante tiene lugar en
90 minutos, transcurridos los cuales se lava con agua y se filtra el gel glioxil-agarosa
resultante.
1.1.2. PREPABACION DEL SOPORTE MANA-AGAROSA
Para la preparacin de los soportes MANA-agarosa (monoaminoetil-N-aminoetil-
agarosa) se parte de los soportes glioxil-agarosa (Apanado 1.1.1) con el grado de
activacin deseado. El proceso de activacin es el mismo con independencia de la
densidad de grupos activos del gel de partida.
30
CAPITULO 1 METODOS
Se procede del siguiente modo: Se suspenden 50 ml de soporte glioxil-agarosa en
una solucin de etilendiamina 2 M de pH 10,0, en relacin final 1:5 ~
manteniendo la mezcla con agitacin suave a temperatura ambiente durante 2 horas.
Transcurrido este tiempo se agregan 2 g de NaB!
4 continuando la agitacin 2horas ms
y se procede al lavado del gel, en primer lugar con tampn borato 0,1 M, NaCI 1 Mde
pH 9,0, a continuacin con tampn acetato 0,1 M, NaC 1 M de pH 4,0 y, por ltimo,
con agua, para obtener finalmente el gel MANA-agarosa con la misma densidad de
grupos reactivos del gel glioxil-agarosa de partida (23).
1 .1 3. PREPARACION DEL SOPORTE GLUTABLDEHIDO-AGAROSA
Para la preparacin de este soporte: Se suspende el gel MANA-agarosa en
tampn fosfato 0,2 M de pH 7,0 en relacin 1:1,8 (v:v) y, agitando suavemente, se le
aade glutaraldehtdo 25% hasta una relacin final 1:3 (v:v). Comprobando el
mantenimiento del pH y de la temperatura entre 18 y 20
0C, se dejan transcurrir 12-14
horas para filtrar y lavar con agua abundante y obtener el gel glutaraldehido-agarosa (24).
1 .1 .4. PREPABACION DE SOPORTES BDEAGAROSA
Se ha diseado un proceso de activacin del soporte de gel de agarosa con 1,4-
butanodiol-diglicidil-ter (BDE) basado en el seguido utilizando glicidol como diepxido
activador. El proceso es el siguiente:
9 Oxidacin directa del soporte agarosa 6B-CL comercial: Se suspende un volumen
de gel agarosa en agua en relacin 1:10 (v:v) y se trata con NaJO
4 0,1 M hasta la
oxidacin total (18-20 imoles ml gel). Alcanzado el consumo maximo de oxidante, se
fitra y se lava el soporte con agua abundante.
2 ~ Reduccin total: Se suspende el gel obtenido del paso anterior en tampn
bicarbonato SO mM de pH 10,0, relacin 1:10 (v:v) y se trata con NaB!4 hasta
concentracin 1 mg/ml supensin. Transcurridos 30 minutos de agitacin suave, se filtra
y se lava el soporte con tampn fosfato de pH 7,0 y con agua abundante.
39 Activacin con BDE: Se han preparado dos soportes diferenciados en el grado
de activacin, para ello se han realizado tratamientos utilizado dos concentraciones de
31
CAPITULO 1 METODOS
reactivo en el media de reaccin: Acada 10 ml de soporte obtenido en el paso anterior
se le aaden, en primer lugar 2 11,42 ml de agua, a continuacin 6,67 ml de solucin
de NaOH 1,48 Mcon NaB!
4 41,49 mg/ml y por ltimo y lentamente 10,45 1 ,05 ml de
BDE. El resultado es una suspensin en la que el agente activante se encuentre en
concentracin 2 0,2 M, segn el grado de activacin deseado. Despus de 18 horas de
agitacin suave a temperatura ambiente se filtra y se lava el soporte con agua.
49 Oxidacin mxima de cada soporte: Se suspende cada uno de los soportes
obtenidos en el paso anterior en relacin 1:10 (v:v) y se trata con NaJO4 0,1 M hasta la
oxidacin total (90 18 tmoles ml gel, respectivamente). Alcanzado el consumomximo
de oxidante, se fitra y se lava el soporte con agua abundante para obtener el
correspondiente gel BDE-agarosa.
1.1.5. PREPARACION DE SOPORTES DEXTRANO-AGAROSA
Se han diseado y sintetizado dos tipos de soportes de agarosa 6B-CL activados
con dextrano, a los cuales se les ha denominado:
- gel dextrano(oxidacin total)-MANA-agarosa-75 o gel dextrano-agarosa-I.
- gel dextrano(oxidacin parcial)-MANA-agarosa-20 o gel dextrano-agarosa-Il.
~ Preparaci6n del soporte dextrano-agarosa-I
1~ Se prepara gel MANA-agarosa 6B-CL de mxima activacin (75 Mmoles de
grupos amino por ml de gel) segn el mtodo descrito en el Apanado 1.1.2.
2~ Se prepara una disolucin de dextrano-10.000 3,33 mMen agua y se trata con
7,5 g de NaJO4 manteniendo la incubacin a temperatura ambiente hasta el consumo
total del oxidante, logrado lo cual se dializa frente a agua. De este modo se logra la
oxidacin total del dextrano, resultando una molcula polialdehdica de cadena larga.
39 Se disuelve TMAB en concentracin 1 50mM en tampn fosfato 100 mM de
pH 7,0y se le aade un volumen idntico de la solucin de dextrano oxidado. A la
solucin resultante se le incorpora el gel MANA-agarosa hasta una suspensin final 1 :1 0
(v:v). Se ha comprobado que despus de 2 horas de agitacin suave a temperatura
32
CAPITULO 1 MR~ ODOS
ambiente se alcanza el mximo de unin del dextrano oxidado al soporte, por lo que se
procede a la reduccin de los enlaces formados que no se hayan reducido durante la
incubacin con TMAB: para ello se diluye a la mitad l~ suspensin con tampn
bicarbonato 0,4 M de pH 1 0,0y se agregan 5 mg de NaB!
4 por ml de suspensin final.
Transcurrida media hora de incubacin se procede al filtrado y lavado con tampn
fosfato de pH 7,0 y luego con agua.
42 Para activar las molculas polifuncionales (polihidroxios) unidas al soporte, se
procede al tratamiento con glicidol del soporte obtenido en la etapa anterior siguiendo
el mismo mtodo que al activar la agarosa comercial (Apartado 1.1.1).
59 Para finalizar, una suspensin 1:10 (v:v) del gel obtenido en el paso anterior
se trata con NaJO4 0,1 Mdependiendo del grado de activacin final con grupos glioxilo
que se desee sobre el soporte (hasta un mximo de 450 gmoles/ml gel)
Preparacin del soporte dextrano-agarosa-Il
1~ Se preparagel MANA-agarosa 6B-CL con la mxima activacin permitida, por
oxidacin directa (sin activacin previa con glicidol de la agarosa comercial) y posterior
tratamiento con EDA: el resultado es un soporte con 18-20 gmoles de grupos reactivos
por ml gel.
2~ Se preparan disoluciones de dextrano-10.O0O 3,33 mMen agua y se tratan con
6,75, 6,0 y 3,75 g de NaJO4, manteniendo la incubacin a temperatura ambiente hasta el
consumo total del oxidante, logrado lo cual se dializa cada una frente a agua. De este
modo se logran oxidaciones del dextrano al 90, 75 y 50%, respectivamente.
3Q Se disuelve TMAB en concentracin 150 mM en tampn fosfato 100 mM de
pH 7,0 y se le aade un volumen idntico de la solucin de dextrano oxidado. A la
solucin resultante se le incorpora el gel MANA-agarosa-20 hasta una suspensin final
1:10 (v:v).comprobado que despus de 2 horas de agitacin suave cesa la desaparicin
de dextrano de la solucin por lo que se considera alcanzada la mxima carga de
dextrano sobre el soporte, por lo que se procede a la reduccin de los enlaces formados
que no se hayan reducido durante la incubacin con TMAB: para ello se diluye a la
mitad la suspensin con bicarbionato 0,4 Mde pH 10,0 y se agregan 5 mg de NaB!4 por
ml de suspensin final. Transcurrida media hora de incubacin se procede al filtrado y
33
CAPITULO 1 METODOS
lavado con tampn fosfato de pH 7,0 y luego con agua.
4Q Para finalizar, una suspensin 1:10 (v:v) del gel obtenido en el paso anterior
se trata con NaJO
4 0,1 M dependiendo del grado de activacin final con grupos glioxilo
que se desee sobre el soporte (hasta un mximo de 200 Mmoles/ml gel)
1.2. ACTIVACION DE SOPORTES TIPO RESINA
1 .2.1 . ACTIVACION DEL SOPORTE RESINA TOYOPEJ4RL. PREPARACION DE
SOPORTE GLIOXIL-TOYOP&4RL
El proceso de activacin es idntico al seguido para el gel de agarosa (Apartado
1.1), siendo su densidad la misma. La activacin mxima permitida es 100 p.moles de
grupos glioxilo por ml de soporte humedo bien filtrado.
1 .2.2. ACTIVACION DEL SOPORTE RESINA EUPERGT Y RESINA BJOSYNTH
Ambos soportes poseen grupas epxido reactivos por ello se sigue el mismo
proceso de activacin en ambos casos.
El soporte comercial se encuentra seco por ello es necesaria primeramente su
hidratacin e hinchamiento. Se pesa una cantidad de soporte seco, se pone en una
probeta y se le aade agua, agitando cada cierto tiempo para favorecer que el soporte
se humedezca totalmente y, de este modo, se hinche. El gel hmedo se podr almacenar
en nevera, una vez lavado con aguay filtrado con una placa porosa. Las correpondientes
densidades de los soportes hinchados y filtrados son: 0,8 g/ml para Eupergit y 0,77 g/ml
para Biosynth.
Preparacin de glioxil-resinas
Se prepara una suspensin 1:10 (v:v) de soporte hmedo bien filtrado en agua y
se agrega cido sulfrico hasta pH 2,0. Alas 14 horas de incubacin a 40
0C se filtra el
soporte, lavndolo con abundante agua. Acontinuacin se resuspende el soporte en agua
34
CAPITULO METODOS
1:10 y se le agrega NaJO
4 0,1 M segn la densidad de grupos aldehdo que se desee
obtener hasta un mximo de 190 gmoles/ml gel para Eupergit y 130 para Biosynth. El
consumo del agente oxidante tiene lugar en 90 minutos, transcurridos los cuales se lava
la glioxil-resina resultante con abundante agua y se filtra.
> Preparacin de MANA-resinas
El proceso es idntico que el seguido sobre el gel glioxil-agarosa (Apanado 1.1.2).
2. ENSAYOS PARA LA DETERMINACION DE LAS ACTIVIDADES ENZIMATICAS
2.1 . ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA RENINA
2.1 .1 . ENSAYO DE ACTIVIDAD HIDROLITICA
Se ensaya la actividad de esta proteasa usando el hexapptido Leu-Ser-Phe<NOJ-
Nle-Ala-Leu-OMe, propuesto por Raymond et al}20), como substrato de referencia, por
la semejanza de su secuencia con la zona de la casena itt sobre la que acta
especficamente esta enzima. La hidrlisis del enlace Phe(N02)-Nle permite el
seguimiento espectrofotomtrico de la actividad enzimtica gracias a la naturaleza
cromofrica del aminocido terminal Phe(N02) presente en uno de los tripptidos
liberados. Las condiciones ptimas del ensayo, determinadas en estudios posteriores por
Martin et al. (25), son: pH 4,7 y 310 nm (E= 1000 M .cm ).
El ensayo utilizado ha sido el siguiente: A2 ml de solucin de substrato 0,14-0, 16
mM en tampn acetato 0,1 M de pH 4,7, termostatizadas a 25
0C y con agitacin
constante, se les aaden 25-200 pl de solucin de enzima o de suspensin de derivado
enzimtico. El registro del incremento de absorbancia a 310 nm y 250C en funcin del
tiempo (AAbs.m~ ) permite determinar la velocidad inicial de hidrlisis en Unidades de
Actividad Hidroltica (una Unidad es la cantidad de enzima que es capaz de hidrolizar 1
xmol de hexapptido por minuto en las condiciones indicadas).
35
CAPITULO 1 MF1 ~ ODOS
2.1 2. ENSAYO DE ACTIVIDAD COAGULANTE
Se ha utilizado un ensayo original para la determinacin de la actividad
coagulante de la enzima en solucin o inmovilizada. Su importancia reside en la
posibilidad del seguimiento espectrofotomtrico del proceso, as como la posibilidad de
relacionar Actividad Hidroltica y Actividad Coagulante de la enzima.
El mtodo se basa en el aumento de turbidez, registrado a 550 nm, que se
produce al actuar la enzima sobre una solucin de casena c (26). Los cursos totales de
coagulacin de caseina itt, catalizados por esta enzima, son de tipo sigmoideo, con un
tiempo de latencia despus del cual se desencadena el proceso de agregacin registrado
por el aumento de absorbancia con luz visible.
Las condiciones experimentales del ensayo son: A 2 ml de solucin de casena K
1 mg/ml en tampon citrato 50 mM, NaCl 75 mMde pH 5,3, tennostatizada a 25
0Cy con
agitacin suave y constante, se le aaden 25-200gl de solucin enzimtica o de suspensin
de derivado, registrando el incremento de absorbancia por minuto (AAbs.min ),
producido a 550 nm como consecuencia de la reaccin.
Se ha definido como Tiempo de Coagulacin (s) al perodo transcurridodesde que
la enzima se agrega a la solucin de substrato hasta el instante en el que el curso de
coagulacin registrado alcanza su punto de inflexin. Se ha propuesto comoActividad
Coagulante (sl) de la enzima a la inversa del Tiempo de Coagulacin, siendo una Unidad
de Coagulacin la cantidad de enzima que coagula en 1 segundo 2 ml de disolucin de
casena itt 1 mg/ml en las condiciones experimentales estandarizadas.
2.2. ENSAYO DE ACTIVIDAD ENZIMATICA DE TRIPSINA
Se ha seguidoel ensayo publicado por Schwerty Takenaka (27). Se aaden 25-150
gl de solucin enzimtica o de suspensin de derivado a 2 ml de solucin de BAEE <Ncr-
benzoil-L-arginina-etil-ster) 0,5 M en tampn borato 0,1 M de pH 7,6 a 250C y con
agitacin suave, siguiendo el aumento de absorbancia que acompaa a la hidrlisis de
substrato sinttico a 253 nm (e=750 Mtcnv ). Una Unidad de actividad es la cantidad de
enzima que hidroliza 1 pinol de BAEE por minuto en las condiciones experimentales
indicadas.
36
4
CAPITULO 1 METODOS
3. SEMIPURIFICACION DE LA SOLUCION DE RENINA DE Mucor miehel
COMERCIAL
La semipurificacin de una solucin de ~extractocomercial de renina de Mucor
miehei se realiza por adsorcin inica sobre gel MANA-agarosa- 75 y posterior desorcin,
despus de abundantes lavados para eliminar del medio todo aquello que no se haya
unido al soporte, por aumento de la fuerza inica de la suspensin. Con este proceso se
pretende, sobretodo, la eliminacin de los azcares que pudiera haber en el extracto
comercial, para evitar posibles interferencias cuando se trate de oxidar la fraccin
glicosdica de la enzima.
El mtodo es el siguiente: Auna disolucin de extracto enzimtico comercial de
8 mg/ml en tampn fosfato 50 mMde pH 5,0 (1,44-1,6 U.H./ml) se le aade gel M4NA-
agarosa-75 en relacin 1:10 (v:v). Con agitacin suave y a temperatura ambiente (18-
20
0C) se sigue el proceso de adsorcin a travs de la medida de actividad del
sobrenadante hasta que la unin al soporte sea del 80-100%. Una vez lavado con
cantidad abundante del mismo tampn y filtrado, se resuspende el gel en relacin 1:10
en tampon fosfato 50 mM, NaCI 0,75 Mde pH7,0 y se agita suavemente durante 1 hora,
tiempo aproximado que tarda en liberarse al sobrenadante el 95% de la renina que se
haba adsorbido. La disolucin enzimtica semipurificada obtenida posee 1,09-1,22
U.H.Iml.
4. OXIDACION DE LAS CADENAS GLICOSIDICAS DE R.ENINA DEMucor miehel
La modificacin qumica de la glicoproteina se realiza sobre la solucin
enzimatica semipurificada obtenida segn elApartado 3. Una vez comprobadoque el pH
se mantiene en 7,0, se tratan porciones de esta solucin (que tendr el 85% de la renina
correspondiente a 8 mg de extracto comercial en cada m) con NaJO
4 0,1 M hasta una
concentracin final de 3,5 pinoles por U.H. (consumo mximo de oxidante por cada
unidad de actividad hidroltica). Cuando se desean oxidaciones parciales el volumen de
solucin de NaJO4 aadido se reduce hasta corresponder con 2,3 (para oxidacin al
65%), 1,05 (para oxidacin al 30%) y 0,52 pinoles de oxidante por U.H. de la solucin
(para oxidacin al 15%).
37
CAPITULO 1 METODOS
6. PREPARACION DE DERIVADOS ENZIMATICOS POR INMOVILIZACION
6.1 . PREPARACION DE DERIVADOS DE RENINA de Mucor miehel
Se han preparado gran cantidad de derivados de renina de Mucor miehel con cada
soporte, estudindose la influencia de todas las variables que podran afectar a cada ruta
de inmovilizacin:
- grado de activacin del soporte
- cantidad de enzima ofrecida
- temperatura de inmovilizacin
- duracin de la incubacin
- pH de la reaccin
hasta optimizar el proceso de inmovilizacin sobre cada tipo de soporte. En cada caso
la variacin de una determinada condicin queda bien explcita en la exposicin de los
resultados, por lo que para evitar la complicacion de la descripcin de los mtodos se
tratar la estrategia general de inmovilizacion.
El seguimiento del proceso de inmovilizacin, salvo que se indique lo contrario,
se realiza controlando la actividad enzimtica frente al substratosinttico (hexapptido).
Una vez finalizada la inmovilizacin, filtrado y lavado el derivado y resuspendido en las
condiciones ptimas se ensaya su actividad frente al substrato macromolecular (casena
i tt).
6.1.1. PREPARACION DE DERIVADOS DE RENINA SOBRE GLIOXIL-SOPORTES
(AGAROSA, TOYOPEARL,, ELJPERGJT Y BIOSYNTH)
Se prepara una solucin de extracto enzimtico en tampn bicarbonato 0,1 M de
pH 1 0,0, y, separndose una pequea fraccin como control del comportamiento de la
enzima en solucin, se aade el glioxil-soporte de grado de activacin elegido en relacin
1:10. Comprobando que el pH no se ha modificado y manteniendo homogenea la
suspensin, y constante la temperatura, se sigue el proceso de insolubilizacin
comparando actividades enzimticas de sobrenadante, suspensin y solucin enzimtica
38
CAPITULO 1
METODOS
control. Cuando se considera alcanzado el rendimiento deseado de inmovilizacin, se
agrega NaBH
4 en una concentracin final de 1 mg/ml de suspensin (10, 27); transcurrida
media hora a temperatura ambiente, o 1~hora si el tratamiento ha tenido lugar a 4
0C, se
procede al lavado con abundante tampn fosfato de pH 7,0 y posteriormente con agua.
6.1 .2. PREPARACION DE DERIVADOS DE RENINA SOBRE MANA-SOPORTES
El gel activado con grupos amino primarios accesibles permite la inmovilizacin
de enzimas a travs ya de los grupos carboxilo de su estructura polipeptdica, ya de las
cadenas glicosdicas previamente oxidadas cuando se trata de glicoenzimas, como es el
caso de la renina de Mucor mniehei.
Inmovilizacin de renina a travs de su fraccin proteica a MANA-soportes
El mtodo seguido ha sido el siguiente: Se prepara una solucin del extracto
enzimtico comercial en tampn acetato 50 mMde pH 5,0 y, separndose una pequea
fraccin como control del comportamiento de la enzima en solucin, se aade el gel
MANA-agarosa degradode activacin elegido en relacin 1:10. Comprobando que el pH
no se ha modificado y manteniendo homogenea la suspensin y constante la
temperatura, se sigue el proceso de insolubilizacin comparando actividades enzimticas
de sobrenadante, suspensin y solucin enzimtica control. Cuando se considera
alcanzado el rendimiento deseado de la adsorcin, se agrega directamente al medio de
reaccin CDI en la concentracin final elegida (1, 3 10 mM). Controlando el
mantenimiento de pH y temperatura y con agitacin suave se incuba durante 1,5 horas.
Transcurrido este tiempo se procede al lavado con abundante tampn acetatode pH5,0
y posteriormente con agua.
Para favorecer la desorcin de todo aquello que no se haya unido covalentemente
al soporte y poder determinar el rendimiento real de la inmovilizacin covalente, se
resuspende el derivado enzimtico resultante en tampn acetato 50 mM, NaC 0,75 mM
de pH 7,0, y se ensaya la aparicin de actividad hidroltica en el sobrenadante. Una vez
finalizada la desorcin, se lava el derivado con abundante cantidad de una solucin
tampn idntica a la utilizada en esta tercera etapa y despus con el mismo tampn sin
NaC.
39
CAPITULO 1 METODOS
> Inmovilizacin de renina a travs de su fraccin glicosdica a MANA-soportes
Basndose en estrategias de modificacin qumica de las cadenas de azcares de
glicoproteinas para su activacin y posterior inmovilizacin, se han desarrollado en
nuestro laboratorio diferentes mtodos de inmovilizacin a travs de estas cadenas
poliglicosdcas, una de ellas es la utilizada con la renina de Mucor miehei que se tratar
en el presente trabajo.
El mtodo seguido ha sido el siguiente: Se prepara una solucin semipurificada
de extracto enzimtico (Apartado 3) y oxidada en el grado deseado (Apartado 4), se
enfra hasta 4
0C y se diluye 1:1,5 con tampn bicarbonato 0,2 M de pH 10,0 a la misma
temperatura, comprobndose el mantenimiento de] pH a 10,0. Separando una pequea
fraccin como control del comportamiento de la enzima en solucin, se aade el MANA-
soporte de grado de activacin elegido en relacin 1:10. Comprobando que el pH no se
ha modificado y manteniendo homogenea la suspensin y constante la temperatura, se
sigue el procesode insolubilizacin comparando actividades enzimticasde sobrenadante,
suspensin y solucin enzixntica control. Cuando se considera alcanzado el rendimiento
deseado de inmovilizacin, se agrega NaB!
4 en una concentracin final de 1 mg/ml de
suspensin; transcurrida media hora a temperatura ambiente, o 1 hora si el tratamiento
ha tenido lugar a 4
0C, se procede al lavado con abundante tampn fosfato de pH 7,0 y
posteriormente con agua.
6.1.3. PREPARACION DE DERIVADOS DE RENINA SOBRE GEL
GLUTARALDEHIDO-AGAROSA
El mtodo seguido ha sido el siguiente: Se prepara una solucin de extracto
enzimtico comercial en tampn adecuado 0,1 M de pH 5,5-8.5. Separndose una
pequea fraccin como control del comportamiento de la enzima en solucin, se aade
el gel glutaraldehdo-agarosa de grado de activacin elegido y en relacin 1:10.
Comprobando que el pHno se ha modificado y manteniendo homogenea la suspensin
y constante la temperatura elegida, se sigue el proceso de insolubilizacin comparando
actividades enzimticas de sobrenadante, suspensin y solucin enzimtica control.
Cuando se considera alcanzado el rendimiento deseado de inmovilizacin, se agrega
NaBH
4 en una concentracin final de 1 mg/ml de suspensin; transcurrida media hora
a temperatura ambiente o 1 hora si el tratamiento ha tenido lugar a 4
0C, se procede al
40
CAPITULO 1
MErODOs
lavado con abundante tampn fosfato de pH 7,0 y posteriormente con agua.
6.1 .4. PREPARACION DE DERIVADOS DE RENINA SOBRE GEL BDE-AGAROSA
Se prepara una solucin de extracto enzimtico en tampn bicarbonato 0,1 Mde
pH 10,0, y, separndose una pequea fraccin como control del comportamiento de la
enzima en solucin, se aade el gel BDE-agarosa con grado de activacin elegido (18
90 pinoles de grupos reactivos/ml gel) en relacin 1:10. Comprobando que el pH no se
ha modificado y manteniendo homognea la suspensin y constante la temperatura, se
sigue el proceso deinsolubilizacin comparandoactividades enzimticasde sobrenadante,
suspensin y solucin enzimtica control. Cuando se considera alcanzadoel rendimiento
deseado de inmovilizacin, se agrega NaB!
4 en una concentracin final de 1 mg/ml de
suspensin; transcurrida media hora a temperatura ambiente, o 1 hora si el tratamiento
ha tenido lugar a 4
0C, se procede al lavado con abundante tampn fosfato de pH 7,0 y
posteriormente con agua.
6.1 .5. PREPARACION DE DERIVADOS DE RENINA SOBRE GELES DEXTRANO-
AGAROSA
Se ha preparado dos tipos de derivados de renina de Mucor miehei por haberse
utilizado dos soportes que se diferencian en el mtodo de activacin de agarosa con
dextrano (Apartado 1.1.5). El proceso de inmovilizacin es idntico al seguido para los
derivados enzimticos sobre soportes activados con grupos glioxilo (Apartado 6 1.1).
6.2. PREPARACION DE DERIVADOS DE TRIPSINA SOBRE GLIOXIL-SOPORTES
(AGAROSA, TOYOPEJ4RL, EUPERGIT Y 1JIOSYNTH)
Sobre cada uno de los soportes (agarosa 6B-CL, agarosa 1OB-CL, Toyopearl,
Eupergit y Biosynth) se preparan dos tipos de derivados: unos en los cuales la
inmovilizacin tendr lugar en condiciones suaves (en presencia de benzamidina como
inhibidor) para evitar al mximo prdidas de actividad enzimticas y teniendo como
objetivo la carga enzimtica mxima que permita el soporte; y otros derivados que, una
vez inmovilizada la cantidad de enzima deseada, se incubarn en condiciones que
41
CAPITULO 1 ME~ ODOS
favorezcan la multiinteraccin de cada molcula con el soporte, independientemente de
lo que ocurra con la actividad de la enzima inmovilizada. La finalidad de los primeros
es el estudio de la mxima capacidad de carga para la determinacin de las densidades
especficas de grupos reactivos de soportes con diferente morfologa interna (Resultados,
3.2.1). Los segundos han permitido la determinacin del grado de congruencia
geomtrica con la enzima permitido por cada soporte en trminos relativos.
El mtodo seguido ha sido el siguiente: Se disuelve tn~sina comercial en una
solucin de benzamidina 2 mM en tampn borato 0,1 M de pH 10,0, se separa una
pequea fraccin como control del comportamiento de la enzima en solucin, se aade
el glioxil-soporte de grado de activacin elegido en relacin 1:10. Comprobando que el
pH no se ha modificado y manteniendo homogenea la suspensin a temperatura
ambiente, se sigue el proceso de insolubilizacin comparando actividades enzimticas de
sobrenadante, suspensin y solucin enzimtica control. Cuando se considera alcanzado
el rendimiento deseado de inmovilizacin, se agrega NaB!
4 en una concentracin final
de 1 mg/ml de suspensin; transcurrida media hora a temperatura ambiente, se procede
al lavado con abundante tampn fosfato de pH 7,0 y posteriormente con agua.
Cuando se pretende aumentar el nmero e intensidad de las interacciones entre
cada molcula de enzima inmovilizada y el soporte, se procede del siguiente modo: una
vez que se ha logrado la mxima carga enzinitica, se filtra el derivado y se lava
lentamente con tampn borato 0,1 M de pH 10,0 abundante para segurarse de la
eliminacin del inhibidor, se incuba en este mismo tampn en relacin 1:10 y se sigue
el transcurso del proceso de interaccin enzima-soporte a travs de la medida de la
actividad enzimtica remanente del derivado. Transcurrido el tiempo considerado
necesario (en algunos casos varios das) se procede a la reduccin con NaB!4 segn se
ha descrito para los derivados de renina.
42
CAPITU LO 1
T1 FSULTADOS YDISCUSION
RESULTADOS Y DISCUSION
1. ENSAYO PARA LA DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD COAGULANTE DE
RENINA
Como se ha tratado en la Introduccin, la coagulacin es un complejo proceso
que no slo esta determinada por la actividad hidroltica de la enzima sino por una serie
de factores interrelcionados que todava no se conocen totalmente, que dan ]ugar a la
formacin de un precipitado proteico. Identificadoel enlace de la casena itt sobre el que
actan especficamente las enzimas caseinolticas y conocida la posibilidad de separacin
de la reaccin enzimtica del posterior proceso de formacin del cogulo, consecuencia
del primero, se han sintetizado diferentes pptidos que incluyen el enlace Phe-Met de la
casena itt para el estudio de la relacin estructura del substrato con la espefificidad de
la enzima (29) y para ser utilizados en la determinacin de la actividad enzimtica real
de la enzima (actividad hidroltica) y de los factores que afectan al proceso enzimtico
y no a los procesos posteriores en los que no participa el biocatalizador.
As se propuso e] bexapptido Hleu-Ser-Phe(NO9-Nle-Aa-Leu-Ome como
substrato referenciapara la determinacin de la actividad proteoltica de renina (21, 30).
Este pptido fcilmente hidrolizado por esta enzima contiene una sonda espectroscpica
Phe(N0
2) por lo que proporciona un mtodo directo y reproducible para los estudios de
actividad enzimtica.
Sin embargo el substrato natural de la enzima, casena, es un substrato de gran
complejidad. Cuando la enzima sufre algn tipo de proceso que de lugar a modificacin
qumica o estructural, o a disminucin de la disponibilidad fisica de su centro activo, etc.
sus propiedades catalticas pueden reflejar diferentes consecuencias dependiendo del
substrato a] que se refieran. Se puede preveer que e] substrato voluminoso se ver ms
afectado por las modificaciones de la enzima que el substrato sinttico el cual
manifestar slo aquellas que afecte al centro activo. Por ello hemos considerado
imprescindible para el estudio de la inmovilizacin de esta enzima que acta sobre una
substrato macromolcular como la casena K el disponer de dos ensayos que premitan
43
CAPiTULO 1 BFSULTADOS YDISCUSION
relacionar laActividad Coagulante de casena itt (hidrlisis enzimtica + agregacin) con
la correspondiente Actividad Hidroltica frente al hexapptido sinttico. Para lo cual lo
primero sera disponer de un ensayo de actividad coagulante objetivo y reproducible.
El diseo de un ensayo adecuado para la cuantificacin de la actividad coagulante
de estas proteasas que hidrolizan especficamente la casena itt se ha basado en la
observacin de que la accin de estas enzimas sobre una disolucin de dicha protena
lctea a 25
0C provoca un aumento progresivo de la turbidez que culniina con la
coagulacin (26). El registro del incremento de absorbancia (X4bs.mirt) a 550 nm,
muestra un curso total de tipo sigmoideo: un perodo de latencia inicial durante el cual
el valor de la absorbancia permanece constante, seguido por un repentino incremento
exponencial del mismo que alcanza un punto de inflexin despus del cual la velocidad
del aumento de absorbancia disminuye hasta prcticamente anularse (Figura 1.7).
+1 .een
O .20@
U U OIV. )
- u . 1 II ___________
Figura 1.7. Registro espectrofotomtrico del incremento de absorbancia en funcin del tiempo a 550 nm
experimentado por una disolucin de casena itt tratada con renma.
Este proceso se ajusta a un modelo en el que el perodo de latencia inicial
correponde a la etapa enzimtica (hidrlisis especfica de la molcula de casena K para
dar para-itt-casena y un macropptido). La fase posterior de incremento exponencial de
la absorbancia es debida a la segunda etapa del proceso global: insolubilizacin,
agregacin y precipitacin, que se desencadena al alcanzarse una determinada
concentracin crtica de para-itt-casena, por encima de la cual no es estable en solucin.
44
CAPITULO 1 RESU LTADOSYDISCU SION
Una vez que ha tenido lugar la coagulacin propiamente dicha, la mezcla de reaccin
inicial se transforma en una suspensin del precipitado en la fraccin soluble por lo que
cesa el incremento de la absorbancia en el medio.
Se ha definido como Tiempo de Coagulacin (TC) al perodo transcurrido desde
que se aade la muestra de enzima a la mezcla de reaccin hasta que el curso del
proceso seguido a 550 nm alcanza su punto de inflexin. Representando grficamente
1 ITC frente a la concentracin de enzima en la cubeta de reaccin se observa
proporcionalidad, manteniendo constantes la temperatura del ensayoy la concentracin
de casena itt (Figura 1.8).
12
o,
a)
a,
a
o
r
a>
4-
c
C O
o)
< u
o
o
0
< u
4-
o
dcc
9
6
3
0
Cantidadde protena (mg)
FiguraLS. Representacingrfica de la actividad coagulante frente a la cantidad de protena del extracto
enzimtico de renina de M miehez.
Ello indica que existir para unas condiciones de reaccin determinadas una
concentracin crtica de producto (para-itt-casena) por encima de la cual se desencadena
el proceso de coagulacin, y en consecuencia manteniendo condiciones de reaccin
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5
45
CAPITU LO 1 RESU LTADOSYDISCU STON
estandarizadas (pH, temperatura, agitacin y concentracin de substrato) el tiempo
necesario para alcanzar dicho grado de hidrlisis de casena itt es inversamente
proporcional a la concentracinde enzima activo.
Se ha definido como Actividad Coagulante a la inversa del Tiempo de
Coagulacin: 1ITC. Una Unidad de Actividad Coagulante es, por tanto, la cantidad de
enzima que hace que 1 mg de casena itt alcance el punto de mxima pendiente (punto
de inflexin) en 1 segundo en las condiciones estandarizadas para el ensayo. Susvalores
se expresarn en: ~
El disponer de ensayos sencillos, objetivos y reproducibles, para la medida de las
actividades hidroltica y coagulante, permite relacionar ambas, para cuantificar los efectos
de procesos como modificaciones qumicas o la inmovilizacin y que podran afectar en
diferente medida a la actividad enzimtica en funcin del volumen de la molcula de
substrato sobre el que acte.
Se ha denominado Actividad Coagulante Remanente (A.C.R.) a la relacin entre
la Actividad Coagulante que conserva un derivado enzimtico y la Actividad Coagulante
terica que le correspondera si se tratase de la enzima en su estado nativo, calculada
por extrapolacin en la curva patrn partir de la Actividad Hidroltica que posee. Este
valor de A. CR. es el que se ha manejado a la hora de cuantificar la eficacia como
coagulantes lcteos de los derivados enzimticos preparados, expresado en porcentaje.
2. CARACTERIZACION DEL EXTRACTO COMERCIAL DE Mucor miehel
La aplicacin de diferentes estrategias de inmovilizacin a una enzima requiere
el conocimiento del comportamiento de la enzima en solucin, as como del intervalo de
condiciones experimentales en el que el manejo no afecte a sus propiedades catalticas.
Por ello se ha realizado un estudio inicial sobre el extracto enzimtico para conocer su
actividad cataltica y su estabilidad en las condiciones de preparacin de derivados.
Se ha determinado un contenido proteico de este extracto del 26-30% y una
actividad hidroltica de 0,18-0,2 U.H. por mg de extracto, lo cual < la un valor de actividad
especfica de 0,6-0,77 U.H. por mg de protena.
46
CAPITU LO 1 RESU LTADOSYDISCU SION
Para conocer los margenes de manejabilidad de la enzima y la posibilidad de
aplicacin de las diferentes estrategias de inmovilizacin propuestas se ha estudiada la
estabilidad de diferentes soluciones enzimticas en las condiciones ptimas para cada
reaccin de inmovilizacin. Por ello se han realizado incubaciones de la enzima a pH 5.0,
7,0 y 10,0 pues son los ideales para cada una de ellas.
100
a>
4-
e
a)
e
(u
E
a>
1-
(u
.9
4-
o
1-
:2
0
(u
4-
o
75
50
25
o
20
tiempo (horas)
Figura 1.9. Cursos de inactivacin trmica de renina de Mucor miehei en tampn acetato 50 mM de PH
5,0 a 65
0C (.), en tampn fosfato 50 mM de pH 7,0 a 400C (O) y en tampn bicarbonato 50 mM de pH
10,0 a 330C (U ) .
La renina de Mucor mit/tel conserva el 100 % de su actividad enzimtica durante
24 horas a 250C en medio acuoso en el intervalo de pH entre 5,0 y 10,0. En este
intervalo de pHes tanto ms estable trmicamente cuanto ms cido es el medio, segn
se muestra en la figura 1.9, la incubacin a pH 5,0 conserva toda su actividad inicial
0 5 1 0 1 5
47
CAPITU LO Y RESU LTADOSY DISCUSJON
Se han obtenido derivados con la suficiente cantidad de enzima inmovilizada en
los que la unin al soporte no ha afectado a la actividad enzimtica de las molculas
(A.H.R.100%). Para ello ha sido necesario diminuir la temperatura de incubacin,
acortar el tiempo de contacto o reducir la densidad de grupos reactivos sobre el soporte,
pues ello supone la disminucin de la reactividad de los grupos implicados en el proceso,
comose refleja en los menores rendimientos de inmovilizacin que van de un 95% a tan
solo el 5-7% de la enzima ofrecida al soporte. Por el contrario, cuando la inmovilizacin
tiene lugar a 20
0C sobre un soporte muy activado la interaccin es tan intensa que,
inclusosiendoel tiempo de contacto corto, el derivado pierde actividad enzimtica frente
al hexapptido (A.H.R.=75%). Puesto que la enzima en solucin es estable en las
condiciones de la reaccin, se puede suponer que la inactivacin ser debida a la
interaccin con el soporte.
Esto quiere decir que al suavizar las condiciones de inmovilizacin la enzima sufre
menos en la interaccin, por permitirse una mejor adaptacin al soporte de cada
molcula que se insolubiliza, la reversibilidad de cada uno de los enlaces formados evita
segundas interacciones que supongan distorsin de la enzima y, en consecuencia,
favorece las que menos afecten a su estructura 3D. El resultado del proceso supone la
unin covalente a un soporte de molculas de enzima que conservan el 100% de su
actividad enzimtica (A.H.R.).
En cuanto a ]a actividad enzimtica de los derivados preparados medida frente
al substrato natural (A.C.R.), la tabla muestra que la optimizacin del proceso de
inmovilizacin hasta que no refleje prdidas en laactividad hidroltica remanente duplica
la actividad coagulante remanente. Sin embargo suavizando al mximo las condiciones
de preparacin del derivado (mnimo grado de activacin del soporte, interaccin corta
y a temperatura baja) la citada actividad no supera el 2,38% con respecto a la que
debera mostrar la enzima en solucin con su misma actividad hidroltica. Cuando el
derivado se prepara sin control del proceso de interaccin su actividad coagulante
remanente es menor del 0,5%.
Los resultados podran estar confirmando ]o que hasta ahora haban sido meras
suposiciones racionales del impedimento estrico que debera suponer la inmovilizacin
de una protena para la interaccin con su ligando cuando ste es una molcula
voluminosa. En las condiciones de reaccin ms suaves, la reactividad es tan baja que
pocos grupos de cada molcula estaran participando de la unin y por lo tanto la
50
CAPITU LO 1 RESU LTADOSYDISCU SION
inmovilizacin supondra la mnima modificacin qumica de la enzima, que no afecta
a la conformacin activa pues su actividad hidroltica se conserva. Sin embargo perjudica
a la actividad cataltica sobre casena, lo cual implica~que de algn modo se ha visto
afectada bien la accesibilidad de este substrato al centro activo, bien alguna zona de
reconocimientodiferente del centro activo que slo participa en el proceso cataltico con
el substrato natural y que cuando la enzima est en solucin se encuentra inalterada. El
valor de A.C.R. que se utiliza se refiere a la actividad coagulante que mostrara la
enzima en solucin si mostrase la misma actividad hidroltica que el derivado objeto de
estudio.
Dada la importancia de la suavidad en las condiciones de inmovilizacin a la hora
de lograr no slo buenas actividades hidro]ticas {A.H.R.), sino tambin mejores
actividades coagulantes, el abordaie de las si2uientes estrate2ias de inmovilizacin se
llevar a cabo buscando la mnima interferencia por oarte del soporte
.
3.1.2. INMOVILIZACION A TRAVES DE LOS GRUPOS CARBOXILO
SUPERFICIALES (Mp y/o GLa) DE LA ENZIMA SOBRE SOPORTE MANA-AGAROSA
Para que un grupo carboxilo sufra el ataque nucleofilico de un grupo amino (pK
10,2), el primero ha de ser activado con CDI y el grupo amino deber encontrarse en
e] medio adecuado para ser reactivo, sin embargo el pH ptimo del medio para cada uno
de los dos procesos es muy diferente: pH cido para la activiacin del carboxilo y pH
bsico que confieraal grupo amino la nucleofilia necesaria. Los soportes MANA-agarosa
se encuentran activados con grupos amino primarios con un pK cercano a 6,8 debido a
la presencia de un segundo grupo amino secundario muy prximo, esto hace posible que
su reaccin pueda tener lugar a pHms bajos a los cuales los grupos carboxilo s podrn
ser activados.
> Efecto de la inodiflcacin qumica con c arbodilmida (CDI) sobre la actividad y
estabilidad de la enzima en solucin
Para la inmovilizacin de la enzima sobre soporte MANA-agarosa, sera
imprescindible la activacin de los carboxilos con CDI a pH ligeramente cido debido
la estabilidad y reactividad de este agente. Para evaluar la posibilidad de aplicacin de
51
CAPITU LO 1 RESU LTADOSYDISCU SION
esta estrategia de inmovilizacin sobre la enzima en cuestin, es necesario un estudio
previo del efecto que sobre la enzima en solucin causara la modificacin qumica con
CDI; este estudio tambin ser til para dar una idea del intervalo de concentraciones
y/o temperatura que permiten buena manejabilidad de la enzima.
Habindose puesto de manifiestola alta estabilidadde la enzima en medios cidos
(Apartado 2), se ha estudiado el efecto que sobre la enzima en solucin tendr la
modificacin qumica con CDI en las condiciones en las que tendr lugar la reaccin de
inmovilizacin. En la figura 1.10 se muestran los resultados de la incubacin de una
solucin del extracto enzimtico con tres concentraciones de CDI, a travs de la
representacin de las actividades remanentes tanto hidroltica como coagulante en
funcin del tiempo de incubacin transcurrido cuando el tratamiento tiene lugar a 4
0C.
loo
a,
4-
a,
c
(u
E
a,
5-
< u
< a
4-
10
E
e
a,
(u
.5
4-
< a
sc
75
50
25
o
20
tiempo <horas)
Figura 1.10. Efecto de la modificacin qumica con CDI sobre las actividades bidroltica (s) y coagulante
(e) de renina de Mucor mfrhei, siendo las concentraciones de CDI en el medio de l.I0~ M (. . . ), 3.11V M
() y l.102 M (a.). Condiciones de incubacin: Solucin enzimtica en tampn acetato de pH 5.0 a 40C.
L _
4
0 5 1 0 1 5
52
CAPITU LO Y
RESULTADOS Y DISCUSION
De este estudio se obtienen tres importantes resultados:
- La prdida de actividad ocasionada por la CDI es tanto ms importante
cuanto mayor es la concentracin de agente en el medio.
- El efecto inactivante se manifiesta en las dos primeras horas de
incubacin.
- La modificacin qumica afecta en mayor grado a la actividad enzimtica
medida frente al substrato macromolecular.
En relacin con el ltimo de los resultados se podra pensar en que la
modificacin qumica tiene un efectomuy diferente sobre el reconocimiento de cada uno
de los substratos: casena K y hexapptido sinttico. Al ser la primera una molcula
voluminosa, la unin a la enzima podra tener lugar con la participacin adicional de
alguna zona alejada del centro activo cuya modificacin (p.c. por tratamiento con CDI)
no afecta sin embargo al reconocimiento del substato sinttico.
Efecto de la fuerza nica del medio sobre la actividad de la enzima en solucin
La preparacin de derivados enzimticos sobre gel MANA-agarosa supone la
utilizacin de un soporte ionizable.
Cuando la inmovilizacin se realiza sobre el soporte glioxil-agarosa, la unin
covalente de la enzima al soporte implica la desactivacin de la superficie de dicho
soporte por la reduccin de los grupos aldehdo reactivos dando lugar a grupos hidroxilo
inertes; sin embargo al utilizar soportes MANA-agarosa los gruposamino del soporte que
no han reaccionadocon la enzima permanecen intactos sobre su superficie. Cuando estos
derivados son incubados en las mezclas de reaccin de cualquiera de los dos substratos
en los que el pH es cido, se producirn interacciones electrostticas entre estos grupos
del soporte y de los grupos carboxilo que no hayan reaccionado, las cuales podran
afectar a la conformacin activa de la enzima.
Para eliminar dichas interacciones de naturaleza electrosttica y poder analizar
nicamente el efecto que, sobre la conformacin activa de la molcula, tiene la
inmovilizazin -covalente, se ha de ensayar la actividad enzimtica de los derivados
obtenidos en medios con alta fuerza inica. Por ello se ha credo conveniente el estudio
53
CAPITU LO RESU LTADOSYDISCU SION
del efecto del incremento de la fuerza inica sobre las actividades enzimticas de la
enzima en solucin para poder relacionarlo posteriormente con el provocadosobre cada
derivado enzimtico.
Se ha estudiado cmo afecta la presencia de NaO 0,5 M en ambos ensayos
enzimticos, mostrndose una total independencia de la actividad hidroltica ante el
aumento de la fuerzainica del medio de reaccin y una caida de la actividad coagulante
al 29% frente a las condiciones de reaccin estndar.
En condiciones estndar se ha comprobado la propocionalidad de la actividad
coagulante en funcin de la cantidad de enzima (Figura 1.8). La representacin de las
actividades coagulantes medidas en un medio con alta fuerza inica (NaCl 0,SM) en
funcin de la cantidad de enzima vuelve a manifestar dicha proporcionalidad pero con
una importante disminucin de la pendiente de la curva debido precisamente a esta cada
de actividad coagulante al 29% que supone la presencia de alta concetracin de NaC
(Figura 1.11).
12 -
o,
a,
CA
o
e
(u
o>
(u
o
o
(u
o
9 --
6-
01 . 0
o 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5
Cantidad de protena (mg>
Figura1.11. Representacin grfica de la actividad coagulante frente a lacantidad de protena del extracto
enzmitico de renina de M. miehei, en un medio de reaccin estndar (o) y en un medio de reaccin con
NaC 0,5 M (o).
54
1 1 1
CAPITU LO 1
RESU LTADOSYDISCU SION
Ya en la bibliografia se recoge este efecto de la fuerza inica sobre la
coagulacin, el cual no afecta a la reaccin enzimtica de hidrlisis sino a los
mecanismos que desencadenan la precipitacin de la casena. Probablemente los iones
Na~ y CV actan estabilizando la fraccin p-K-casena evitando su insolubilizacin. es
necesaria un mayor rendimiento de la etapa enzimtica para que la fuerza inica no sea
capaz de estabilizar el producto y que la coagulacin se desencadene (26).
Se han estudiado todas la condiciones que afectan al proceso (31): temperatura
y duracin de la adsorcin, concentracin adecuada de CDI, densidad de grupos
reactivos en el soporte y multiinteraccin inica, hasta obtener los derivados mostrados
en la tabla 1.2. Las condiciones de incubacin seleccionadas han favorecido la interaccin
suave. En todos ellos se comprob el mantenimiento de toda la actividad de la enzima
inmovilizada en lo que respecta a hidrlisis del substrato sinttico (A.H.R.).
Condiciones experimentales: 55 mg extracto enzimtico comercial ofrecidos por
tratamiento con CDI); 0,5 horas (adsorcin) y CDI 1.Z0M.
(a) /Imoles de grupos amino primarios por ml de gel.
(b) Cantidad de enzima adsorbida/inmovilizada covalentemente con respecto a la cantidad de enzima ofrecida
y activa en las condiciones del proceso.
(c) Actividad Hidroltica Remanente: Actividad hidroltica ensayada con respecto a la cantidad de enzima
inmovilizada en cada derivado.
(ti) Solucin de substrato estndar
(e) Solucin de substrato con NaC 0,SM
Tabla 1.2. Derivados enzimticos de reuma de Mucor me/tel preparados por inmovilizacin sobre los
soportes M4NA-agarosa.
55
ml gel; 40C(adsorcin y
CAPITU LO 1
RESULTADOS YDISCU SION
La adsorcin de la enzima a los diferentes soportes ha tenido lugar a 4
0C en 1
hora, obtenindose los rendimientos expresados en la tabla. Se comprob que
prolongacin de la incubacin no aumenta los rendimientos. Despus del tratamiento
con CDI i.iO~ M a la misma temperatura durante 1,5 horas se han incubado los
derivados en un medio al mismo pH con NaC 0,5 Mpara favorecer la desorcin de las
molculas de protena que no se hubiesen unido covalentemente al soporte, despus de
lo cual el rendimiento final de la inmovilizacin ha sido calculado: 26, 12 y 5%,
respectivamente sobre los soportes de grado de activacin 75, 30 y 15 moles de grupo
por ml gel.
Los tres derivados obtenidos se ensayaron frente al substrato sinttico en
condiciones estndar y en un medio con alta fuerza inica para deshacer las posibles
interacciones electrostticas entre la fraccin de grupos amino del soporte que, en las
condiciones del ensayo (pH 4,7) se encuentren ionizados y los grupos carboxilo
superficiales de la enzima que no han reaccionado covalentemente. En la tabla 1.2 se
puede ver que todos los derivado conservan la actividad hidroltica las molculas
inmovilizadas, siempre que se eliminen las interacciones electrostticas enzima soporte.
Son los derivados B y C los que conservan mayor actividad (70-67% frente al 44% del
derivado A) cuando la interacciones inicas tiene lugar, debido precisamente a que son
los que poseen sobre su superficie menor densidad de grupos reactivos y, por tanto
ionizables, lo cual permite menor multiinteraccin inica entre las molculas
inmovilizadas y el soporte.
Se ha estudiado tambin la actividad de estos derivados frente a la casena ic
usando la solucin de substratoestndar y la solucin de substratocon alta fuerza inica.
Los resultados se representan en la tabla 1.3.
A pesar de que la actividad de la enzima inmovilizada sobre estos soportes,
medida frente al substrato pequeo, se mantiene intacta, su actividad frente al
macrosubstrato, tambin en ausencia de interacciones electrostticas, disminuye
enormemente (5,63, 7,14 y 4,76 %). El efecto de la multiinteraccin electrosttica es
independiente de la densidad de grupos reactivos del soporte.
Esta nueva orientacin conferida alaenzima permite obtenerderivados tres veces
ms activos que los preparados sobre soporte glioxil-agarosa (Apartado 3.1.1), si bien
estos derivados enzimticos obtenidos por inmovilizacin sobre soporte MANA-agarosa
tienen poca actividad coagulante de casena ic.
56
CAPrrU LO 1
RESULTADOS YDISCU SION
DERIVADO grado activacin
soporte (a)
A.C.R. (%> (b)
(c) <d)
A 75 7,78 5,63
B 30 3,45 7,14
C 15 2,78 4,76
Condiciones experimentales: las mismas de la tabla .2.
<a) imoles de grupos amino primarios por ml de gel
(b) Actividad Coagulante Remanente: Actividad coagulante ensayada con respecto su actividad hidrlitica
ensayada en cada deriCvado.
(c) Solucin de substrato estndar
(d) Solucin de substrato con NaC 0,5 M.
Tabla 1.3. Actividades remanentes hidrolitica y coagulante de los derivados enzimticos de renina de Mucor
miehei preparados por inmovilizacin sobre los soportes MANA-agarosa.
3.13. INMOVILIZACION A TRAVES DE LOS GRUPOS AMINO DE BAJO pK DE LA
ENZIMA SOBRE SOPORTE GLUTAIt4LDEHIDO-.4GAROSA
La gran reactividad de los soportes activados con glutaraldehdo permite que a pH
neutro los grupos amino de pK bajo, como el amino tenninal de la cadena peptdica, y
posiblemente algn otro que por su disposicin en la estructura pudiera ver reducido su
pK, puedan atacar nucleofilicamente dichos grupos del soporte y dar lugar a enlaces
irreversibles (Introduccin, Apartado 1).
Para la preparacin de los derivados de renina inmovilizada sobre soportes
glutaraldehdo-agarosa se han elegido las condiciones de reaccin que permiten la
inmovilizacin menos intensa, de modo que la actividad hidroltica del hexapptido no
se vea afectada por la inmovilizacin, suavizando progresivamente todas la variables que
afectan al proceso: densidad de grupos reactivos del soporte, pHdel medio, temperatura
y duracin de la interaccin. En la tabla 1.4 se recogen las condiciones de preparacin
y los resultados de actividad enzimtica remanente de algunos de los derivados
preparados.
La utilizacin de un soporte poco activado (5 Mmoles de grupos reactivos por ml
de gel) y en un medio en el que el pH confiere baja reactividad a los grupos implicados
57
CAPITU LO 1
RESULTADOS Y DISCUSION
en la unin, ha permitido la inmovilizacin de suficiente cantidad de enzima con una
actividad coagulante remanente que alcanza el 33% de la actividad con respecto a la
enzima soluble con la misma actividad hidrlitica.
grado
activacin
soporte (a)
pH (
(
9C)
(
(h)
Rend~
< b)
A.H.R.
(%) (c)
A.C.R.
(%) Cd)
75 7,5 4 0,5 91 13 2,78
30 7,5 4 0,5 93 16 2,5
30 6,5 4 0,5 93 21 5,1
5 7,5 20 1 53 28 33,3
5 6,5 10 8 34 14 33.3
(a) unoles de grupos reactivospor ml de gel
(b) Cantidad de enzima inmovilizada covalentemente con respecto a la cantidad de enzima ofrecida y activa
en las condiciones de incubacin. Cantidad de enzima ofrecida inicialmente: 45 mg extrato comercial/ml gel.
(c) Actividad Hidroltica Remanente: Actividad hidmltica ensayada con respecto a la cantidad de enzima
inmovilizada en cada derivado.
(d) Actividad Coagulante Remanente: Actividad coagulante ensayada con respecto a la actividad hidmiltica
ensayada en cada derivado.
tabla 1.4. Influencia de diferentes factores en la optimizacin de derivados enzimticos de renina de
Mucor miehei preparados por inmovilizacin sobre los soportesglutaraldehdo-agarosa
La Actividad Coagulante Remanente (% ) se calcula en relacin a la actividad
hidroltica que muestra el derivado, al no haberse optimizado la actividad hidroltica
remanente del derivado (28%), la actividad coagulante en relacin a la cantidad de
protena inmovilizada es del 9,3%; es decir el derivado ha sufrido un 72% de prdida de
actividad manifestadacuandose une especficamente al substrato pequeoy con respecto
a esta actividad remanente una cada adicional del 66%.
Los resultados indican que, se ha realizado un control sobre el proceso con el fin
de que cada molcula de enzima que se inmovilizara lo hiciera del modo que menos
afectara su estructura terciaria y por lo tanto su actividad, sin embargo este control no
ha permitido la obtencin de un derivado con muy buena actividad cuando se ensaya
frente al substrato de menor tamao.
58
CAPITU LO 1
RESU LTADOSY DISCUSTON
Para buscar una posible explicacinhay que analizar el mecanismo de la estrategia
de inmovilizacin: en primer ]ugar esta estrategia est dirigida a la participacin en la
reaccin con el soporte de aquellos grupos amino de pK bajo de la protena, como es el
caso del amino terminal o algn otro residuo que, por efectos de induccin de grupos
prximos, pudieran haber modificado su pK; en segundo lugar, an en el caso de existir
en cada molcula de enzima varios grupos con posibilidades de reaccionar, la baja
densidad superficial de grupos sobre el soporte no permitida muchas uniones con cada
una. Por lo tanto, pocos grupos de la molcula estaran participando en la inmovilizacin
y en consecuencia estos derivados no podran haber sufrido grandes distorsiones de
conformacin activa por la interaccin con el soporte, lo que s que podra haber
ocurrido es la implicacin en la interaccin con el soporte de algn grupo esencial para
la actividad cataltica y de ah la imposibilidad de lograr la optimizacin de la actividad
enzimtica frente al hexapptido a pesar del control de todos los factores de los que
depende la intensidad de la interaccin.
3.1.4. INMOVILIZACION A TRAVES DE LAS CADENAS GLICOSIDICAS DE LA
GLICOENZIMASOBRESOPORTE MANA-AGAROSA
Por ser la enzima objeto de estudio una glicoproteina, a estos tres mtodos de
inmovilizacin covalente, extensibles, en general, a cualquier protena, se ha de aadir
uno ms: el aprovechamiento de las cadenas de azcares que se encuentran asociadas
a la fraccin proteica, como zona de unin aL soporte.
Efecto de la senulpurificacin y posterior oxidacin con NaJO
4 sobre la actividad y
estabilidad de la enzima en solucin
La naturaleza glicoproteica de muchas enzimas permite la utilizacin de sus
cadenas de azcares como brazo de unin al soporte. La necesidad de oxidacin previa
como modo de activacin de dichas cadenas, hace necesario el anlisis del efecto que
causa este proceso sobre la enzima en solucin para determinar la viabilidad de la
aplicacin de la estrategia sobre la enzima a estudiar.
El extractode renina de Mucor miehei no se encuentra disponible con alto grado
de pureza, por ello se ha considerada oportuno proceder previamente a la introduccin
59
E3
CAPITU LO 1
RESU LTADOSYDISCU SION
de alguna etapa de semipurificacin, en la cual se eliminen azcares libres que pudieran
estar presentes y que supondran importantes interferencias a la hora de oxidar la
glicoproteina. El proceso elegido ha consistido en la adsorcin selectiva al soporte
MANA-agarosa, seguida de un lavado que asegure la eliminacin de todo aquello que no
se haya unido al soporte y la posterior desorcin por incremento de la fuerza inica (en
Mtodos).
Despus del proceso de semipurificacin la solucin obtenida conserv toda la
actividad enzimtica (95%), sin embargo su contenido en protena total ha disminuido
hasta un 50%. Estos resultados indican que no slo se han eliminado aquellas impurezas
no proteicas como sales o azcares libres, sino tambin parte de las protenas presentes
en el extracto crudo diferentes de la renina que por lo tanto no mostraban actividad
enzimtica. El resultado es una solucin enzimtica semipurificada con un actividad
especfica de 1,2-1,5 U.A.H./mg protena.
Una vez semipurificada la solucin enzimtica se procede al tratamiento con
NaIO
4 con el fin de oxidar las cadenas glicosdicas de la enzima y con ello lograr la
activacin necesaria para que pueda tener lugar la interaccin con el soporte MANA-
agarosa. El consumo mximo de NaIO4 es de 3,8 moles de oxidante por cada mg de
protena del extracto semipurificado. La solucin despus de la oxidacin muestra un
52% de la actividad hidroltica inicial y un 42% de su actividad coagulante. Esto indica
que la modificacin qumica afecta considerablemente a la actividad enzimtica frente
a ambos substratos, siendo algo mayor la inactivacin producida con respecto a la
hidrlisis de casena c. No slo la actividad enzimtica se ve afectada por la oxidacin,
tambien disminuye su estabilidad. As la alcalinizacin del medio hasta pH 10,0, pH al
cual ha de tener lugar la reaccin de la enzima oxidada con el soporte, hace que la
actividad enzimtica caiga progresivamente durante el tiempo que durala inmovilizacin
(inmediatamente que cambia el pH del medio la actividad cae un 20% con respecto al
valor que mostraba finalizada la oxidacin).
Debido a la intensidad con la que la oxidacin afecta a la actividad y a la
estabilidad de la enzima, se ensayaron tratamientos ms suaves. Se ofrecieron
concentraciones menores de NaIO4 con las cuales conseguir grados de oxidacin del 65,
30 y 15% con respecto al valor mximo de oxidante consumido. Los valores de actividad
hidroltica remanente obtenidos fueron del 81, 90 y 95% con respecto a la inicial, y en
60
CAPITU LO 1
RESU LTADOSYDISCU STON
todos los caso la estabilidad fue buena (95-1130%) a pH 10,0 y 4
0C, durante el tiempo
que dur la inmovilizacin.
Todos los derivados de renina se han preparado a partir de una solucin
semipurificada del extractosiguiendo la estrategia de inmovilizacin descrita enMtodos.
Se han preparado dos derivados utilizando un soporte activado al mximos en los
que la diferencia entre ambos ha sido el grado de oxidacin de las cadenas glicosiladas
de la enzima. En la tabla 1.5 se recoge que la oxidacin al 90% aumenta
considerablemente el rendimiento de la inmovilizacion llegando a inmovilizarse la
prctica totalidad de la enzima ofrecida a un soporte activado al mximo (derivado e),
frente al 27% que se insolubiliza de la enzima oxidada al 15% (derivado B), lo mismo
que se une al soporte activado con 15 moles/ml gel, cuando la enzima se oxida al 30%
(derivado A). La utilizacin de un soporte ionizable en las condiciones del ensayo
enzimtico hace indispensable la comparacin de las actividades remanentes de los
derivados en presencia de alta concentracin de sales para evaluar la insolubilizacin
evitando el posible efecto de la multiinteraccin inica. Cuando el ensayo de A.H.R. de
los derivados obtenidos se realiza en un medio con alta fuerza inica se recupera en
todos los casos la actividad de las molculas inmovilizadas. El derivado que conserva
mayor actividad en el medio estandar es el preparado por inmovilizacin sobre un
soporte de baja activacin (derivado A) que permite conservar el 74% de la actividad
hidroltica. En los derivados B y Clos grupos ionizables del soporte son los mismos, pues
su grado de activacin es el mismo, y los grupos ionizables de la enzima que pueden
interaccionar con los primeros (Asp y/o Glu) tambin son los mismos por molcula, sin
embargo la actividad hidroltica cae un tercio debido a la multiinteraccin electrosttica
es casi del doble cuando la enzima inmovilizada se ha sido oxidada al 90% con respecto
a la enzima oxidada al 15%. La prdida de actividad por multiinteraccin electrosttica
es del 33% en el primer caso y del 52% en el segundo. La explicacin de este
comportamiento podra ser que en el derivado Clas molculas de enzima se encuentran
unidas al soporte a travs de ms puntos por lo cual la fraccin proteica est ms
prxima a la superficie del soporte y tambin los residuos ionizados y por ello la
interaccin electrosttica est ms favorecida que en el derivado B en el que la baja
activacin delas cadenas glicosiladas quizs no de lugar a muchas uniones covalentes con
el soporte y por lo tanto la fraccin proteica se encuentre ms alejada de ste.
61
L 1
CAPITU LO 1
RESU LTADOSYDISCU STON
DERIVADO grado
activacin
soporte (a)
grado
0~
(%) < b)
RendIN~,
(%) Cc)
A.H.R. (%) (d)
(e) Cf)
A 15 30 23 74 100
B 75 15 27 67 100
C 75 90 97 48 1 00
(a) juno/es de grupas reactivos por ml de geL
(b) Grado de oxidacin de la disolucin de extracto enzimtico semipunficada.
(d) Cantidad de enzima inmovilizada covalentemente con respecto a la cantidad de enzima ofrecida y activa
en las condiciones de incubacin. Cantidad de enzima ofrecida inicialnienwt.. mg extrato comercial/nt? geL
<e) Actividad Hidroltica Remanente. Actividad hidroltica ensayada con respecto a la cantidad de enzima
inmovilizada en cada derivado.
(13 Solucin de substrato estndar.
(g) Solucin de substrato con NaC 0,5 M.
Tabla LS. Influencia de diferentes factores en la optimizacin de derivados enzimticos de renina de
Mucor miehei preparados por inmovilizacin sobre los soportes MANA-agarosa a travs de sus cadenas
glicosdicas previamente oxidadas.
En la tabla 1 .6 se muestran los resultados de Actividad Coagulante obtenidos. El
contro] de las condiciones de inmovilizacin ha permitidoobtener derivados con un 15%
de actividad coagulante remanente (derivados A y B). Los valores de actividad
coagulante recuperada de estos derivados los convienten en los ms activos de los
obtenidos con esta enzima en lo que respecta a la medida frente a su substrato natural.
Cuando la multiinteraccin con el soporte no se controla, como es el caso del derivado
a pesar de que se no pierde actividad hidroltica la cada de actividad frente a casena
w es grande conservando slo un 2% de su actividad caseinoltica.
Lo mismo que ocurre en los derivados preparados sobre el mismo soporte pero
por inmovilizacin covalente a travs de la fraccin proteica (Apartado 3.1.2) la fuerza
inica no afecta al porcentaje de Actividad Coagulante con respecto a la que debera
tener la enzima soluble en las mismas condiciones.
62
.1 .1 .
EE
CAPITU LO 1 RESU LTADOSYDISCIJSION
DERIVADO A.C.R. (a)
(b) (c)
A 16,7 15,4
B 15,9 14,3
C 2,2 1 ,6
(a) Actividad Coagulante Remanente. Actividad coagulante ensayada con respecto a la cantidad de enzima
inmovilizada en cada derivado en lascondiciones indicadas.
<b) Solucin de substrato estndar
(c) Solucin de substrato con NaC 0,5 M
Tabla t. Actividad coagulante remanente de los derivadosenziniticos de renina deM miehei preparados
por inmovilizacin covalente sobre los soportes MANA-agarosa a travs de sus cadenas glicosdicas
previamente oxidadas.
Los derivados A y B son los que conservan un mayor actividad coagulante
habiendo sido preparados con un soporte poco activado, en el primer caso, y con bajo
grado de oxidacin de la enzima en el segundo caso. No obstante cuando la enzima se
encontraba activada al 90% y la inmovilizacin tuvo lugar sobre un soporte activado al
maximo, la actividad coagulante fue muy baja indicando que la mayor multiinteraccin
puede provocar el acercamiento de la zona proteica al soporte y aumentar los
impedimentos estericos para la entrada de la casena. Los resultados obtenidos
manifiestan que incluso en en este caso en el que la inmovilizacin de la enzima est
teniendo lugar por reaccin de las cadenas glicosdicas lo cual supone la separacin de
la zona proteica del soporte, la mutiinteraccin perjudica enormemente en cuanto a la
actividad frente al substrato macromolcular.
En resumen se puede apuntar que el aprovechamientode las cadenas de azcares
como zona de interaccin con un soporte tipo superficie, no slo sera una estrategia
adecuada por tratarse de una glicoprotena sino por que el grupo prosttico
(polisacridos) actuarn como brazo espaciador alejando del soporte a la fraccin
polipeptdica, en la que se incluye la zona de reconocimiento especfico del substrato.
Esto favorece el acceso del substrato macromolcular al centro activo, siempre que se
cuide las condiciones de inmovilizacin de modoque Ja interaccin con el soporte no sea
tan intensa que suponga el acercamiento la soporte de la fraccin proteica.
63
1 E L
CAPITU LO 1
RESU LTADOSYDISCU SION
3.2. Sesunda estrategia: UTILIZACION DE SOPORTES CON DIFERENTE
MORFOLOGIA INTERNA (Toyopearl, Eupergit y Bosynth)
La morfologa interna del soporte sobre el que se encuentra insolubii
2ada una
enzima va a influir en un gran nmero de procesos como la difusin de substratos y
productos, el grado de interaccin enzima-soporte, la estabilizacin adicional provocada
por dicha interaccin, etc.. Por ello la eleccin del soporte en funcin de su morfologa
deber adquirir una importancia decisiva en el caso de derivados que actan frente a
substratos macromoleculares, ya que los problemas de accesibilidad al centro activo de
la enzima por parte de la molcula de substrato se vern incrementados al aumentar la
congruencia geomtrica enzima-soporte.
La utilizacin de soportes con una morfologa interna ms abierta es la segunda
estrategia propuesta para la inmovilizacin de enzimas con condicionantes espaciales
para la unin especfica de su substrato voluminoso. Para su estudio se ha recurrido a
lautilizacin de diferentes soportes polimricos: agarosa 6B-CL, agarosa 1OB, Toyopearl,
Eupergit y Biosynth. La primera parte del trabajo desarrolado ha consistido en una
somera caracterizacin de los nuevos soportes en cuanto a lo que se ha denominado
congruencia geomtrica entre el soporte y la enzima. Para poder clasificar en trminos
relativos la congruencia geomtrica de estos soportes de un modo sencillo y utilizando las
tcnicas disponibles, se ha realizado un estudio basado en el supuesto de que si se
preparan derivados por inmovilizacin sobre diferentes soportes activados con el mismo
tipo e idntica densidad de grupos reactivos por cada molcula de enzima insolubilizada,
la posibilidad de multiinteraccin ser mayor cuanto mejor sea el acoplamiento
geomtrico entre ambos. Este grado de multiinteraccin en la inmovilizacin covalente
se reflejar en dos caractersticas del derivado: la posibleprdida de actividad causada por
la distorsin de la molcula de enzima que se ha unido por mayor nmero de puntos y/o
la posible ganancia de estabilidad con respecto a la enzima en solucin causada por la
rigidificacin de la estructura 3D de la enzima al haberse unido por mayor nmero de
puntos al soporte.
El proceso seguido consiste en la preparacin de derivados enzimticos sobre
soportes activados al mximo con el mismo grupo reactivo (glioxilo) para determinar la
cantidad mxima de grupos reactivos del soporte por cada molcula de enzima o por
cada mg de enzima. A continuacin se eligi un mismo valor de esta relacin y se
activarn los soportes con un grado de activacin tal que al inmovilizar la enzima sobre
64
CAPITU lO 1
RESULTADOS YDISCU SION
ellos presenten dichovalor de densidad de grupos reactivos por molcula de enzima (por
mg de enzima), evitando los problemas de difusin a la hora de ensayar sus actividades.
Sobre estos ltimos derivados se estudian las diferencias en el grado de multiinteraccin
permitido por los diferentes soportes, manifestadas (i) en diferencias en la actividad
remanente durante el proceso de inmovilizacin, y/o (u) en diferencias de estabilidad
trmica de los derivados enzimticos obtenidos incubados en difrentes condiciones
despus de la unin covalente
Para desarrollar este estudio se ha utilizado trlpsina por ser una enzima
monomrica, no glicosilada, de 40.000 Dy que ha permitido una buena inmovilizacin
al soporte glioxil-agarosa, habindose calculado que en la inmovilizacin covalente a dicho
soporte se llegan a formar 7 enlaces por molcula (8).
3.2.1. DETERMINACION DEL GRADO DE CONGRUENCIA GEOMETRICA DE
SOPORTES CON DIFERENTE MORFOLOGIA INTERNA
Se han preparado derivados cargados al mximo con tripsina para detenninar la
densidad especfica mxima de grupos reactivos del soporte en relacin con la cantidad de
t4psina inmovilizada C.~moles mximos de grupos reactivos/mg tn~sina). La finalidad de
estos derivados es elegir el grado de activacin ptimo para cada soporte que permita
preparar derivados con idntica densidad especfica y, por lo tanto, comparables entre
s, y en los que la actividad enzimtica no se vea afectada por problemas de difusin.
La tabla 1.7 recoge los valores resultantes de la preparacin de derivados sobe
cada uno de los soportes activados totalmente (a) habiendo insolubilizado la mxima
cantidad de tripsina que ha aceptado cada uno (b), lo cual ha servido para el clculo de
lo que se ha denominado densidad especfica mxima del derivado que no es ms que la
relacin entre Ca) y C2), es decir los moles de grupos glioxilo del soporte que
corresponden a cada mg de tripsina insolubilizado en un ml de gel.
65
fi
LI .
CAPITU LO 1
RESULTADOSYDISCU SION
Soporte Activacin
mxima del
soporte (a)
Capacidad
mxima de
carga del
soporte (b)
Actividad
remanente
(%) (c)
Densidad
especfica
mxima del
derivado (d)
TOYOPEARL 80 28 100 2,9
AGAROSA 6% 75 54 59 1,4
AGAROSA
10%
200 115 30 1,7
EUFERGIT 190 65 45 2,9
BIOSYNTH 130 76 30 1,7
(a) unoles de grupos glioxlo por ml de soporte hmedo.
(b) mg de enzima (tripsina) inmovilizada por mt de soporte hmedo.
(c) Actividad enzimtica residual del derivado de tnpsina con respecto a la de la cantidad de enzima que se
ha inmovilizado.
(d) pinoles de grupos glioxilo sobre el soporte por mg de protena inmovilizado.
Tabla 1.7. Derivados de tripsina preparados por inmovilizacin sobre los glioxil-soportes con la mxima
cantidad de enzima admitida por cada soporte.
Para obtener unos derivados enzimticos con idntica densidad especffica de
grupos reactivos del soporte por mg de enzima se ha de disminuir el grado de activacin
de los soportes Toyopearl hasta 37,5 y Eupergit hasta 75 moles glioxiloml gel, de este
modo todos los derivados preparados tendrn una relacin gmoles grupos glioxil/mg
protena en el intervalo 1,4-1,7. En la tabla 1.8 se recogen los derivados que se han
preparado y que permitirn el posterior estudio de las posibilidades de multiinteraccin
que presenta cada soporte para las molculas de enzima insolubilizadas sobre ellos, el
significado de estos derivados es que cada molcula de enzima inmovilizada posee bajo
ella el mismo nmero de grupos glioxilo del soporte por lo cual las posibilidades de
interaccinar con todos ellos o con uno solo dependern de la disposicin espacial de
estos grupos y su relacin con los grupos de la enzima.
66
CAPITU LO 1
RESU LTADOSYDISCU SION
Soporte Activacin del
soporte (a)
Densidad
especfica del
derivado (t)
Carga
enzimtica (c)(d)
TOYOPEARL 37,5 1,5 12,9
AGAROSA 6% 75 1,4 19
AGAROSA 10% 200 1,7 17
EUPERGIT 75 1,5 18
BIOSYNTH 130 1,8 20,2
(a) wnoles de gruposglioxio por mt de soporte hmedo.
(h) pinoles de gruposglioxio sobre el soporte por cada mg de pmtena inmovilizado.
(c) cantidad de enzima inmovilizada (sin problemas de difusin): mg. enzima inmovilizada (tripsina) por ml
de soporte hmedo.
(d) Segn se ha deducido de los derivados de mxima caiga enzimtica recogi4os en la tabla 1.8 las
concentraciones inmovilizadas (c) no presentan problemas de difusin.
Tabla LS. Derivados de tripaina preparados sobre los diferentes glioxil-soportes con idntica densidad
especfica de grupos reactivos por molcula de protena inmovilizada.
> Estudio de las posibilidades de mnultllnteraccldn de cada soporte
Detenninados los valores adecuados de gradode activacin del soporte y de carga
enzimtica para cada derivado preparado con un soporte diferente, se procedi al
estudio de la multiinteraccin soporte-tripsina.
El proceso de inmovilizacin seguido se divide en dos etapas: en la primera etapa
tiene lugar la insolubilizacin de la enzima ofrecida en presencia de benzamidina como
inhibidor para evitar fenmenos de autolisis. Una vez finalizada la insolubilizacin y
eliminado el inhibidor enzimtico por lavado del gel, se contina la incubacin en las
mismas condiciones de pH para favorecer una interaccin ms intensa de cada una de
las molcu]as inmovilizadas con el soporte y se procede al seguimiento de Ja actividad
enzimtica de cada derivado en funcin del tiempo transcurrido.
En la figura 1.12 se muestra el seguimiento de la actividad de los derivados de
tripsina ya insolubilizada incubados en condiciones favorables para la multiinteraccin
con el Soporte. Segn se puede observar, los derivados preparados sobre agarosa son los
67
L I I
CAPITU LO 1 RESU LTADOSYDISCU SION
nicos a los que la incubacin enzima-soporte provoca una cada progresiva de actividad,
lo que indica que se ha producido multiinteraccin con el soporte que distorsiona la
molcula de protena haciendo que pierda capacidad eataltica. La incubacin sobre los
otros soportes no afecta a su actividad, lo cual indica la multiinteracin no ha tenido
lugare o que la que tiene lugar no es suficiente para afectar a la conformacin activa de
la molcula de catalizador.
100
a,
4-
e
a,
e
E
a,
1-.
(u
o
4-
(u
E
e
a,
0
< u
4-
o
75
50
25
o
192
tiempo (horas)
Figura 1.12. Curso del proceso de multiinteraccin de tripsina con e soporte sobre el que se encuentra
i nmo vi li zada. Su bstrato u ti li zado : BAEE (Ncv-benzoil-L-arginina-etil-ster). Condiciones experimentales
enMtodos,Apanado 2.2. Soportes: Toyopearl (.), Eupetgit (+ ), Biosynth { > , agarosa 6B-CL(U) y agarosa
IOB (e) .
Para estudiar si la incubacin prolongada de la enzima insolubilizada se
manifestara en algn cambio en la estabilidad trmica de los diferentes derivados
obtenidos, se realizaron incubaciones a pH 10 y 50
0C (figura 1.13).
0 48 96 144
68
CAPITU LO 1
RESU LTADOSYDISCU SlON
100
a,
4-.
a)
(u
E
a)
1~.
< u
o
4-
<u
E
e
a,
0
(u
0
5
4-
(a
4<
75
50
25
o
tiempo <horas)
Figura L13. Cursos de inactivacin trmica de derivados de tripsina preparados por inmovilizacin
covalente sobreglioxil-soportes. Condiciones experimentales enMtodos,Apartado5.2. Soportes: Toyopearl
(u) , Eupegit (+), Biosynth (), agarosa 6B-CL (U) y agarosa 1GB (e) .
Se puede observar una clara diferencia de estabilidad para los cada tipo de
soporte. Los valores de semivida extrapolados de las curvas de inactivacin van desde
10 horas para los derivados preparados sobre Eupergit o Biosynth, 18 horas sobre gel
Toyopearl, hasta ms de 72 horas cuandola inmovilizacin ha tenido lugar sobre agarosa
6B-CL 1OB.
Tanto estos resultados de estabilidad como los obtenidos anteriormente en
relacin a la prdida de actividad, debidos ambos a la multiinteraccin enzima-soporte
confirman que los soportes Toyopearl, Eupergit y Biosynth permiten una menor
congruencia geomtrica con las protenas. Teniendo el mismo nmero de grupos
reactivos bajo cada molcula de enzima inmovilizada la disposicin de estos es tal que
69
0 12 24 36 48 60
72
Liii
CAPITU LO 1
RESULTADOS YDISCU STON
no pueden tenerlugar interacciones que distorsionen o rigidifiquen la estructura terciaria
activa de la enzima. La disposicin de los grupos reactivos en el soporte estar
determinada por la morfologa interna de ste. Entre los tres soportes parece que
Toyopearl ha permitido una estabilizacin ligeramente superior, por lo que se podra
preveer una estructura algo ms cerrada que permitira algn punto de unin ms.
3.2.2. CONTROL Y OPTIMIZACION DE LAINMOVILIZACION DE RENINASOBRE
SOPORTES DE MENOR CONGRUENCIA GEOMETRICA
De los estudios previos de inmovilizacin de renina de Mucor miehei sobre
agarosa 6B-CL (Apanado 3.1), se concluy que la orientacin que daba lugar a los
derivados con peor actividad frente al substrato macromolcular es la originada por
unin al soporte glioxil-agarosa. Por ello, se ha elegido esta estrategia de inmovilizacin
para ser ensayada con los soportes que muestran menor congruencia geomtrica con la
protena que con ellos interaccione: Eupergit, Bioiynth y Toyopearl.
> Inmovilizacin de renina de Mucor miehel a travs de sus grupos amino superficiales
(Lys) sobre soportes activados con grupos glioxilo
El proceso seguido para la inmovilizacin ha sido el mismo empleado con el
soporte de agarosa, cuidando al mximolas condiciones de reaccin con el fin de reducir
las posibilidades de distorsin de las molculas de enzima inmovilizadas (que
inicialmente se manifestar en cadas de actividad frente al substrato sinttico). Ha sido
Biosynth el soporte que ha dado mejores resultados (Tabla 1.9).
El derivado preparado sobre este soporte activado con 30 gmoles de grupos por
ml gel, a 4
0C durante 5 horas ha permitido la unin poco distorsionante del 6% de la
enzima ofrecida, cantidad suficiente para poder comprobar que este derivado conserva
el 25,1% de su actividad coagulante.
Los derivados optimizados preparados sobre Eupergit- 75 (la inmovilizacin se
realiz a 40C, con un tiempo de interaccin de 4-21 horas) conservan tambin toda su
Actividad Hidroltica, y muestran una Actividad Coagulante del 14,5%.
70
CAPITU LO 1
RESU LTADOSYDISCU SION
grado activacin
soporte (a) (
0C)
(
(h)
RendfNM
(%) (b)
A.H.R.
(%) (e)
A.C.R.
(%)(d)
30 4 5 6 100 25,1
137 4 5 32 100 12,5
137 20 4 100 9 6,6
(a) pinoles de grupos reactivos por ml de soporte hmedo.
(b) Cantidad de enzima inmovilizada con respecto a la cantidad de enzima ofrecida y activa en lascondiciones
del proceso. Cantidad de enzima ofrecida inicialmente: 50 mg de extracto comercial/ml soporte.
(c) Actividad Hidroltca Remanente: Actividad hidroltica ensayada con respecto a la cantidad de enzima
inmovilizada en cada derivado.
(d) Actividad Coagulante Remanente: Actividad coagulente ensayada con respecto a la actividad hidrlitica
ensayada en cada derivado.
Tabla 1.9. Derivados de renina de Mucor miehei preparados por inmovilizacin sobre soporte glioxil-
Biorynth.
El sistema de activacin del soporte consiste en grupos glioxio idnticos a los de
agarosa, con la cual el valor mximo de Actividad Coagulante Residual obtenida era del
2,5%. Los nuevos soportes han permitidoobtener derivados enzimticos con 10 y 6 veces
ms actividad coagulante remanente de la que se logra sobre agarosa, siendo en todos
los casos la misma orientacin preferente de la enzima, dada por el mismo tipo de
grupos reactivos sobre el soporte: aldehdo.
La utilizacin de Toyopearl ha permitido rendimientos de inmovilizacin muy
bajos, insuficientes para poder considerar reproducibles los valores de actividad
obtenidos.
> Inmovilizacin de renina de Mucor miehel a travs de sus cadenas glicoslicas sobre
MANA-soportes
Se procedi a la inmovilizacin de la enzima a estos nuevos soportes a travs de
las cadenas de azcares por haber resultado ser la orientacin ptima para la
inmovilizacin de esta enzima sobre agarosa, segn se muestra en el Apartado 3.1.4. La
intencin es conseguir sumar los efectos positivos de la aplicacin de cada una de las dos
71
CAPITU LO
RESU LTADOSYDIS4RJSION
estrategias de inmovilizacin sobre la misma enzima. Los resultados de los derivados
preparados se exponen en la tabla 1.10.
Soporte (a) (b) Rend~
(%) (c)
A.H.R.
(%) (d)
A.C.R. (%) (e)
(1) (g)
EUPERGIT 75 15 22 100 25 33
BIOSYNTH 98 15 7 100 25 28
AGAROSA 6% 75 15 27 100 15,9 14,3
(a) Grado de activacin del soporte (pinoles de gruposglioxilo/m soporte)
(b) Grado de oxidacin de la glicoenzima respecto al mximo (%).
(c) Actividad Hidroltica Remanente. Actividad hidroltica ensayada, en ausencia de
electrostticas, con respecto a la cantidad de enzima inmovilizada en cada derivado.
(d) Actividad Coagulante Remanente: Actividad coagulante ensayada con respecto a la actividad hidroltica
de cada derivado.
(e) Solucin de substrato estndar.
(1) Solucin de substrato con NaC 0,5 M
Tabla Lb. Derivados de renina de Mucor miehei preparados sobre diferentes MANA-soportes previa
oxidacin de las cadenas glicosidicas de la enzima.
La inmovilizacin de renina a travs de sus cadenas glicosidicas previamente
oxidadas al 15% sobre los soportesEupergit y Bio~ynth ha dado como resultado derivados
que conservan toda sua actividad hidroltica siempre que se eliminen las interacciones
electrostticas debidas a la ionizacin del soporte en las condiciones del ensayo.
Respecto a la actividad coagulante, los nuevos soportes permiten duplicar la actividad
mostrada por inmovilizacin sobre agarosa, alcanzando el 28-33% de la actividad
coagulante que tendra la misma cantidad de enzima si se encontrase en solucin y no
inmovilizada.
3.3. Tercera estrategia: UTILIZACION DE SOPORTES CON GRUPOS REACTIVOS
CONVENIENTEMENTE DISTANCIADOS DE SU SUPERFICIE
Para reducir el impedimento estrico que supone la proximidad del soporte sobre
el que se ha inmovilizado la enzima al acceso de substratos voluminosos a su centro
72
interacciones
CAPITU LO 1 RESULTADOS Y DISCU SION
activo, se ha propuesto la introduccin de brazos espaciadores activos sobre los cuales
se unan las molculas a inmovilizar. De este modo se conservan las caractersticas fsicas
del soporte base (agarosa en el este caso), pero se disminuye la congruencia geomtrica
enzima-soporte por encontrarse los grupos reactivos del soporte separados de la
superficie.
Se han elegido dos tipos de espaciadores:
- 1,4-butanodiol-digllcdoxi-ter (BDE) o 1,4-bs(2,3-epoxipropoxi)-
butano (32), diepoxido de cadena larga que se ha elegido por su semejanza con el glicidol
(2,3-epox~ropanot), agente utilizado en la activacin de los geles de agarosa comerciales.
- Dextrano (polmero de glucosa). se ha elegido el dextrano de
1 0.000D, buscando un polmero lineal de longitud suficiente para dar lugar largos brazos
sobre la superficie del soporte cuya difusin por los poros de dicho soporte no est
limitada por su volumen.
3.3.1. UTILIZACION DE 1,4-butanodol-diglcidoxi-ter (BDE) COMO AGENTE
ESPACIADOR
fr Preparacin y optimlzadn de soportes BDE-agarosa
Por tratarse de un agente qumicamente semejante al glicidol, el proceso de
activacin seguido fue bsicamente el mismo, aunque hubo que tener en cuenta que la
agarosa comercial posee radicales epxido producto del entrecruzamiento con
epiclorhidrina. Estos gruposdarn lugar agrupos aldehdo cuandoel soporte activado con
el agente elegido (glicidol o BDE) se oxide en la ltima etapa de activacin. En el caso
de la activacin con glicidol no tendr importancia pues las grupos obtenidos son
idnticos a los resultantes de la activacin. Sin embargo cuando el agente activante es
BDE la oxidacin del soporte activado tiene como resultado dos tipos de grupos
reactivos:(i) los grupos glioxilo producto de la oxidacin de los glicoles que posee la
agarosa comercial (18 tmoles/ml gel) y (u) los grupos aldehdo de cadena larga,
obtenidos por la oxidacin del agente activante utilizado. Estos ltimos serian los nicos
grupos reactivos deseados sobre la superficie de la agarosa. Por ello, previamente a la
73
i i ~1
CAPITU LO 1 RESU LTADOSYDISCU SION
activacin con BDE, fue necesaria la transformacin los glicoles del soporte comercial
en hidroxilos pOr oxidacin y posterior reduccin. De este modo, tras todo el proceso de
activacin, estos hidroxilos generados podrn reaccionar del mismo modo que los
endgenos de] soporte comercial.
Al ser el objetivo de este tipo de activacin el conseguir evitar el posible efecto
no deseado de la pared del soporte, el grado de activacin ha de controlarse en la etapa
de activacin con BDEy no, comoen el caso de la activacin con glicidol, en la posterior
etapa de oxidacin, pues la presencia de un exceso de cadenas de BDE podra traducirse
en un nuevo impedimento estrico a la entrada del substrato en el centro activo de la
enzima. Se han preparado dos soportes que se diferencian en la concentracin de BDE
utilizada durante la activacin. El grado mximo de activacin logrado en cada caso se
ha determinado segn la oxidacin conseguida por tratamiento con NaIO
4: 18 y 90
pinoles grupos aldehdo reactivos/ml gel BDE-agarosa. Estos valores de activacin del
soporte son algo mayores de los obtenidos con glicidol utilizando la misma concentracin
(7).
> Estudio y control de la inmovilizacin
En la tabla 1.11 se recogen los resultados de actividad de los derivados obtenidos
por inmovilizacin a estos nuevos soportes.
[BDE] (M) grado de activacin
(mximo) (%) (a)
A.H.R.
(%> (b)
A.C.R.
(%) (c)
0,2 18 100 5,9
2 90 100 1,4
(a) pinoles de grupos reactivos por ml de soporte. Corresponde al mximo para cada uno de ellos.
(b) Actividad Hidrolftica Remanente: Actividad hidroltica ensayada con respecto a la cantidad de enzima
tnmovilizada en cada derivado.
(c) Actividad Coagulante Remanente: Actividad coagulante ensayada con respecto a la actividad hidroltica de
cada derivado.
Tabla 1 .1 1 . Derivados de renina de Mucor miehei preparados sobre soportes BDE-agarosa.
74
CAPITU LO 1
RESU LTADOSYDISCU SION
Los derivados resultantes presentan toda su actividad hidroltica
independientemente del grado de activacin del soporte utilizado. Con respecto a su
Actividad Coagulante Remanente, la densidad superficial de grupos reactivos del soporte
influye significativamente. As la enzima inmovilizada sobre el soporte menos activado
conserva el 5,9% frente al soporte activado con BDE 2 M que permite recuperar slo
un 1,4%. ato vuelve a demostrar que el control del grado de activacin del soporte es
importante cuandoel substrato requiere mayor disponibilidad estrica de la enzima, pues
bien favorece la multiinteraccin o bien supone un nuevo efecto pared sobre la enzima
unida a travs de estos brazos. Por otro lado los bajos valores de actividad coagulante
resultantes apuntan a que no es suficiente una cadena de 12 tomos para conseguir la
adecuada separacin de la enzima con respecto al soporte y permitir el libre acceso del
substrato macromolcular al centro activo. Esto no sera de extraar, si adems
consideramos que la orientacin de la molcula de enzima es la que presenta mayores
impedimentos.
3.3.2. UTILIZACION DE DEXTRANO COMO AGENTE ESPACIADOR
Preparacin y opthnizacln de los soportes dextrano-agarosa
El tratamiento de disoluciones de dextrano con NaIO
4 como agente oxidante en
condiciones suaves provoca la ruptura de los anillos monoscaridos dando lugar a dos
grupos aldehdo por anillo (33, 34). El resultado es la transformacin de la cadena
polisacrida en una cadena polialdehdica (Figura 1.14).
NaIO4
CH
:1 o -- CH
o o
Polialdehido
Figura 1.14. Proceso de oxidacin de la molcula de dextrano por NaIO4.
Dextrano
75
CAPI TULO 1
RESU LTADOSYDISCU SION
La cadena polialdehdica resultante es estable en medios neutros lo cual ha
permitido el diseo de un mtodo para la activacin del soporte MANA-agarosa, en el
que se utiliz como agente reductor el trimetil-anno-borano (TMAB). Los complejos
aminoborano son agentes reductores de bases de Schiff con una actividad ptima en
medios neutros o ligeramente alcalinos (pH 6,0-9,0) y poco txicos si se comparan con
otro agente de gran capacidad reductora en el mismo intervalo de pH como es el
cianoborohidruro (35). Se ha elegido el complejo trimetilado frente al dimetilado debido
a que dandolugar a idnticos rendimientos finales en reacciones de metilacin de grupos
amino, el primero muestra mayor vida media y capacidad reductora moderada, lo cual
lo hace ms aconsejado cuando el proceso sobre el que debe actuar ha de ser suave (36).
En la figura 1.15 se representan esquematicamente los dos procesos de activacin
con dextrano del soporte MANA-agarosa, que se describen a continuacin:
- El primero se obtuvo por reaccin covalente de un gel de agarosa
activado al mximo con grupos amino primarios (gel MANA-agarosa-75) con dextrano
oxidadototalmente, y posterior tratamientodelpolihidroxil-soporte resultante conglicidol.
A este soporte se le ha denominado: GEL DEX7RA.NO-AGAROSA-L En este caso la
utilizacin de un soporte MANA-agarosa activado al mximo es imprescindible pues de
encontrarse algn grupo activable de la agarosa comercial, reaccionada con el glicidol
a la vez que el propio dextrano, dando lugar a dos tipos de grupos reactivos, los del
brazo de dextrano que recubre la agarosa propiamente dicha y los de la superficie del
soporte. Si existe ms de un tipo de grupos no se podra asegurar sobre cual tendr lugar
la inmovilizacin de la protena.
La oxidacin del soporte obtenido tras la unin covalente del dextrano es la que
conferir al soporte el grado de activacin, ya que en todos los casos la cantidad de
dextrano que ha reaccionado es la mxima en las condiciones en que se llev a cabo el
proceso: 2,5 pinoles de dextrano/m gel.
- El segundo tipo de soporte se ha obtenido a partir de un soporte MANA-
agarosa de menor densidad de grupos reactivos superficiales (solamente se activan los
grupos glicol obtenidos del soporte comercial por oxidacin). No se activaron con glicidol
los dextranos ya unidos al soporte (polihidroxil-soporte), pues tambin se activaran los
grupos hidroxilo de la agarosa comercial lo cual hubiera supuesto la presencia de dos
tipos de grupos reactivos en el soporte: unos directamente sobre la superficie del soporte
76
CAPITU LO 1 RESULTADOS YDISCU SION
agarosa, no deseados, y otros sobre los brazos de dextrano unidos a l (objetivo del
proceso). Por ello el dextrano utilizado en el tratamiento del soporte MANA-agarosa-20
estar parcialmente oxidado. Una vez que se haya unido covalentemente al soporte, la
activacin se consigue por oxidacin directa de los residuos de dextrano que se
encuentran sin modificar. A este soporte se le ha denominado: GEL DEXTRANO-
AGAROSA-Il.
./NbNHN.2
Gel MANA-agarosa-75
+
LTHHH -1
Dextrano *
pHlO,O/NaBH
4
> 1
NaOH/NaBH4
>3
Glic idol
Ma104
Gel DEXTRANO-agarosa-I
* Dextrano totalmente oxidado
u .
pH7.O/TMAB
.CHrCHOIl~~CH2OH
77
CAPITU LO 1
RESU LTADOSYDISCU SION
+
Gel MANA-agarosa-20
CH.
o
OCH,
CH
o
Dextrmno *
pH7.O/TMAB
>1
pHl O, O/NaBH
4
MalO4
H2NH(CH2 ) rMir
0M
2
H
o
Gel DEXTRANO-agarosa-Il
* Dextrano parcialmente oxidado
Figura Lis. Procesode activacin can dextrano del gel de agarosa con dextrano. (A) Partiendo del soporte
con mxima densidad de grupos reactivos superficiales. (B) Partiendo de un soporte con baja densidad de
grupos amino superficiales.
78
u . .i
CAPITU LO 1
RESU LTADOSYDISCU SION
Se han obtenido diferentes soportes dextrano-agarosa-Il atendiendo a dos
variables. En primer lugar segn el grado de oxidacin parcial del dextrano ofrecido al
gel MANA-agarosa-20 inicialmente para su recubrimiento, y en segundo lugar ~ en
funcin de la oxidacin final de los brazos de dextrano ya unidos covalentemente. Por
ello se ha estudiado la influencia de ambos factores en la posterior inmovilizacin de la
renina.
Estudio y control de la inmovilizacin de renina de Mucor miehel sobre soportes
dextrano-agarosa
Con el primer soporte disponible activado con dextrano, dextrano-agarosa-I,
recubierto con 2,5 gmol dextrano/m gel, se estudi el efecto de parmetros como el
grado de activacin final del dextrano ya unida a agarosa (controlando la oxidacin una
vez tratado con glicidol), el tiempo de interaccin enzima-soporte, la temperatura, etc.,
siempre con el fin de optimizar el derivado en cuanto a Actividad Hidroltica y, de este
modo, ver posibles efectos slo frente al substrato natural de gran volumen. En la tabla
1.12 se representan las condiciones de preparacin del derivado optimizado
comparndolas con las de otro, que no permite la conservacin de la actividad
hidrolitica.
grado activacin soporte
(a)
tiempo
(h)
Rend~< ov
(%) (b)
A.H.R.
< %) (c)
A.C.R.
(%) (d)
445 (mximo) 1 24 12 2.4
90 (al 20%) 4 11 100 4.8
<a) pmoles de NaJO
4 consumidos/ml soporte (porcentaje de oxidacin con respecto al mximo).
(1) Cantidad de enzima inmovilizada con respecto a la cantidad de enzima ofrecida y activa inicialemnte.
Cc) Actividad Hidroltica Remanente. Actividad hidroltica ensayada con respecto a la cantidad de enzima
inmovilizada en cada derivado.
(d) Actividad Coagulante Remanente: Actividad coagulante ensayada con respecto a la actividad hidroltica
de cada derivado.
Tabla 1.12. Derivados de renina de Mucormiehei preparados por inmovilizacin sobre los soportesde~xirano-
agarosa-!.
79
CAPITU LO 1
RESU LTADOSYDISCU SION
El derivado preparado por inmovilizacin sobre un soporte dextrano-agarosa-1 en
el que los brazos de dextrano introducidos han sido oxidados al 20 % ha sido optimizado
con respecto a su actividad hidroltica, mostrando un 4,8% de actividad coagulante
remanente. Cuando el soporte utilizado es el de brazos espaciadores activados al mximo
la cada de actividad enzimtica frente al substrato sinttico es muy importante (88%),
lo cual es probablemente el reflejo de la mayor interaccin con las cadenas
polialdehdicas de alta reactividad que provoca distorsiones en la enzima perdiendo la
configuracin ptima de su centro activo. La actividad coagulante de este derivado es del
2,4%.
Los resultados parecen indicar que el la activacin del soporte no ha sido
adecuada para evitr los condicionantes estricos ante la interaccin especfica con la
casena.
Cuando se utiliza en la inmovilizacin el otro soporte: dextrano-agarosa-Il los
resultados son muy diferentes segn se muestra en la tabla 1.13.
grado oxidacin
dextrano (%) (a)
grado activacin
soporte (b)
A.H.R. (%)
(c)
A.C.R. (% )
Cd)
90 20 100 25
90 70 (mxima) 100 14,3
46 121 (mxima) 100 2,5
<a) grado de oxidacin del dextrano utilizado en el recubrimiento del soporte MANA-agarosa.
<b) pinolesgrupos reactivos <aldehdo)/ml soporte.
(c) Actividad Hidroltica Remanente: Actividad hidmltica ensayada con respecto a la cantidad de enzima
inmovilizada.
(d) Actividad Coagulante Remanente: Actividad coagulante ensayada con respecto a la actividad hidroltica
de cada derivado.
Tabla 1.13. Derivados de reninade Mucormiehei preparados por inmovilizacin sobre los soportesde.xtrano-
agamsa-II.
En la tabla se presentan los resultados obtenidos con tres soportes diferentes: un
soporte preparado recubriendo el gel con dextrano oxidado al 46% lo cual da lugar
despus de la oxidacin a cadenas polialdehdicas con gran cantidad de grupos aldehdo
reactivos, y dos soportes preparados por unin covalente de cadenas de dextrano
80
CAPITU LO 1
RESU LTADOSYDISCU SION
oxidadas casi totalmente (90%), lo que permite menor activacin posterior. Estos
soportes se diferencian en que uno de ellos se ha oxidadototalmente y el otro no, dando
lugar a diferente densidad de grupos reactivos para la interaccin con la enzima.
Los tres soportes han permitido la inmovilizacin de la enzima conservando su
Actividad Hidroltica independientemente de su grado de activacin. Sin embargo la
actividad coagulante se ve muy condicionada por el grado de oxidacin final del soporte,
es decir por la densidad de grupos reactivos sobre el soporte, llegando a conservar el
derivado preparado sobre el soporte menos activado el 25% de su actividad casenoltica,
frente a 14,3 y 2,5% de los derivado no optimizados.
5. COMPABACION DE LA TRES ESTRATEGIAS. DISCUSION GENERAL
Se ha utilizado la renina de Mucor miehei como modelo para el estudio de la
inmovilizacin de enzimas que actan sobre substratos macromoleculares, por el enorme
inters que supondra la utilizacin en catlisis heterognea de esta enzima a nivel
industrial. El desarrollo de este estudio ha sido posible gracias a que se ha diseado y
puesto a punto un ensayo espectrofotomtrico para la determinacin de la actividad
coagulante o caseinolitica de proteasas tipo renina. El disponer de este ensayo permite
relacionar la actividad coagulante con su correspondiente actividad hidroltica, medida
con respecto a un pptido sinttico que reproduce la secuencia de la caseina que la
renina reconoce especficamente. Con ello se puedenvalorar diferentes comportamientos
de la enzima en cuanto a actividad enziintica en funcin del substrato sobre el que
acta y, de este modo cuantificar el efecto de determinados procesos que pudiera sufrir
la molcula de enzima y que no afectan al centro activo mismo o a la accesibilidad del
substrato sinttico, pero que s alteran la capacidad cataltica de la enzima frente al
substrato macromolecular, como por ejemplo, la inmovilizacin sobre un soporte cuya
presencia podra suponer un importante impedimento estrico a la interaccin enzima-
substrato macromolecular.
De las tres estrategias propuestas inicialmente: (i) modulacin de la orientacin
relativa de la enzima sobre el soporte, (u) utilizacin de soportes con diferente
morfologa interna y (iii) utilizacin de soportes con grupos reactivos convenientemente
separados de su superficie, se han obtenido importantes resultados que se resumen a
continuacin.
81
CAPITU LO 1
RESU LTADOSYDISCU SION
Todos los derivados enzimticos preparados por inmovilizacin covalente sobre
soportes de agarosa han sido optimizados en lo que respecta a su actividad hidroltica
independientemente del soporte utilizado o de la estrategia de inmovilizacin, de forma
que el centro activo de la enzima no se viera afectado por el proceso, y a fin de evaluar
cmo afecta la inmovilizacin a la actividad enzimtica sobre la casena K.
La modificacin de la orientacin relativa de las molculas de enzima
inmovilizadas con respecto al soporte ha demostrado que sta s influye sobre la
actividad caseinoltica. Se han preparadodiversos derivados de renina por inmovilizacin
covalente a travs de diferentes grupos funcionales de la enzima situados
mayoritariamente en su superficie. En cada caso se ha estudiado el efecto de las
variables que controlan la velocidad de inmovilizacin y el posible grado de unin
multipuntual, de este modo se ha podido optimizar la preparacin de los derivados
tratando inicialmente de evitar en lo posible cualquier distorsin de la estructura de la
enzima, tanto provocadas por modificaciones qumicas como por la unin enzima-soporte
en si.
SOPORTE GRUPO
REACTIVO DE
LA ENZIMA
A.H.R. (% ) (a) A.C.R.
(%)(b) (c) (d)
glioxil-agarosa E-amino (Lys) 100 ---- 2,38
MAN-agarosa . carboxilo
(AspIGIu)
70 100 6,0
lutaraldehdo-agarosa amino de bajo
pK
28 ---- 33,3
(9,6)
MANA-agarosa cadena glicosdica
oxidada
70 100 15
(a) Actividad 1-Jidroltica Remanente: Actividad hidmltica ensayada con respecto a la cantidad de enzima
inmovilizada en cada derivado,
(b) Actividad Coagulante Remanente: Actividad coagulante ensayada con respecto su actividad hidrlitica
ensayada en cada derivado.
(c) Solucin de substrato estndar
(d) Solucin de substrato con NaC 0,5 M.
Tabla 1.14. Derivados de reuma de Mucor miehei optimizados sobre cada uno de los diferentes soportes
de agarosa.
82
uu ~ ~
CAPITU LO RESULTADOS YDISCU SION
Los resultados reflejados en la tabla 1.14 muestran que la inmovilizacin covalente
ha permitido la conservacin de toda la actividad con respecto al substrato sinttico de
pequeo peso molcular sobre tres de las cuatro estrateegias de inmovilizacin
desarrolladas. En el derivado preparado por inmovilizacin covalente sobre gel
glutaraldehdo-agarosa, a pesar de haber procedido, como en los otros casos, regulando
las condiciones de la reaccin hasta disminuir la reactividad de los grupos que
intervienen en el proceso, de modo que la inmovilizacin tuviera lugar de forma suave,
la actividad remanente ha descendido al 28% con respecto al substrato sinttico que
debera mostrar menores condicionantes a la hora de la inmovilizacin por ser de
pequeo tamao. Los soportes activados con glutaraldehdo presentan grupos de alta
reactividad capaz de reaccionar a pH prximo a la neutralidad (7,0-8,6), ello permite la
interaccin con grupos amino de laprotena como el amino terminal (pK 7,5-8,0) y algn
otro al que su posicin en la molcula hubiera disminuido su pK. Este mecanismo de
interaccin enzima-soporte la convierte en una estrategia en la que la unin multipuntual
estar a, en general, bastante impedida por el reducido nmero de grupos reactivos que
se podran encontrar disponibles. Como adems, el control de las condiciones de la
inmovilizacin ha sido muy estricto con el fin de bajar la reactividad para lograr una
inmovilizacin no distorsionante, en el caso de que hubiera ms de un grupo reactivo,
inicialente, en la enzima este control habra dirigido la inmovilizacin hacia una nica
unin; por ello es dificil pensar en la posibilidad de que la unin al soporte est
provocando distorsiones de la conformacin activa de la enzima. La explicacin a la baja
actividad hidroltica que muestra este derivado estara en pensar que el enlace con el
soporte glwaraldehfdo-agarosa ha tenido lugar por un grupo de la enzima implicado
directamente en la actividad cataltica bien por pertenecer al centro activo, bien porque
su modificacin provoca desequilibrios en la molcula que dificultan la unin de la
enzima o la propia catlisis.
En los derivados que han conservado toda su actividad cataltica frente al
substrato sinttico, se podra afirmar que las molculas no manifiestan alteraciones de
su configuracin activa, lo cual supondra un proceso de insolubilizacin pura en el cual
la interaccin a ha tenido lugar por el mnimo nmero de puntos. En el caso de los
derivados inmovilizados sobre soporte activado con grupos amino, soporte MN-
agarosa, por tratarse de grupos ionizables que no se inactivan al finalizar la
inmovilizacin en el medio de reaccin (pH ligeramente cido) interaccionarn
inicamente con las molculas de enzima unidas covalentemente a l, esta interaccin
83
! L] i
CAPITU LO 1
RESULTADOS YDISCU SION
es proporcional a la densidad de grupos reactivos del soporte y produce el descenso
proporcional de la actividadhidroltica. Parapodervalorar laestrategia de inmovilizacin
y determinar la prdidade actividad que corresponde a la inmovilizacin cov@lente y la
que es debida a las interacciones electrostticas, se ha medido la actividad en un media
con alta fuerza inica; ello permite obtener actividades mayores que, en el caso de los
derivados optimizados, alcanzan el 100%, lo cual indica que toda la cada de actividad
de los derivados optimizados utilizando soporte MANA-agarosa era debida a las
distorsiones provocadas por las interacciones inicas con el soporte y no por la unin
covalente al mismo.
Los valores de actividad coagulante residual (A.C.R.) de los derivados que
presentan toda su actividad cataltica frente al substrato pequeo, representados en la
misma tabla 1.14, indican que aunque se haya optimizado la inmovilizacin de una
enzima en lo que respecta a mantener intacto su centro activo, cuando la molcula de
substrato es ms compleja y voluminosa existen otros factores que afectan al proceso.
Estos factores dependen del grupo que haya participado en la inmovilizacin covalente,
siendo el soporte utilizado en todos los caso el mismo: agarosa 6B-CL. As los resultados
de actividad coagulante van de un 2,38% para el derivado glioxil-agarosa, al 15% para el
derivado obtenido por inmovilizacin a travs de las cadenas de azcares de la
glicoproteina. La explicacin podra ser que la casena por ser una molcula voluminosa
necesite la participacin de alguna zona de la molcula de enzima diferente de las que
participan en la unin del substrato pequeo y que se encuentre afectada por la
inmovilizacin; otra posibilidad sera que la presencia del soporte limite el acceso de la
macromolcula de substrato y la diferente orientacin de la molcula de enzima
conseguida al variar el grupo que participa en la unin covalente, d lugar a una
orientacin en la cual se reduzcan los impedimentos estricos a la entrada del substrato
por ofrecer un centro activo ms accesible.
La utilizacin de sonortes de morfologa interna ms abierta y, por lo tanto, que
suponen menor congruencia geomtrica enzima-soporte tuvocomo resultadoel aumento
de la actividad remanente de los derivados hasta el 25% con la orientacin ms
desfavorecida (segn los resultados, ya expuestos, obtenidos sobre agarosa). Cuando la
enzima se inmoviliz a travs de sus cadenas glicosiladas, orientacin ptima sobre
agarosa, los derivados conservan hasta el 33% de su actividad coagulante (Tabla 1.15).
84
CAPITU LO 1 RESULTADOS Y DISCUSION
Esto indica que el disponer del soporte con la morfologa interna ms adecuada
(Bupergil o Biosynth) y el utilizar la estrategia de inmovilizacin que permite a las
mol~ culas de enzima la adopcin de la mejor orientacin (unin covalente a travs de
la cadenas glicosdicas oxidadas al 1 5% a gel MANA-agarosa), ha permitido optimizar
los derivados enzimticos de renina para la hidrlisis de su substrato natural
macromolecular, casena ic.
DERIVADO DE RENINA DE Mucor miehei A.H.R. A.C.R.
glioxil-agarosa 100 2,38
MA.NA-agarosa/Asp-Glu 100 6,0
glutaraldehido-agarosa 28 9,6
MANA-agarosa/azucares * 100 15
BDE-agarosa 100 5,9
dextrano(100%)-agarosa-75 100 4,8
dextrano(90%)-agarosa-20 * 100 25
glioxil-Biosynth 100 25,1
glioxil-Eupergit 100 14,5
MANA-Biosynth/azcares * 100 28
MANA-Eupergit/azcares * 100 33
* Derivados optimizados con cada una de las tres estrategias
Tabla 1.15. Derivados de renina de M.mieheiopthnizados para cada uno de los mtodos de inmovilizacin
covalente utilizados.
Con respecto a la utilizacin de soportes con largos grupos reactivos a los cuales
se una la enzima para obtener la separacin suficiente entre la enzima y la superficie del
soporte, se han diseado dos tipos de soportes con diferente tipo de brazo espaciador.
85
u~;. u .
u u
CAPITU LO 1 RESU LTADOSYDISCU SION
El analisis y comparacin de los resultados obtenidos con cada uno de los soportes
permite proponer un modelo de estructura interna tanto para los soportes BDE-agarosa
como para los dos soportes dextrano-agarosa.
La cadena de 12 tomos de la molcula de 1,4-butanodiol-diclicidoxi-ter (BDE)
utilizada para la activacin del soporte de agarosa no parece haber sido suficiente para
reducir el impedimento estrico a la interaccin renina-caseina (tabla 1.15).
Se han sintetizado dos tipos de soportes de agarosa 6B-CL activado con brazos
espaciadores de cadena larga siguiendo procesos diferentes. Comparando los derivados
obtenidos por inmovilizacin sobre cada uno de los soportes, se ha propuesto la posible
estructura interna de estos soportes:
- El primer soporte que no ha permitido buenas actividades frente al
substrato voluminoso, ha sido preparado a partir de un soporte muy activado (75
gmoles de grupos reactivos/ml gel), por lo que es probable que entre las
molculas de dextrano (2,5 timoles de dextrano/m gel) y el soporte de agarosa
se hayan formado varios enlaces. Ello podra haber supuesto la formacin de un
denso recubrimiento de la superficie de la agarosa con el polmero. Ala hora de
la inmovilizacin, cada molcula de enzima interaccioner no con largos brazos
espaciadores ms o menos libres, sino con una cada de dextrano de movilidad
limitda a modo de seginda superficie que presenta impedimentos estricos
semejantes a los del soporte sin dextrano (figura 1.16 A).
- El segundo soporte se ha preparado haciendo reaccionar sobre gel
agarosa mucho menos activada (20 timoles de grupos reactivos/ml gel) molculas
de dextrano parcialmente oxidado. Los derivados obtenidos con este soporte
presentan una mayor Actividad Coagulante frente al substrato voluminoso, es
decir, estara permitiendo un acceso ms fcil de la casena K al centro cataltico,
por lo que podra suponerse una disposicin de las cadenas de dextrano mucho
ms abierta recubriendo la superficie del soporte. La unin menos intensa del
dextrano a agarosa le permitira actuar como un verdadero brazo espaciador
(figura 1.16 B).
86
~j . v
CAPITU LO 1 RESU LTADOSYDISCU SION
(A)
y-
Figura L16. Propuesta de la disposicin adoptada por las cadenas polildehdicas (dextmo oxidado) sobre
el gel MANA-agarosa en cada uno de los diferentes soportes preparados: Gel dextrano-agarosa-I (A)ygel
dextrano-agarosa-Il (B).
brazos
result
(Tabla
La flexibilidad de las cadenas polifuncionalizadas tipo dextrano utilizadas como
espaciadores entre la enzima y el soporte, su longitud y su cracter hidroflico
ser la ms adecuada para obtener actividades coagulantes remanentes del 25%
1.15).
87
u .
CAPITULO II
Inmovilizacin-estabilizacin de glicoenzimas:
Inmovilizacin-estabilizacin de la fi-galactosidasa de
Aspergillus oryzae para la hidrlisis de lactosa
88
CAPITU LO U INTRODU CCION
INTRODUCCION
1 . ESTABILIZACION DE ENZIMAS
La utilizacin de enzimas en qumica fina, medicina, tecnologa de alimentos o
quimica analtica requiere, en muchos casos, trabajar a elevadas temperaturas para
incrementar la productividad y prevenir contaminaciones microbianas, la introduccin de
cosolventes orgnicos para desplazar el equilibrio de la reaccin hacia la formacin del
producto deseado, o la incubacin en medios de pH diferente de aquel al cual la enzima
muestra su mxima estabilidad. La estabilidad limitada de estos biocatalizadores, su alto
coste y la dificultad de regeneracin condicionan sus posibilidades de aplicacin y por
ello gran parte de los estudios se han orientado al conocimiento de los mecanismos por
los que se produce la inactivacin enzimtica (procesos bimoleculares y procesos
unimoleculares) como base para el porterior desarrollode sistemas enzimticos de mayor
estabilidad.
La desnaturalizacin de una protena, en general, supone la prdida de la
estructura tridimensional nativa caracterstica de su cadena polipptidica, sin llegar a
alterar la secuencia de aminocidos. Factores como el calor, el pH, la presencia de
determinados cosolutos y/o cosolventes son los desencadenantes de dichos cambios en
la estructura tridimensional de la molcula, tan directamente ligada a la actividad
biolgica de cada protena. El aumento de la temperatura promueve movimientos
vibracionales en las molculas en solucin que conducen a su desplegamiento progresivo.
La exposicin de la protena soluble a pHs extremos induce cambios en el grado de
ionizacin de los diferentes grupos y, como consecuencia de ellos, la modificacin de su
posicin relativa.
La distorsin de la estructura terciaria nativa de la enzima puede ser considerada
como un proceso en dos etapas (4, 37) (figura 11.1): La primera etapa supone cambios
conformacionales sobre la molcula que conducen a un desplegamiento parcial y
reversible, siempre que se elimine el agente causante de la desestabilizacin y se
recuperen las condiciones ptimas del medio. Si, por el contrario, las condiciones
89
u u u ~u u u u
CAPITU LO II INTRODUCCION
desestabilizantes se extreman o se prolongan, este primer proceso reversible favorece que
sobre la enzima distorsionada tengan lugarreacciones posteriores de diferente naturaleza
tan intensas que hacen imposible la recuperacin de la disposicin relativa inicial de sus
grupos cuando se retorna al medio ptimo, es decir la molcula de enzima se inactiva
irreversiblemente. El resultado final sera una conformacin inactiva de la enzima, la
prdida de su estructura cuaternaria, procesos de agregacin intermolecular, disociacin
de cofactores, modificacin qumica de grupos inicialemente menos expuestos al medio,
etc. Por esta razn, una estrategia general de estabilizacin para protenas (o enzimas)
deber estar basada en la inhibicin de la primera etapa del proceso de inactivacin, es
decir en tratar de disminuir la posibilidad del primer desplegamiento de la estructura
proteica, pues un sistema que confiera rigidez a la molcula dificultar los primeros
cambios conformacionales reversibles impidiendo procesos posteriores ms graves (5).
Figura fl.1 . Desnaturalizacin-renaturalizacin de una protena globular.
La presencia de determinados compuestos en una solucin enzimtica ejerce un
pronunciado efecto estabilizante. Entre los aditivos utilizados para estabilizar enzimas
en solucin se encuentran azcares, alcoholes polihidroxilicos comoglicerol o etilenglicol,
determinados cosolventes orgnicos, substancias detergentes, polmeros y sales. El efecto
estabilizante ejercido por los azucares (sacarosa, lactosa, etc) o por alcoholes
polihidroxilicos parece ser el resultado de la interaccin preferencial de las protenas con
90
CAPiTU LO IT
INTRODU CCION
el medio acuoso en presencia de estos aditivos (38).
Tambin la modificacin qumica de protenas ha permitido modificar las
propiedades de las enzimas, permitiendo alterar su solubilidad, su actividad e incluso su
estabilidad. En este sentido se han conseguido modificaciones controladas de la
superficie de la enzima que provocan cambios en la interaccin entre sta y el medio,
favoreciendo el mantenimiento de su conformacin activa. Cuando la modificacin
qumica de la molcula tiene lugar con un reactivo bifuncional o polifuncional (39, 40)
la formacin de puentes o entrecruzamientos (covalentes, inicos, etc.), en muchos casos,
evita el desplegamiento de la macromolcula hacindola ms estable.
Todas aquellas estrategias de inmovilizacin que implican el aislamiento o
dispersin de cada molcula de enzima, aunque no disminuyan la inactivacin debida a
los procesos unimoleculares que afectan a la estructura 3Dde la enzima, suponen cierta
estabilizacin ya que evitan los contactos intermoleculares que podra dar lugar a
fenomenos de agregacin o autolisis, en el caso de proteasas, pero fue Klivanov (3) en
1983 el que propuso que, cuando la inmovilizacin de un enzima tiene lugar por
interaccin con una determinada matriz o soporte a travs de varios puntos, sta debera
ejercer un importante efecto estabilizador. Mozhaev et al. (4, 5) y Martinek et al. (6)
desarrollaron con xito esta propuesta de estabilizacin utilizando como estrategia de
inmovilizacin la copolinierizacin. Muchas de las estabilizaciones logradas por
entrecruzamiento se basan en el mismo concepto: el aumento de la rigidificacin de la
estructura tridimensional de la enzima (39). Desde el punto de vista biotecnolgico la
inmovilizacin multipuntual como estrategia de estabilizacin presenta un enorme
inters pues permite resolver mediante una nica tcnica los dos problemas principales
que limitan la aplicacin de biocatalizadores a nivel industrial: la reutilizacin y/oposible
uso en continuo, y la estabilizacin.
En principio la copolimerizacin es el mtodo con el que ms fcilmente podra
lograrse un alto grado de multiinteraccin, debido a la gran congruencia geomtrica
entre la enzima y la matriz polimrica, sin embargo las matrices presentan gran
sensibilidad al medio lo cual afecta directamente a las molculas de enzima integradas
en ella. Adems el proceso de polimerizacin no permite, en general, el control del
grado de interaccin de la enzimay la estructura cerrada del copolmero plantea grandes
problemas para la difusin de substratos y productos. En este sentido, la inmovilizacin
covalente multipuntual de enzimas a soportes slidos preexistentes supondra superar
91
CAPITU LO U INTRODU CCION
estas limitaciones, permitiendo, adems, la eleccin tanto del soporte adecuado cmo del
tipo de grupos reactivos, as como el control de las condiciones del proceso, con la
finalidad de conseguir en cada caso el soporte con la ade~uada congruencia geomtrica
que permita la multiinteraccin suficiente para frenar los posibles cambios
conformacionales de la enzima unida a l, afectando lo menos posible a su actividad para
su posterior y rentable aplicacin a gran escala.
La estrategia de inmovilizacin y estabilizacin por unin covalente multipuntual
desarrollada por Guisn a al. (7-12), gracias principalmente a las caractersticas de los
grupos reactivos del soporte y a la reversibilidad de cada enlace entre stos y los grupo
reactivos de la molcula de enzima, que se han descrito ampliamente en la Introduccin
General del presente trabajo, ha permitido un amplio estudio de todas las variables que
intervienen en el proceso de inmovilizacin (7, 8). Los resultados obtenidos de su
aplicacin sobre numerosas enzimas reflejan que se trata de una adecuada estrategia de
inmovilizacin y estabilizacin de protenas en general.
2. INMOVILIZACION-ESTABILIZACION DE GLICOPROTEINAS
Anivel biolgico la presencia de las cadenas de azcares en las molculas de las
glicoproteinas son imprescindibles por las caractersticas de hidrofilicidad, movilidad en
los tejidos o capacidad de unin a determinadas zonas de la clula que confieren a la
protena de la que forman parte.
Los estudios realizados iii vftro sobre glicoenzimas han demostrado que los
carbohidratos confieren a la glicoenzima resistencia frente a la accin de proteasas y, en
muchos casos estabilidad trmica (41-43>, siendo raros los casos en los que se haya
probado que la actividad enzimtica dependa de la presencia de los residuos glicosilo
(44, 45).
El importante efecto estabilizador de la fraccin glicosdica se ha relacionado con
el aumento de hidrofilicidad que supone su presencia en el entorno de la molcula y con
el establecimiento de interacciones no covalentes con la superficie proteica que
mantienen su conformacin activa. Segn Mozhaev et aL (46) la aproximacin ms
sencillay fiable para la estabilizacin artificial de una protena sera la hidrofilizacin de
la zona no polar de su superficie. En este sentido, la neo-glicosilacin o introduccin de
nuevos residuos azucarados sobre los grupos no-polares o sobre grupos prximos a zonas
92
CAPITU LO II INTRODU CCION
no-polares de la enzima supone un importante incremento de su estabilidad (47).
La utilizacin de estrategias generales de inmovilizacin o estabilizacin de
enzimas cuandose trata de molculas glicosiladas plantea importantes problemas debido
a que la presencia de cadenas glicosdicas en la superficie de la protena puede dificultar
la interaccin de los residuos de la estructura proteica (amino terminal, Lys, Asp /Glu,
etc.) con los grupos activos del soporte al cual se quiera inmovilizar la enzima. En
consecuencia se han diseado procesos en los cuales es la fraccin glicosdica la que
participa en la reaccin (48-50) lo cual, adems de evitar los problemas de accesibilidad,
presenta ventajas adicionales pues al participar en la reaccin grupos muy alejados del
centro activo la posibilidad de que el proceso afecte a la actividad enzimtica es mnima.
Aunque la justificacin para el desarrollo de estas estrategias es correcta desde
el punto de vista de la inmovilizacin, cuando se busca adems la estabilizacin de la
enzima por inmovilizacin multipuntual, surge una limitacin importante pues la fijacin
al soporte por estos puntos tan distantes e independientes de la zona proteica apenas
supondr rigidificacin adicional de la estructura espacial de la molcula, y por
consiguiente la ganancia en estabilidad de la estructura terciaria ser nula.
2.1. PROPUESTA DE ESTABILIZACION DE ENZIMAS GLICOSILADAS
A continuacin se describen las estrategias originales de inmovilizacin-
estabilizacin de enzimas glicosiladas desarrolladas en el presente captulo, as comolos
estudios de estabilidad realizados.
La propuesta desarrollada en este capitulo consiste en la utilizacin de dos
herramientas para el abordaje de la inmovilizacin-estabilizacin de glicoenzimas: En
primer lugar, el enriquecimiento de la superficie de la enzima en grupos reactivos con
el fin de que la inmovilizacin covalente al soporte tenga lugar a travs de mayor
nmero de puntos. De este modo se pretende compensar el impedimento estrico que
supone la presencia de las cadenas glicosdicas a la inmovilizacin multipuntial de la
enzima, insistiendo en la rigidificacin de la estructura 3Dcomo mtodo ptimo para la
estabilizacin. En segundo lugar y una vez inmovilizada la enzima se aprovechar la
presencia de las cadenas de los carbohidratos como agentes entrecruzantes intrnsecos
en busca de estabilizaciones adicionales.
93
u u ;J
CAPITU LO II INTRODU CCION
Las etapas seguidas en el proceso sern:
a.- fnmovizaci6n no distorsionante a travs de enlaces mu y estables.
Se estudiar la inmovilizacin de la enzima nativa sobre geles glioxil-
agarosa. Utilizando esta estrategia de inmovilizacin se han conseguido
estabilizaciones muy importantes de enzimas no glicosiladas aconsecuencia de la
fuerte unin multipuntual enzima-soporte (8-12).
b.- Enriqu ecfrnlento de la su perficie enzisntica en gru pos amino.
Dado que la presencia de las cadenas glicosdicas puede reducir el area
disponible para la interaccin con el soporte, se intentar aumentar la capacidad
de la enzima para realizar uniones multipuntuales. Para ello se relizarn
modificaciones controladas de los grupos carboxilo dela enzima con etilendiamina
(va activacin con carbodiimida). De este modo se espera que la densidad de
grupos amino capaces de participar en un proceso de inmovilizacin de tipo
multipuntual sea ms elevada que al utilizar la enzima nativa.
Evidentemente este tipo de procesos requieren un estricto control tanto
de la modificacin qumica en s como de la inmovilizacin posterior. La
optimizacin del proceso ha de suponer un compromiso entre una modificacin
qumica que altere lo menos posible las propiedades de la enzima soluble pero
suficiente para permitir la estabilizacin adicional consecuencia de la
inmovilizacin.
e.- Entrecru zamiento intramolecu ku - de la enzima nativa y de la enzima
enriqu ecida en gru pos amino u tilizando las propias cadenas glicosidicas como agente
entre cru zau te.
La oxidacin de las cadenas glicosdicas con peryodato generala formacin
de grupos aldehdo, los cuales pueden reaccionar con grupos amino de la misma
glicoprotena producindose entrecruzamientos intramoleculares. De este modo
se habr reducido la movilidad de los residuos implicados, con lo cual las
posibilidades de cambios conformacionales en la molcula sern menores,
pudiendo verse reducida la subsiguiente inactivacin.
Es interesante sealar que este tipo de estrategias son adecuadas para ser
desarrolladas sobre protenas en fase slida, es decir despues de haber sido
94
u.u
uu u ~i u u u
CAPITU LO II
INTRODU CCION
insolubilizadas, de otro modo la oxidacin, que en s supone la activacin del
agente entrecruzante intrinseco, podra producir reaccionesintermoleculares entre
los azcares de una molcula y los grupos amino de otra diferente. Al estar la
molculas independientes y enlazadas al soporte se puede disear un proceso de
entrecruzamiento exclusivamente intramolecular.
Ya que el enriquecimiento en grupos amino de la superficie de la enzima
descrito en el apartado b, puede afectar tanto a la inmovilizacin multipuntual
como al entrecruzamiento intramolecular se estudiar el proceso global para
obtener el mejor binomio de actividad y estabilidad.
d.- Estu dios de estabilidad de los derivados inmovilizados-estabilizados.
Tanto la unin covalente multipuntual a soportes activados como el
entrecruzamiento intramolecular deben producir el mismo tipo de mecanismo de
estabilizacin: la fijacin de las distancias entre diferentes residuos de lasuperficie
proteica y el consiguiente aumento de la rigidez de la enzima. Por ello los efectos
estabilizantes de dichas estrategias deberan observarse en cualquier tipo de
experimento de inactivacin. Sin embargo, al encontrarse los procesos asociados
a modificaciones qumicas de la enzima, ello puede suponer un efecto muy
diferente sobre la estabilidad de la enzima en funcin de las condiciones
experimentales bajo las que se encuentre. Para comprender los mecanismos
globales de inactivacin y para evaluar la estabilizacin conseguida se han
realizado estudios en diferentes medios de incubacin.
3. f? -GALACTOSIDASA DE Aspergillus oryzae
Laf3-galactosidasa Q3-galactosido galactohidrolasa, FC3.2.1.23) producida por el
hongo Aspergillus otyzae es una glicoproteina extracelular monomrica con un peso
molecular de 105.000 D. Con respecto a su composicin en aminocidos, posee un alto
contenido en Asp y Glu, 10,5 y 9,1 %, respectivamente y un 4,4% en Lys (51-52). Estas
cadenas de carbohidratos corresponden a oligosacridos de tipo galactomanosa que se
dividen en dos fracciones atendiendo a su logitud: el 4% corresponde a cadenas largas
y e] 96% restante est constituido por cadenas cortas. La fraccin azucarada total de la
glicoproteina supone un 11% del peso de la molcula y las cadenas se unen a la
estructura proteica a travs de residuos de N-acetil-glucosamina (53). El elevado
95
CAPITU LO II INTRODU CCION
contenido en azcares de esta glicoenzima de confiere gran estabilidad en medios cidos.
Su pH ptimo de actividad es 4,5 cuando su actividad se mide empleando el
substrato sinttico, oNPG 1, y 4,8 para lactosa, substrato natural. La temperatura ptima
se sita entorno a los 45-50
0C para el primero y a una temperatura algo menor (300C)
para el substrato natural (54). Los parmetros cinticos de la enzima varan en funcin
del substrato sobre el que acte, as se han determinado un valor de KM para lactosa de
50 mMy de 0,7 mMpara oNPG y una ~ de 2,4 y 55,6 gg/min.mg de protena para
lactosa y oNPG, respectivamente.
La presencia de glucosa (20-400 mM) o manosa en el medio de reaccin no
afecta a la actividad enzimtica, pero si la de galactosa que acta como inhibidor
competitivo, aunque tambin se ha reportado inhibicin no-competitiva producida por
el mismo monoscarido (55).
La presencia de NaO o KCl iones en el medio de reaccin reduce la actividad
enzimtica en mayor medida cuanto ms bsico es el medio (56). La hidrlisis de oNPG
es fuertemente inhibida por cationes divalentes como Cu2~, Hg2~ y A? ~.
Se ha logrado la inmovilizacin de esta enzima por mtodos muy variados. A
travs de su fraccin proteica: por unin covalente a matrices solubles de poliacroleina,
si bien los derivados conservan buenos valores de actividad enzimtica, la estabilizacin
conseguida es mnima (57); por reaccin con alginatos hidrosolubles activados con
carbodiimida consiguindose bajos rendimientos en la unin covalente e importantes
prdidas de actividad, sin haberse estudiado la estabilidad (58); por unin covalente a
soporte de magnetita activada convementemente con grupos aldehdo, obteniendose
derivados enzimticos muy estables, aunque con baja actividad remanente (59)o por
reaccin con un soporte poroso de SiO
2 silanizado y tratado con glutaraldehido (60). Se
ha llegado incluso a disear diferentes reactores para la hidrlisis de lactosa: reactores
de tipo de membrana enrollada, de lecho poroso (basados en la inmovilizacin de la
enzima sobre partculas de silice atrapadas en una lmina estriada microporosa de
polivinilo (61, 62) o de lecho fijo (63).
o-nitralc x iii fi-fl-galac topiranosido, introduc ido por Aizawa c omo
substrato c romognic o para galac tosdasas.
Aizawa, 1 < . 1 939. Enzymniologie 6 , 321 .
Ensayo: Sambrook, J., et al., Molec ular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ec l . ,
Cad Spring Harbor Laboratory, Vol 3, pg 1 6 .6 6 (1 989).
96
:1 1 1 . 4.
CAPITU LO II OBJEI]VOS
OBJETIVOS
En este captulose estudiar laf3-galactosidasa de Aspergillus oryzae, como enzima
de inters industrial y al mismo tiempo, como modelo para el desarrollo de diferentes
estrategias de estabilizacin de enzimas glicosiladas asociadas al proceso de
inmovilizacin, es decir, aplicadas durante y despus del proceso de inmovilizacin de
la enzima.
Se abordarn fundamentalmente tres estrategias de estabilizacin:
a.- La unin covalente multipuntual de la enzima nativa a soportes glioxil-
agarosa.
b.- El enriquecimiento de la enzima en grupos amino para optimizar su
unin covalente multipuntual sobre los geles de agarosa.
c.- La utilizacin de la propias cadenas glicosiladas de la enzima
inmovilizadas para promover entrecruzamientos intramoleculares entre
dichas cadenas y los residuos amino de la estructura proteica.
Adems se evaluar el efecto conjunto de las tres estrategias incluyndose la
modificacin qumica con etilendiamina de los residuos carboxlicos de la protena por
reaccin con carbodiimida, la unin covalente multipuntual de la enzima modificada
sobre el soporte, la oxidacin parcial de las cadenas glicosdicas de la enzima
inmovilizada; y la reaccin intramolecular de entre estas cadenas de azcares activadas
por oxidacin y la fraccin proteica de la propia molcula de enzima inmovilizada
multipuntualmente.
97
I t.
CAPITU LO II
OBJETIVOS
Dado que la mayora de las estrategias estn basadas en modificaciones qumicas
previas de la enzima (aminacin de Jos grupos carboxilo, oxidacin de Jos azcares) ser
necesario un control muy riguroso de todas~las reacciones, teniendo en cuenta el efecto
conjunto que sobre la actividad y estabilidad finales del derivado enzimtico puede tener
cada proceso.
Para finalizar se estudiarn las cinticas de inactivacin de los derivados en
diferentes condiciones experimentalews para una mejor evaluacin del efectocombinado
de modificaciones qumicas y estrategias estabiizantes.
98
u :
c APrrLJLo II
METODOS
METODOS:
1. ACTIVACION DEL SOPORTE DE AGAROSA
En este Captulo se han empleado dos soportes: el soporte glioxil-agarosa y el
soporte MANA-agarosa. La descripcin de los Mtodos de activacin se ha realizado en
elCapttulo 1 (Mtodos, Apanado 1.1.1).
2. ENSAYODEACTIVIDAD ENZIMATICADE LAI4-GALACTOSIDASADEAspergiLlus
oryzae
El ensayo utilizado ha sido el siguiente: A una cubeta con 2 ml de solucin de
substrato 10 mM en tampn acetato 0,1 M a pH 4,5 termostatizada a 25
0C y con
agitacin suave, se le aade una muestra de 25-200 pi de solucin enzimtica o de
suspensin de derivado. Del registro del incremento de absorbancia que se produce a
420 nmen funcin del tiempo transcurrido, se determinala velocidad inicial de hidrlisis
para este substrato la cual se dar en Unidades de Actividad. Se define la Unidad de
Actividad como la cantidad de enzima que ev capaz de hidrolizar 1 ano! de oNPG por
minuto a 250<2.
3. SEMIPURIFICACION DE LA fi-GALACTOSIDASA DEAspergillus oryzae
Se disuelve extracto comercial de 13-galactosidasa de A. oiyzae en una
concentracin de 2,5 mg/ml en tampn acetato 15 mM de pH 5,0 agua, por
centrifugacin se separa la fraccin no soluble. Al sobrenadante se le aade gel MAN-
agarosa de 75 gmoles/ml gel resultando una suspensin 1:170 que se mantiene con
agitacin suave, a pH5,0 y temperatura ambiente durante 2,5 horas. La adsorcin inica
de la enzima sobre el soporte se aprecia al disminuir la actividad enzimtica del
sobrenadante.
99
CAPITULO fi
METODOS
Se filtra y se lava el gel con tampn acetato 15 mM de pH 5,0 abundante para
eliminar todo lo que no se haya adsorbido. Se resuspende en tampn fosfato 20 mM,
NaCI 0,1 M de pH 7.0, fro y se maptiene la suspensin 1:6, a unos 4
0C, el tiempo
necesario para que se desorba la mxima cantidad de enzima. Se filtra, recogiendo el
sobrenadante para dializarlo frente a tmpn acetato 15 mMde pH 5,0 en la cmara fra.
La solucin enzimtica semipurificada se conserva en la cmara fradurante varios
das.
4. MODIFICACIONQUIMICADE LAENZIMANATIVACONETILENDLALMINA(1,2-
diaminoetano)
Los grupos carboxilo de la enzima se modifican con etitendiamina (RDA)
siguiendo el mtodo desarrollado por Hoare a al. (64).
Un volumen de solucin enzimtica semipurificada y dializada de
aproximadamente 300 U.A.H./ml se diluye a la mitad con una solucin de RDA 2M a
pH 4,75. Unavez comprobado que el pH se mantiene, se agrega carbodilmida (CDI) de
forma que su concentracin final sea 1.10.2 My se incuba con agitacin suave a 200C
durante 1,5 horas. Transcurrido este tiempo se procede a dializar frente a una solucin
tampn de acetato 15 mMal mismo pH de 5 litros realizando 5 cambios para favorecer
la rpida eliminacin de los reactivos del medio, y en cmara fra para disminuir las
posibilidades de reaccin entre los grupos hasta que la eliminacin de reactivos del
medio sea total.
Por otra parte, tambin se realizan otras modificaciones qumicas ms moderadas,
suavizando las condiciones de reaccin, tanto subiendo el pH a 6,0, como disminuyendo
la concentracin de CDI hasta 1.101 M. Con ello se pretende disminuir el grado de
activacin de los carboxilos y, por tanto, la reactividad de estos grupos hacia la RDA.
A los tres tipos de modificacin qumica logrados se les ha denominado:
modificacin 5.2,5.3 y 6.2, en alusin a los dos parmetros que se varan: pH de reaccin
(4,75 6,0) y concentracin de CDI (1.10.2 6 1.10~ M).
100
CAPITULO fi
METODOS
5. PREPARACION DE DERIVADOS DE p-GALACTOSIDASADE Aspergillus oryzae
Se han preparadoderivados enzimticos por inmovilizacin a soportes de agarosa,
tanto de la enzima nativa como de la enzima modificada previamente con RDA.
En un determinado volumen de solucin enzimtica semipurificada, concentrada
y dializada (Apartado 3), con una actividad aproximada de 300 U.A.H./ml se disuelve
galactosa al 20%, enfriando hasta 4
0C. La solucin resultante se diluye a la mitad con
tampn bicarbonato 40 mMde pH9,5, tambien enfriado previamente, e inmediatamente
se suspende en ella el gel glioxil-agarosa en relacin 1:2. Se ajusta el pH a 10,2 y la
temperatura a 150C. Despus de 3 horas de incubacin de la suspensin de reaccin en
estas condiciones con agitacin suave, se procede a la reduccin con NaBH
4 (lmg/ml)
a 15
0C durante 45 minutos, no sin antes haber diluido la suspensin hasta 1:10 (v:v) con
el mismo tampn. Posteriormente se filtra, lavndose abundantemente con tampon
fosfato 25 mM de pH 7.0 y con agua.
Esta descripcin del mtodo de preparacin del derivado es la que corresponde
al derivado de la enzima nativa considerado como optimizado despus de haber
modificado parmetros como el pH (10,0, 10,2 y 11,3), la temperatura (4, 15 y 200C> y
el tiempo (entre 30 minutos y 20 horas) para la interaccin enzima-soporte.
Para la preparacin de los derivados de la enzima previamente modificada con
EDAel mtodo seguidoes semejante. Paraofrecer mayor cantidad de enzima al soporte,
la suspensin de reaccin se preparaen relacin 1:5 y se incuba a pH9,0 a 200C durante
2,5 horas inmovilizndose prcticamente el total de la enzima ofrecida. A continuacin
se sube el pH de la mezcla de incubacin a 10,0, mantenindose 72 hora ms a la misma
temperatura y pH, siempre con agitacin suave. La reduccin en este caso se realiza una
vez diluida la suspensin hasta 1:10 con el mismo tampn de pH 10,0.
6. MODIFICACION QUMICA CONNatO,< DE LOS DERIVADOS ENZIMATICOS
Se han modificado qumicamente con NaJO
4 los derivados enzimticos tanto de
la enzima nativa, como de la enzima modificada previamente con RDA.
Se trata una suspensin 1:10 en agua del derivado optimizado de j3-galactosidasa
nativa sobre gel glioxil-agarosa-75 (Mtodos 5.1) con NaJO4 a temperatura ambiente,
101
CAPITULO U
MrroDos
ofreciendo 3.10.2 imoles por U.A.H. (4,5 U.A.H./mg extractocomercial 25 U.A.H./mg
protena semipurificada) que correspondera a 3,86 gmoles/ml derivado. Se manteniene
la incubacin a temperatura ~ambiente y con agitacin constante hasta alcanzar al
consumo mximo de NaIO
4, lavando a continuacin con agua abundante.
Para modificaciones moderadas (25 50%) de este derivado se trata con 0.75.10.2
1,5.10.2 p.moles NaIO4/U.A.H., respectivamente.
Para la oxidacin con pexyodato de los derivados de la enzima modificada
previamente con EDA se realiza siguiendo el mismo mtodo. Independientemente de
la actividad final de los derivados preparados con enzima modificada con RDA y por
haber sido idnticos los rendimientos de la inmovilizacin, se trata una suspensin 1:10
de derivado en agua con 3,86 moles de NaIOVml derivado, incubando hasta el
consumo mximo del agente oxidante.
7. ENTRECRUZAMIENTO INTRAMOLECULAR
La estrategia desarrollada consiste en el aprovechamiento de las cadenas
glicosidicas de la glicoenzima como agente entrecruzante intrnseco. El proceso consiste
en la reaccin de los grupos aldehdo producidos por oxidacin de las cadenas
glicosdicas y los grupos amino superficiales de su fraccin proteica. La reaccin se lleva
a cabo sobre los derivados de enzima inmovilizada.
Se suspende el derivado glioxil-agarosa de 13-galactosidasa (modificada o no con
RDA) oxidado con NaJO4 en tampn fosfato sdico de pH 7,0 en el que previamente se
haba disuelto TMAB 150 mM. La mezcla de reaccin se mantiene a pH 7,0, con
agitacin suave y a temperatura ambiente durante tiempo variable. Cuando la incubacin
se prolonga durante das, cada 48 horas se filtra el derivado y, sin lavarlo, se resuspende
en una nueva solucin de incubacin en idntica relacin. Transcurrido el tiempo
deseado, se diluye la suspensin con tampn bicarbonato 40 mM, galactosa 20% de pH
9,0 a 4
0C, agregando 1 mg/ml de NaBH
4. La suspensin se agita suavemente y despus
de una hora se filtra y se lava abundantemente con tampn fosfato de pH 7,0 y con agua.
102
CAPITULO II
METODOS
8. ENSAYOS DE ESTABILIDAD ENZIMATICA
Se realizan incubaciones de los diferentes derivados obtenidos en medios
tamponados de acetato 20 mMa pH 4,5 y 50
0C, de fosfato 20 mM a pH 7,0 y 500Cy de
bicarbonato 20 mMa pH 9,0 y 250C. Cada cierto tiempo se extraen de cada suspensin
enzimtica alcuotas de 20-200 gl para el ensayo de sus respectivas actividades
remanentes. Se representan los porcentajes de estas actividades puntuales respecto a las
iniciales en funcin del tiempo. De este modo se pueden comparar estabilidades de
diferentes derivados, o del mismo en diversas condiciones de incubacin, as como
determinar las semividas de la enzima en dichas condiciones.
103
CAPrFULo U
RESULTADOS YDISCUSION
RESULTADOS Y DISCUSION
1. SEMIPURIFICACION DEL EXTRACTO ENZIMATICO COMERCIAL
Con el fin de eliminar de la solucin de extracto enzimtico comercial, otros
productos diferentes de la propia $-galactosidasa como estabilizantes restos de
tratamientos previos o del cultivo celular original, que podran interferir en el proceso
de inmovilizacin de la enzima, se ha considerado conveniente la semipurificacin de la
solucin de la solucin del extracto comercial de 3-galactosidasa de A. oryzae.
Segn experimentos previos realizados en el laboratorio (65), el trabajar con la
solucin enzimtica previamente semipurificada afecta al proceso de inmovilizacin
covalente sobre soporte glioxil-agarosa en dos sentidos: acelerando la velocidad de
insolubilizacin y favoreciendo la prdidade actividad enzimtica residual del derivado
obtenido. La explicacin a este comportamiento podra encontrarse en que al eliminar
del medio ciertas impurezas del extracto crudo se evita su interferencia en el proceso de
inmovilizacin de la enzima, y por eflo la insolubilizacin se favorece y la unin al
soporte es ms intensa, provocando mayores prdidas de actividad.
El mtodo seguido para la semipurificacin consiste en la adsocin-desorck5n
diferencial a geles M4NA-agarosa. Durante la incubacin de la solucin enzimtica a pH
5,0 en presencia del soporte tiene lugar la adsorcin inica de la protena, a travs de
sus grupos carboxilo al soporte activado con grupos amino. El posterior lavado con el
mismo tampn de pH 5,0 permite la eliminacin de todo aquello que no se encuentre
ionizado. Resuspendiendo el soporte bien lavado en el medio adecuado se favorece la
desorcin de la enzima, obtenindose la solucin enzimtica semipurificada. El mtodo
que se ha seguidopara la semipurificacin de la solucin enzimtica ha sido modificado
con respecto al utilizado por Santana (65). La modificacin introducida afecta a la etapa
de desorcin y supone, en primer lugar, la substitucin del medio de pH 10,0 en el que
se resuspende el gel, por una solucin tampn de pH 7,0 y con alta fuerza inica capaz
de romper las interacciones inicas establecidas entre la enzima y el soporte, de este
modo se evita exponer a la enzima a un medio bsico desestabilizante para la /3-
104
. 1
CAPITULO TI
RESULTADOS YDTSCUSION
galactosidasa de A. otyae, y segundo, la suspensin del gel en un volumen de tampn
menor que el de la suspensin de adsorcin, de forma que la desorcin de toda la
protena del soporte suponga la obtencin de una solucin enzimtica concentrada.
La incubacin a pH5,0 de la solucin de extracto enzimtico comercial (4,5 U/mg
extracto) en presencia del gel MANA-agarosa ha permitido la adsorcin del 93-98% de
la enzima en 1 hora a temperatura ambiente. Una vez lavado el gel y eliminado, por lo
tanto, todo aquello que no se hubiera adsorbido, al resuspender el soporte en tampn
de pH 7,0 y con alta fuerza inica (NaC 0,1 M) se logr la desorcin del 82-89% de la
enzima en 3-5 horas.
El proceso de semipurificacin llevado a cabo no afecta a la estabilidad de la
enzima, siendo idntica para la solucin del extracto enzimtico crudo y para la
semipurificada: mantienen el 100% de su actividad durante 5 das incubada a 4
0C y pH
7,0, y muestra un valor de semivida de 1,5-2 horas a 550C y pH 7,0.
2. INMOVILIZACION DE LA $-GALACTOSIDASA DE A. oryzae POR UNION
COVALENTE SOBRE SOPORTE GLIOXIL-AGAROSA
El objetivo de la inmovilizacin covalente de la 3-galactosidasa de A.otyzae al
soporte glioxil-agarosa no slo es lograr que sta se insolubilice, sino que se formen
entre ambos enlaces capaces de ayudar al mantenimiento de la estructura tridimensional
de la enzima por conferirle mayor rigidez que cuando la molcula se encuentra libre en
el medio. La inmovilizacin de la molcula al soporte a travs de cadenas o grupos
reactivos de pequeo tamao y numerosos, hace que se mantenga fijala posicin relativa
entre estos puntos, confiriendo resistencia al conjunto y limitando las posibilidades de
deformaciones y desplegamientos provocados por las condiciones del medio.
Se han tomando como punto de partida experimentos previos realizados en el
laboratorio (65). En la tabla 11.1 se recogen dos de los derivados enzimticos que se han
obtenido, mostrndose el efecto de la duracin de la interaccin y de la temperatura a
la que tuvo lugar dicho proceso, sobre la actividad enzimtica remanente que conserv
la enzima inmovilizada covalentemente. Cuando la interaccin tuvo lugar a200C durante
2 horas el derivado mostr una actividad remanente del 70 % (derivado A.1), mientras
cuando el proceso de interaccin se alarg hasta 19 horas y se elev la temperatura hasta
los 250C la actividad remanente descendi al 20% (derivado A.3). El derivado A.3 fue
105
CAPITULO fi
RESULTADOS YDISCUSION
el nico que mostr una ligera estabilizacin, sin llegar a duplicar la semivida de la
enzima en solucin.
derivado pH~,,
0,, t~1~ ~ Act.rem.(* )
A.1 10,0 2h/20
9C 70
A.3 10,0 5h/20~C y 17h/252C 20
10,2 3h/152C 75
(*) Porcentage de actividad enzimtica remanente en cada derivado preparado segn la condiciones
experimentales indicadas
Tabla fl.1. Derivado de ~-gaactosidasa de A. oyzae optimizado en relacin a los derivados preparados
con anterioridad.
Basndose en estos resultados, se procedi a optimizar los derivados enzimticos,
buscando aumentar la reactividad enzima-soporte mediante modificaciones de las
condiciones de inmovilizacin (pH, temperatura, tiempo de interaccin, cantidad de
enzima ofrecida) que favorezcan la multiinteraccin. Se prepararon diferentes derivados
(resultados no mostrados), de los cuales el de mayor estabilidad no superaba el mejor
valor de semivida logrado con el derivado denominado A.3. Para su preparacin se
alcaliniz ligeramente el pH hasta 10,15-10,2 para aumentar la reactividad de los grupos
amino superficiales de la enzima que reaccionan con el soporte, bajndose la
temperatura hasta 150C para evitar la inactivacin de la enzima. Este derivado se
denominA.3,,~,~ por presentar lamisma ganancia de estabilidadque el derivado A.3,
a costa de una menor prdida de actividad enzimtica (25%), lo cual indica la menor
distorsin por unin al soporte.
En todos los casos la inmovilizacin ha tenido lugar en presencia de galactosa. La
galactosa, como inhibidor competitivo, protege al centro activo, favoreciendo su
conformacin espacial ptima, evitando por tanto que ni las condiciones del medio, ni
la interaccin con el soporte puedan distorsionarlo. Concretamente, para la
inmovilizacin de esta /3-galactosidasa su presencia es imprescindible para el
mantenimiento de la estabilidad de la enzima a pH 10,0-10,2 durante el tiempo que dura
la inmovilizacin hasta la reduccin de los enlaces formados.
106
1 1
CAPiTULO II RESULTADOS YDISCUSION
Con respecto al estudio del proceso de inmovilizacin de 13-galactosidasa de A.
oyzae sobre soporte glioxil-agarosa se puede sealar que el control de las condiciones
de inmovilizacin permite modificar la actividad remanente del derivado resultante.
Cuando la inmovilizacin provoca caidas importantes de la actividad enzimtica, pese a
esta gran inactivacin consecuencia de la interaccin ms intensa con el soporte, los
derivados obtenidos no muestran estabilizaciones equitativas (Figura 11.2). Lainteraccin
intensa con el soporte no permite una multiinteraccin capaz de conferir una
rigidificacin de la estructura 3Dtal que la enzima se vea estabilizada.
loo
4>
4-
e
4>
e
u
~5O
4>
Lu.
u
u
Z25
u
o
tiempo (horas)
Figura fl.2. Estabilidad trmica de la 3-galactosidasa de A.o,yzae nativa (.) y de un derivado de sta
mmovilizada covalentemente sobre el soporte glioxil-agarosa (e)
Todo ello manifiesta de forma clara que la inmovilizacin de la enzima a travs
de sus grupos amino no ha permitido el nmero de enlaces suficiente para proporcionar
a la molcula rigidez de su estructuraterciaria. El nmero de residuos de Lys es de 34-39
107
0 6 12 18 24
I i
CAPITULO U
RESULTADOS YDISCUSION
por molcula (51, 52), relativamente alto, si se compara este nmero con los 14 residuos
Lys que posee tripsina (40.000 D), los cuales han permitido establecer interaccin
mximaa trav$ de 7 residuos, confiriendo una estabilizacin de 5.000 veces con respecto
a la enzima soluble en ausencia de autolsis (8). La explicacin de este diferente
comportamiento de la /3-galactosidasa podra encontrarse en que se trata de una
glicoenzima: la presencia de las cadenas de oligosacridos planteara un importante
impedimento estrico a la interaccin entre los grupos enzimticos de la superficie de
la fraccin proteica con los grupos glioxilo del soporte, por lo que las posibilidades de
interaccin multipuntual, y en consecuencia de estabilizacin, seran bajas. Otro factor
a tener en cuenta es que, de los 39 residuos de Lys solamente 12 aminos primarios se
encuentran en la superficie de la molcula (66), lo cual unido a la presencia de los
azcares y al gran volumen de la molcula (90.000 D) reduce considerablemente la
posibilidad de formacin de varios enlaces y de que estos confieran estabilidad a una
molcula tan voluminosa.
3. ENRIQUECIMIENTO DE LA GLICOPROTEINA EN GRUPOS REACTIVOS
SUPERFICIALES
Dado que la inmovilizacin de la enzima nativa sobre gel gIioxll-agarosa-75 no ha
permitido la estabilizacin de la estructura tridimensional, ni siquiera forzando las
condiciones para lograr mayor grado de unin covalente, se ha estudiado la posibilidad
de preparar derivados de la enzima previamente enriquecida en grupos reactivos
superficiales, buscando con ello el aumento de la posibilidad de unin covalente
multipuntual al mismo soporte para lograr una interaccin ms intensa que confiera
rigidez a la estructura 3D que se refleje en ganancia de estabilidad.
Para aumentar la cantidad de grupos amino de la protena en su superficie, se
procedi a la modificacin qumica con etilendiamina (EDA) de otro grupo que tambin
se encuentra mayoritariamente en la superficie proteica por ser un grupo hidrofilico: el
grupo carboxilo, perteneciente tanto a los residuos Asp como Gla de la cadena peptdica
(60). La disposicin superficial de estos grupos hace que sean accesibles y por ello
fcilmente modificables con mtodos relativamente sencillos.
El proceso de modificacin qumica de los grupos carboxiio de la enzima nativa
con RDA consta de dos pasos sucesivos: la activacin de los grupos carboxio con
carbodilmida (CDI) y el posterior ataque nucleofilico de este complejo sobre un grupo
108
CAPITULO II
RESULTADOS IDISCUSION
amino del reactivo (EDA), que a pH cido (4,75-6,00) se encontrar protonado (64).
El control del grado de modificacin qumica se ha realizado a travs de la
modificacin de las condiciones en las que tiene lugar la reaccin, de forma que se vea
alterada la reactividad de las especies que en ella intervienen. As se han utilizado dos
concentraciones diferentes de activador (CDI): 1.102 y i.i0~ My se ha variado el pH del
medio de reaccin: pH: 4,75-5,0 y pH 6,0. El estudio ha dado lugar a tres tipos de
modificacin qumica que se han denominado: niodllicacin-5.2, 5.3 y 6.2, en alusin a
los valores que toman los parmetros que se varan (pH de la reaccin y concentracin
de CDI). En estudios previos realizados en el laboratorio con a-quimotripsina
inmovilizada se demostr que el grado de modificacin alcanzado sobre derivados
modificados-5.2 es del 100%, por modiflcacin-6.2 del 45%, y por modiflcacin-5.3 del
25% (67).
Para cuantificar el alcance de la modificacin qumicaconseguida enlos diferentes
tratamientos es necesario determinar los efectos que causan tanto sobre la actividad y
la estabilidad de la enzima en solucin como sobre el proceso de inmovilizacin, los
parmetros que defines el proceso.
3.1 . MODIFICACION QUMICA CON RDA DE LA ENZIMA EN SOLUCION
La actividad remanente de la solucin de /3-galactosidasa semipurificada despus
de 1,5 horas de reaccin con EDA 5.2 se mantiene en el 100%. Esto indica que ni la
activacin con CDI ni la reaccin conRDA afectan a su actividad enzimtica. Lo mismo
ocurre con los tratamientos ms suaves: 5.3 y 6.2.
Debido a que todas las especies implicadas se encuentran solubles, la nica
manera de detener la reaccin es por la eliminacin de los reactivos (CDI y RDA)
mediante dilisis. Esto quiere decir que la reaccin se ver prolongada hasta que los
valores de concentracin de reactivos y/o la acidez del medio hayan disminuido lo
suficiente como consecuencia de la dilisis.
Una vez eliminados por dilisis los reactivos de la modificacin con RDA, las
soluciones enzimticasmostrarn prdidas de actividad enzimticabastante importantes.
La modificacin qumica-6.2 es la que permite conservar un mayor porcentaje de
actividad, el 69-76% de la actividad enzimtica en relacin a la que tena la disolucin
nativa (semipurificada), frente al 52 y 68 % de las otras dos aminaciones-5.2 y 5.3,
109
CAPITULO U RESULTADOS YDISCUSION
respectivamente.
En la figura 11.3 se muestra la diferencia de estabilidad de la enzima soluble
modificada con RDA con respecto a la que tiene en su estado nativo, tanto a pH 7,0
como 9,0, aprecindose un claro efecto desestabilizante de la modificacin qumica.
1 00
4,
e
a>
e
0
E
2
O
.5
o
O
75
50
25
o
1 00 -4
75
a,
e
a,
e
0
O
0
o
0
-J
50
25
o
(B)
o
6 12
18
ti empo (ho ras)
24
3 0
Figura 11.3. Efecto de la modificacin qumica (5.2) con EDA sobre la estabilidad trmica de la j3-
galactosidasa deA.oryzae: (a) nativa 1(e) modificada-5.2. (A) en solucin en tampn fosfato 20 mM de pH
7,0 a 50
0C y (B) en solucin en tampn bicarbonato 20 mM de pH 9,0 a 250C.
110

0 1 2 24 3 6 48 60 72
ti empo Cho ras)
CAPITULO U
RESULTADOS YDISCUSION
La CDI es un compuesto de gran reactividad frente a los grupos carboxilo y de
baja estabilidad en solucin, por ello es de suponer que tanto la reaccin de activacin
de los grupos carboxilo como la reaccin de stos con la RDA han de tener lugar en un
espacio corto de tiempo cuando las condiciones de reaccin son idneas como las que
se han elegido para estos tratamientos. Por ello no parece muy probable que la
modificacin qumica haya continuado durante la dilisis afectando la actividad
enzimtica, de ser as alguna cada de actividad se hubiera detectado en la primera hora
y media de la reaccin previa a la dilisis. Posiblemente la baja actividad remanente
observada se debe a la desestabilizacin provocada en la molcula consecuencia de la
modificacin qumica, y no a que la modificacin qumica haya afectado a grupos
esenciales para la actividad.
El control de la reactividad a travs de la disminucin de la concentracin de CDI
en el medio de 1.10~ M a 1.10~ My/o del aumento del pHde la reaccin de 4,75 a 6,0,
ha permitido modificaciones qumicas ms suaves: nodiflcacin-S.3 y niodiflcacn-6.2,
reflejadas en la mayor actividad remanente despus del proceso, respectivamente 52 y
64% (ver figura 11.5).
3.2. INMOVILIZACIONCOVALENTESOBRESOPORTEGLIOXIL-AGAROSADELA
ENZIMA MODIFICADA CONEDJ4
Se trata de una enzima cuyos grupos carboxilo se encuentran modificados
quimicamente con RDA y, en consecuencia, de una protena con grupos amino
superficiales de dos tipos segn su origen: un primer bloque formado por los grupos
amino nativos en los que se incluyen tanto los procedentes de la cadena lateral de los
residuos de Lys con un pK de 10,2, como el amino terminal de la cadena polipeptdica
con un pK menor, y un segundo bloque que agrupa a los que son producto de esta
modificacin qumica con RDA de los carboxilos procedentes de los aminocidos Asp y
G Ui, que tambin tendrn un pK bajo debido a la proximidad de otrol grupo amino
secundario introducido.
La presencia de estos umnuevostl gruposamino podra permitir la inmovilizacin de
la enzima en un medio menos bsico (pH 9,0), con lo que la estabilidad de la enzima en
solucin ser mayor, favorecindose por ello la inmovilizacin en su forma activa. Una
vez que se haya producido la unin al soporte en condiciones de buena estabilidad, se
podra forzar la participacin de los grupos amino originales de la enzima simplemente
111
L
CAPITULO II
RESULTADOS YDISCUSION
con la incubacin a un pH ms alto (pH
multiinteraccin enzima-soporte.
En la figura 11.4. se representa el
nudiflcada-5.2 con ElIA.
loo
e-
e
4~
c
e
c
u
E
e
~0
u
>1
CI
< u
75
50
25
o
10,0), con el fin de lograr una buena
curso de inmovilizacin de la enzima
Figura 1.4. Representacin del proceso de inmovilizacin de la enzima modificada-5.2 sobre el soporte
glioxil-agarosa-75: (U) actividad remanente de la suspensin, (e) actividad remanente del sobrenadante
y (u) actividad remanente de la solucin-control (enzima libre incubada en las mismas condiciones en
ausencia de soporte. Condiciones experimentales descritas en Mtodos.
La mayor reactividad
permite la inmovilizacin en
Transcurrida hora y media
de los nuevos grupos amino y la buena estabilidad a pH 9,0
forma activa del 88 % de la enzima ofrecida en 30 minutos.
se contina la incubacin a pH 10,0 para favorecer la
e
9
o> ,
9
4-4
o
*
36 42 6 12 18 24 30
tiempo (horas)
48
112
CAPITULO 1 1
RESULTADOS YDISCUSION
interaccin de los grupos reactivos de pKmayor (p.e. Lys) y en consecuencia la reaccin
con el soporte por un mayor numero de puntos. As, mientras la solucin de enzima libre
(soluble) modificada-Si, incubada a pH 10,0 se inactiva totalmente, la misma enzima
insolubilizadapreviamente a pH 9,0 sobre el soporte glioxil-agarosa conserva un 25% de
su actividad transcurridas 72 horas a pH 10,0.
Cuando la inmovilizacin tiene lugar con la enzima modiflcada-5,3 y 6.2, la
actividad remanente que muestran los derivados es del 46 y 38 % , respectivamente,
despus del proceso de inmovilizacin y multiinteraccin covalente.
Para poder comparar el grado de modificacin qumica con su efecto sobre la
actividad enzimtica, en la figura 11.5 se muestran las actividades remanentes sucesivas
consecuencia de la modificacin qumica con EDA de la enzima soluble y de la
inmovilizacin covalente.
a>
4-
a>
o
(u
E
a>
-D
(u
-D
.5
:
4-
< a
(u
1 00
75
50
25
o
Figura li.5. Efecto del control de la modificacin qumica con EDA sobre la actividad enzimtica
remanente de la enzima en solucin y de los derivados preparados por inmovilizacin. N: enzima nativa.
113
CAPITULO II RESULTADOSYDISCUSION
En todos los casos se inmoviliza el 100%, por tanto las actividades finales
ensayadas de cada derivado correspondern a la residual de los dos procesos:
modificacin qumica de la enzima soluble e inmovilizacin: 13, 28 32% segn si la
modificacin qumica haya sido 5.2, 6.2 5.3, respectivamente.
A la vista de estos valores, se puede afirmar que suavizando las condiciones de
la modificacin qumicael rendimiento final de la inmovilizacin no se ve afectado, pero
la intensidad de la interaccin entre la enzima y el soporte disminuye sensiblemente
manifestndose en el mantenimiento de su actividad enzimtica
.
No se ha podido determinar si los mejores resultados de actividad remanente
inmovilizada son debidos a una interaccin menos distorsionante de la molcula (menor
multiinteraccin) o a una mayor estabilidad de la enzima durante el proceso. La
respuesta se obtendr del estudio de estabilidad de los derivados.
El seguimiento del proceso de preparacin de los derivados ha permitido tener
un primer indicio de que el enriquecimiento en grupos reactivos superficiales de la
enzima est permitiendo cierta multiinteraccin en la unin enzima-soporte, puesta de
manifiesto en la mayor estabilidad durante la incubacin a pH 10,0 de la enzima unida
al soporte frente a la enzima libre. Para afianzar esta hiptesis de estabilizacin, se ha
realizado la inactivacin trmica de los diferentes derivados enzimticos obtenidos con
la enzima con mayor gradode modificacin qumica (modificacin-Sl), preparados por
interacciones enzima-soportems omenos prolongadas, comparandosu comportamiento
con el de la enzima en solucin (Figura 11.6)
La incubacin durante la inmovilizacin de la enzima aminada 5.2, una vez que
se ha insolubilizado a pH 9.0, en un media ms alcalino de forma que se favorezca la
participacin de todos los grupos amino superficiales (pH 10,0), ha permitido lograr un
incremento de termoestabilidad con respecto a la enzima modificada libre en solucin.
Esta termoestabilizacin, que segn se puede apreciar en la figura 11.6 ya se
produce con la simple insolubilizacin y con tiempos cortos de incubacin (3 horas a pH
10,0), se v favorecida al prolongarse la interaccin (3 o 4 das a pH 10,0). Resultando
un derivado enzimtico obtenido por incubacin durante 4 das con una estabilidad apH
7,0 de 40-60 veces mayor que la de la $-galactosidasa modificada soluble, lo cual supone
la extensin de la semivida desde unos 15-20 minutos para la enzima aminada-S.2 en
solucin, hasta los 20 das para el citado derivado-5.2 de 4 das.
114
CAPITULO fi RESULTADOS YDISCUSION
1 00
~r75
4>
4>
u
250
4>
La
u
u
a
Z25
u
o
tiempo (horas>
Figura fl.6. Influencia de la duracin de la interaccin con el soporte sobre la estabilidad trmica de la
$-galactosidasa de A. oryzae modificada-5.2 con EDA e inmovilizada sobre gel glioxil-agarosa. (.) enzima
soluble modificada-5.2, (x) derivado resultante despusde 3 horas de incubacin, (e) derivado resultante
despus de 3 das de incubacin, y (U) derivado resultante despus de 4 das de incubacin. Incubacin
en tampn fosfato 20 mM de pH 7,0 a 50
0C.
Esta divergencia en las termoestabilidades entre los derivados y la enzima
modificada soluble, conseguida con el aumento progresivo del tiempo de interaccin
entre los grupos reactivos, indica que con la aminacin de la enzima soluble se ha
conseguido aumentar las posibilidades de unin de la enzima al soporte. El tiempo de
contacto ha de ser suficientemente largo para permitir sucesivas interacciones que
concluyan en uniones cada vez ms numerosas, las cuales provocan la consiguiente
rigidificacin de la estructura terciaria de la cadena polipeptidica, que se manifiesta en
el freno a la desnaturalizacin trmica ya acelerada por la modificacin con EDA.
115
0 3 8 9 1 2 1 5 1 8
I I
CAPiTULO 1 1
RESULTADOS YIMSCUSION
> Estabilizacin trmica frente al correspondiente derivado unipuntual
Se han preparado derivados de cada una de las enzimas modificadas utilizando
soportes muy poco activados. La utilidad de estos soportes es el obtener derivados
enzimticos en los que la enzima se una al soporte a travs de pocos enlaces de forma
que su conformacin no se vea afectada por la inmovilizacin y, en consecuencia, se
pueda considerar que su comportamiento es idntico al de la enzima en solucin, pero
habindose eliminado la posibilidad de procesos intermoleculares pues se encuentra
insolubilizada. Debido a la baja activacin del soporte y a que la unin covalente se
realiza con tiempo de interaccin corto, las posibilidades de unin enzima-soporte se
reducirn enormemente, y por ello su estructura tridimensional no se ver condicionada
por la presencia del soporte al permitirle cualquier movimiento o vibracin determinada
por el medio,
El disponer de estos derivados ha permitido, en primer lugar, cuantificar en
trminos relativos el grado de multiinteraccin por inmovilizacin permitido por cada
una de las aminaciones, a travs de la estabilizacin lograda. Para ello se han realizado
termoinactivaciones de cada derivado GLIOXJL-AGAROSA-75 frente a su
correpondiente derivado GLIOXIL-AGAROSA-5
.
El estudio de termoestabilidad se ha realizado por incubacin de los diferentes
derivados en tres medios: pH 4,5, pH 7,2 y pH 9,0. Ello permite apreciar posibles
diferencias de comportamiento pues la enzima nativa en un medio acuoso adquiere una
estructura terciaria caracterstica en la cual expone al medio sus zonas polares en las que
se encuentra mayoritariamente los residos hidrofllicos como Lys y Asp/Glu. Por lo tanto
el pH del medio determinael gradode ionizacin de estos grupos, el cual fija la posicin
relativa de cada uno, dando lugar a una conformacin determinada. As habr un PH del
medio que de lugar a la conformacin ptima del centro activo, y la incubacin en un
medio no apropiado modificar los equilibrios de cargar en la protena alterando la
estructura 3D. Las enzimas que han sido modificadas con RDA presentan diferentes
grupos polares superficiales con respecto a la enzima nativa, ello podra suponer
alteracin en el comportamiento en funcin del pH del medio en el que se incube en
relacin al comportamiento de la enzima nativa.
En la tabla 11.2 se recogen los valores de las semividas de los derivados incubados
en los diferentes medios, con la intencin de analizar la influencia del grado de
aminacin de la enzima sobre la estabilidad adicional que produce la inmovilizacin
116
CAPITU LO 11
RESULTADOS YDISCUSION
multipuntual, por ello se comparan los resultados con los obtenidos al incubar en las
mismas condiciones los correspondientes derivados unipuntuales.
Derivado de 3-galactosiclasa pH 4,5 pH 7,2 pH 9,0
nativa glioxil-agarosa-75 96 18 24
5.2
glioxil-agarosa-5 48 0,25 0,5
glioxil-agarosa-75 480 20 120
Estabiizack5p? 10 50 240
6.2
glioxil-agarosa-5 72 2 1
glioxil-agarosa-75 360 20 360
Estabiizaci 5 10 360
5.3
glioxil-agarosa-5 96 4 6
GLIOXIL-AG-75 250 20 36
Estabiizaci 2,6 5 6
* Cociente entre el valor de semivida para el derivado glioxil-agarosa- 75 ypara el derivado glioxil-agarosa-S.
Indicador de la estabilizacin conseguida por la inmovilizacin multipuntual frente a la inmovilizacin
unipwztual.
Tabla 11.2. Valores de las semividas (horas) de la incubacin a diferentes pHs de suspensiones de
derivados de /3-galactosidasa de A. oiyzae modificada con EDA en diferente grado (5.2, 5.3 y 6.2)
preparados por inmovilizacin sobre soporte glioxil-agarosa-5 o sobre soporte glioxil-agarosa-75.
El valor de estabilizacin expuesto en la tabla 11.2 para cada modificacin y cada
pH corresponde a la relacin entre los valores de semivida del derivado multipuntual
frente al unipuntual. Estos valores dan una idea de la rigidificacin que supone las
inmovilizaciones sobre soportes muy activados de la enzima segn su grado de
modificacin qumica, por ello se ha elegido como indicador de la estabilizacin.
En conjunto, independientemente de la modificacin qumica que haya sufrido
la enzima, es en medios bsicos (pH 9,0) en los que se observa una mayor
termoestabilizacin consecuencia de la unin covalente a un soporte muy activado:
resultando unas estabilizaciones de entre 6 y 360 veces con respecto a los derivados-
control (unipuntuales), frente a 5-50 veces la relacin de semividas cuando la incubacin
tiene lugar a pH neutro (pH 7,2) y 2,6-10 veces si el medio tiene pH 4,3.
117
CAPITULO 1 1 RESULTADOS YI>ISCUSION
Analizandolii influenciadel gradode modificacin qumicacon EDAde la enzima
que se ha inmovilizado: la modificacin qumica-5.3 parece ser la ms suave, pues sus
derivados muestran la menor diferencia entre las estabilidades de los derivados
supuestamente multipuntual y unipuntual en relacin a las otras dos modificaciones
qumicas, independientemente del medio en el que se incube. Por el contrario, la
modzficacn-5.2, parece dar lugar a una densidad de grupos amino reactivos sobre la
superficie de la molcula tal, que permite una unin covalente al soporte ms intensa
capaz de proteger la estructura espacial del centro activo contra distorsiones provocadas
por el medio en el que se encuentre. La modificacin-62 muestra una estabilizacin algo
superior a la de la modificacin-5.3 en medios cidos o neutros; sin embargo a pH 9,0
se comporta como el derivado ms estable (360 veces ms estable que su control)
superando incluso la estabilizacin del derivado multipuntual-5.2 (240 veces ms estable
que su control).
3.3. EFECTOGLOBAL: MODIFICACION QUMICACONEDA+ INMOVILIZACION
COVALENTE MULTIPUNTUAL
Este estudio pretende analizar el efecto de la inmovilizacin multipuntual de la
enzima modificada, ya no con respecto a la enzima modificada en solucin (o
insolubilizada a soporte de baja activacin) sino con respecto a la enzima nativa (sin
modificar). Es decir analizar el efecto global de la modificacin qumica con EDAy de
la inmovilizacin covalente multipuntual de esta enzima modificada
.
En la figura 11.7 se muestran las estabilidades de todos los derivados
multipuntuales de la enzima aminada comparados con el derivado multipuntual de la
enzima nativa, indicando para cada derivado la actividad remanente. En la preparacin
de todos ellos se ha ofrecido e inmovilizado la misma cantidad de /3-galactosidasa.
Segn se puede ver en la figura 11.7 las estabilidades de los diferentes derivados
enzimticos preparados con enzima modificada con EDA en ningn caso son menores
a la mantenida por el derivado de la enzima nativa: a pH 4,5 el derivado 5.2 es el que
muestra mayor estabilizacin, siendoel derivado-5.3 el menos termoestable, a pH7,2 las
estabilidades de los derivados aminados apenassufren variacin con respecto a la enzima
nativa, y, por ltimo a pH 9,0 es la modilicacin-6.2 la que ha permitido mayor
estabilizacin por inmovilizacin y vuelve a ser menos estable el derivado-5.3.
118
1 i ~i i
CAPITULO 1 1
1 00
e

a
.5
75
50
25
0
100
e
E
e
c
e
O
e
75
50
25
o
1 00
e
1
4w
U
75
50
25
a
RESULTADOS YDISCUSION
Figura 11.7. Efecto del grado de modificacin qumica con EDA previa a la inmovilizacin de /3-
galactosidasa deA.o,yzae sobre la estabilidad trmica de sus derivados a diferentes pH. (A) Incubacin en
tampn acetato 20 mM en pH 4,5 a 50
0C.; (3) Incubacin en tampn fosfato 20 mM en pH 7,2 a 500C
y (C) Incubacin en tampn bicarbonato 20 mM en PH 9,0 a 250C. Derivados sobre gel glioxil-agarosa de:
la enzima nativa (e.), de la enzima modificada-za (x), de la enzima modificada-6.2 (M) y de la enzima
modificada-S.2 ().
119
0 48 96 144 192 240
tiempo <horma)
0 3 6 9 12 15 18 21
tiempo <harma)
0 12 24 36 48 60 72
tiempo (hora.)
CAPITULO II RESULTADOS YDISCUSION
A pH 4,5 (figura II.7A) la decisin de cal es el derivado ms apropiado el 6.2
o el 5.2 es difcil, pues el derivado-5.2, siendo el ms estable, es inicialmente el que ha
sufrido mayores prdidas de actividad enzimtica: conserva eJ 13% de la actividad que
debera tener la enzima nativa. A PH 7,2 (figura II.7B), aunque la estabilizacion por
multiinteraccin con respecto al derivado sobre gel glioxil-agarosa-5 es grande, sin
embargo globalmente ninguna de las tres modificaciones logra una estabilizacin
importante frente al derivado multipuntual control (nativa-glioxil-agarosa-75). Por ltimo
en un medio de pH 9,0 (figura II.7C) la estabilizacin relativa global del derivado
multipuntual-6.2 es la mayor, al igual que su actividad enzimtica remanente (28%), por
lo que sera el ptimo para trabajar a dicho pH.
En resumen, con la inmovilizacin multipuntual se ha logrado compensar no slo
la inestabilizacin que se haba producido con la modificacin qumica, sino tambin
mejorar con respecto a la enzima soluble nativa, e incluso frente al derivado de la
enzima nativa optimizado: glioxil-agarosa- 75.
Estos experimentos confirman que el aumento de la densidad de grupos reactivos
sobre la superficie de la enzima ha permitido la formacin de mayor nmerode enlaces
con el soporte, lo cual se refleja en una ganancia de termoestabilidad global, pues esta
unin covalente multipuntual con la enzima modificada es capaz de compensar la
desestabilizacin provocada por dicha modificacin. No obstante, no se ha de olvidar el
importante coste en actividad enzimtica de todo el proceso debido a la modificacin
qumica de los grupos carboxilo de la enzima.
4. ENTRECRUZAMIENTOS INTRAMOLECULARES
Con el proposito de introducir mejorasen cuanto a estabilizacin de los derivados
preparados de )3-galactosidasa de A.oryzae, se ha desarrollado una segunda estrategia
que consiste en la utilizacin de las cadenas glicosdicas propias de la glicoenzima como
agente entrecruzante intrnseco. El proceso de entrecruzamiento consta de dos etapas
(figura 11.8):
- La primera etapa consiste en la activacin de las cadenas de hidratos de
carbono a travs de una oxidacin con NaIO
4, dando lugar a dos grupos
aldehdo por monmero, y en conjunto, a cadenas polifuncionales reactivas
(cadenas polialdehdicas ).
120
CAPITULO II
RESULTADOS YDISCUSION
- La segunda etapa supone la incubacin de los derivados en condiciones
adecuadas con el fin de favorecer la reaccin de estos numerosos gmpos
aldehdo con los residuos amino superficiales de la parte proteica.
I
0 pH7,OITMAB
20 pH 10,0 1 NaBH
4
NalO4
Figura 1 .8. Esquema de la reaccin de entrecruzamiento intramolecular propuesto como estrategia de
inmovilizacin de glicoenzimas.
El estudio se ha realizado sobre el derivado multipuntual de la enzima nativa y
sobre los derivados preparados con /3-galactosidasa modificada 5.2 y 6.2 por haber
permitido una multiinteraccin con el soporte suficiente para lograr estabilizacin.
4.1. ACTIVACION DE LAS CADENAS GLICOSIDICAS DE LA ENZIMA POR
MODIFICACION QUMICA CON NulO4:
La modificacin qumica con NaJO4 de los derivados de la enzima nativa y de la
misma modificada 5.2 y 6.2 no ha afectado a sus respectivas actividades enzimticas
.
121
01 -1
040
CAPITULO 1 1 RESULTADOS YDISCUSION
Ala hora de estudiar el efecto que, sobre la estabilidad trmica a los diferentes
pll~, ejerce la oxidacin mxima de la fraccin glicosdica, y debido a la gran reactividad
de los grupos aldehdo resultantes, se incuban derivados oxidados pero bloqueados
rpidamente por reduccin con NaBH
4 para evitar su reaccin durante la desactivacin
trmica. Estos derivados sern considerados como derivados-control. Analizando el
comportamiento de estos derivados frente al derivado original se ha observado que el
tratamiento con NaIO4 de las cadenas de azcares de la enzima nativa inmovilizada no
afecta a la estabilidad del derivado a ninguno de los pHs ensayados (pH 4,5, pH 7,0 y
pH 8.8) (Tabla 11.3).
Derivado de j3-galactosidasa pH 4,5 pH 7,2 pH 9,0
nativa glioxil-agarosa-75 96 18 24
glioxil-agarosa-75-OX/RED 94 20 21
5.2 glioxil-agarosa-75 480 20 120
glioxil-agarosa-75-OXIRED 97 21 40
6.2 glioxil-agarosa-75 360 19 360
glioxil-agarosa-75-OXIRED 206 20 160
Tabla 11.3. Valores de las semividas (horas) de la incubacin a diferentes pUs de suspensiones de
derivados de /3-galactosidasa de A. rnyzae nativa y modificada con EDA en diferente gTado (5.2 y 6.2)
preparados por inmovilizacin sobre soporte glioxil-agarosa-75 y del mismo derivado oxidado con
peryodato y reducido.
Con respecto a los derivados de la enzima modificada con EDA, por incubacin
en medios neutros no parece que la modificacin de las cadenas glicosdicas afecte a su
estabilidad, sin embargo es importante la desestabilizacin que muestran cuando el
estudio se realiza en medios a pH 4,5 y pH 8,8: El derivado 5.2 acorta su semivida de
480 a 97 horas a PH 4,4 y de 120 a 35 horas a pH 8,8; el derivado-6.2 muestra el 50%
de actividad en 206 horas a pH cido y en 160 horas a pH bsico cuando antes de sufrir
la modificacin qumica sus valores de semivida eran 360 horas en ambos casos. Estos
resultados se recogen en la tabla 11.3.
122
CAPITULO fi
RESULTADOS YDISCUSION
4.2. ENTRECRUZAMIENTO INTRAMOLECULAR ENTRE LAS CADENAS
GLICOSIDICAS OXIDADAS Y LOS RADICALES AMINO DE LA FRACCION
PROTEICA DE LA GLICOPROTEINA INMOVILIZAA
La estrategia descrita en Mtodos para la reaccin de las cadenas polialdehdicas
con los grupos amino de la fraccin proteica se basa en la capacidad reductora de los
complejos de aminoborano (TMAiB o DMAB) en reacciones de metilacin de grupos
amino proteicos (35, 36).
El objetivo del entrecruzamiento es conseguir que los brazos polirreactivos
puedan acoplarse y acceder a zonas de la cadena polipeptdica alejadas de ellos y, de este
modo, envolver la molcula de enzima. Se ha considerado que el proceso se vena
favorecido si la reaccin no es demasiado rpida y las cadenas tienen tiempo para
adaptarse al medio. As, se ha elegido el compuesto trimetilado (trimetil-amino-borano
o TMAB) por presentar mayor estabilidad que el complejo dimetilado, aunque su
reactividad inicial es menor. Para el entrecruzamiento se ha elegido un medio de
reaccin de pH 7,0 pues en medio neutros los grupos reactivos obtenidos en las cadenas
glicosiladas son estables y la capacidad reductora del TMAB ptima. La concentracin
utilizada de gente reductor es la mxima permitida por su solubilidad. Para asegurar la
irreversibilidad de los enlaces formados que no se hubieran reducido durante la
incubacin, transcurrida dicho proceso se procede al tratamiento con NaBH
4.
Una vez activado el derivado por oxidacin con NaJO4 y elegidas las condiciones
en las que se favorecer la reaccin entre las cadenas polialdehdicas y los grupos amino
superficiales de la enzima, se procede al seguimiento del proceso de entrecruzamiento
sobre el derivado preparado con la enzima nativa con el fin de estudiar la influencia del
grado de oxidacin sobre la actividad enzimtica residual segn transcurre la incubacin.
Despus de 144 horas de incubacin el derivado que fue oxidado totalmente es el nico
que manifiesta disminucin de su actividad enzimtica, conservando el 76% de la inicial.
Las oxidaciones parciales no suponen prdidade actividad alguna. Tampoco el derivado-
control que no haba sido oxidadomostr cada de actividad. Ni el derivado fJ-GAL-S.2-
glioxil-agarosa- 75, ni el derivado 3- GAL-ti. 2-glioxil-agarosa- 75, oxidados al 100%
mostraron alteracin de la actividad enzimtica en la posterior incubacin para su
entrecruzamiento intramolecular.
123
CAPITULO fi
RESULTADOS YDISCUSION
Considerado que la cada de actividad del derivado de la enzima nativa oxidado
e incubado durante 144 horas podra ser el reflejo de que hubiera tenido lugar alguna
modificacin qumica de la molcula, que efecte a su estructura activa, se ensayaron las
estabilidades trmicas de los derivados incubados y reducidos.
1 00
75
4>
o>
u
~ 50
1-
u
u
:2
a
~ 25
u
o
tiempo (horas)
Egura fl.9. Efecto del entrecruzamiento sobre la estabilidad enzimtica del derivado de /3-galactosidasa
nativa de A.oryzae preparados por inmovilizacin sobre gel glioxil-agarosa-75: (.) derivado oxidado y
reducido (control), (U) derivado oxidado e incubado con TMAB a pH 7.0. Incubacin en tampn fosfato
20 mM de pH 7,0 a 50
0C.
En el caso del derivado de la enzima nativa se observa una ligera estabilizacin
trmica solamente en medios neutros (Figura 11.9) que llega a duplicar el valor de la
semivida del derivado-control. Este derivado-control no es ms que el mismo derivado
oxidado que se ha reducido para inactivar la cadena polirreactiva e idntico en
estabilidadal derivadosin modificar con NaJO
4 (derivado/3-gal-NATIVA-glioxil-agarosa-.
75). Los derivados preparados con enzima aminada previamente s muestran
0 24 48 72 96 1 20 1 44 1 68 1 92
124
CAPITULO II
1 tESULTADOSYDISCUSION
termoestabilizacin en los tres medios ensayados y siempre en relacin a sus
correspondientes derivados-control (los mismos derivados enzimticos oxidados y
reducidos inmediatamente para evitar entrecruzamiento) como se muestra en la tabla
JJ.4.
Derivado de f3-galactosidasa pH 4,5 pH 7,2 pH 9,0
nativa glioxil-agarosa-75-OX/RED 94 20 21
glioxil-agarosa-75- 97 36 23
ENTRECRUZADO
Estabilizacin 1 2 1
5.2 glioxil-agarosa-75-OX/RED 97 21 40
glioxil-agarosa-75- 470 205 108
ENTRECRUZADO
Estabilizacin 5 10 3
6.2 glioxil-agarosa-75-OX/RED 206 20 160
glioxil-agarosa-75- 340 190 335
ENTRECRUZADO
Estabilizacin 2 10 2
=
Cociente entre el valor de semivida para el derivado giloxil-agarosa-iSentreenizado y para el derivadoglioxil-
agarosa-75 oxidado y reducido. Indicador de la estabilizacin conseguida por a inmovilizacin mutipwutual
frente a a inmovilizacin unipwutual.
Tabla fl.4. Efecto del entrecruzamiento intramolecular sobrelas semividas (horas) de los derivados de/3-
galactosidasa de A. oiyzae nativa o modificada con EDA (5.2 y 6.2) preparados por inmovilizacin sobre
soporte glioxil-agarosa-75 en relacin a los respectivos derivados-control (oxidados y reducidos).
Condiciones experimentales en Mtodos.
De los resultados expuestos en la tabla JJ.4 parece ser que el entrecruzamiento
ha provocado ganancias de estabilidad sobre los derivados preparados con enzima
aminadada 5.2 y 6.2, que se reflejan el los mayores valores de semivida a los tres pHs
estudiados.
125
LI
CAPITULO U RESULTADOS YDISCUSION
Analizandoglobalmente el proceso desde la oxidacin hasta el entrecruzamiento,
parece que esta segunda etapa consigue aumentos de la estabilidad de los derivados. Sin
embargo slo a pH 7,0 supone estabilizacin ea relacin a los derivado sin oxidar pues
en este medio la oxidacin no provoc desestabilizacin alguna. No ocurre lo mismo en
el caso de las incubaciones realizadas a pHs cido y bsico en los cuales el
entrecruzamiento slo permite compensar la disminucin de los valores de semividas
provocados por la oxidacin, sin lograr estabilizacin adicional.
Ala vista de los resultados de actividad y estabilidad de los diferentes derivados
obtenidos de ambos procesos, se puede decir que la utilizacin de las cadenasglicosdicas
de la glicoenzima 3-galactosidasa de A. oiyzae como entrecruzante endgeno ha
permitidola estabilizacin trmica de los derivados cuando stos hayan de ser utilizados
en medios neutros de reaccin. El derivado de la enzima nativa ha duplicado su
estabilidad a costa de una prdidade actividad enzimtica del 24%. Cuando la estrategia
se aplica sobre los derivados multipuntuales preparados con la enzima enriquecida en
grupos amino, la estabilizacin llega a ser de 600 veces para la modificacin qumica 5.2
y de 100 veces cuando la enzima se haba modificado 6.2 y el proceso no afecta a sus
actividades residuales.
5. DISCUSION GLOBAL
Las modificaciones qumicas de estaglicoproteina, alteran su estado de ionizacin
y por tanto afectan ala estabilidad de su estructura espacial segn la acidez o basicidad
del medio en el que se encuentre. En particular, se ha conseguido aumentar la
estabilidad trmicaa pH cido (4,5) y bsico (9,0) por inmovilizacin multipuntual sobre
gel glioxil-agarosa de la enzima, previamente enriquecida en grupos amino (figura 11.10).
Aunque las estabilizaciones logradas con las modificaciones qumicas 5.2 o 6.2 son
muy cercanas, parece que a pH 4,5 la modificacin 5.2 conduce a una estabilizacin algo
mayor: de 10 veces frente a 5 para la modificacin 6.2. Por el contrario a pH 9,0 el
derivado 6.2 el que consigue mayor estabilizacin 360 veces frente a 240 para la
modificacin 5.2.
126
CAPITULO II RESULTADOS YDISCUSION
100
e
e
c
e
e
u
E
e
u
u
.5
o
e
75
50
25
o
100
e
e
e
e
c
u
E
e
u
u
u
3
o
u
75
50
25
o
Figura H.1 O. A. Inactivaciones trmicas realizadas por incubacin en tampn acetato de pH 4,5 a 50
0Cde
los derivados de /3-galactosidasa: 5.2-glioxil-agarosa-75 (e) ; nativa-glioxil-agarosa 75 (.) ; y 5.2-glioxil-
agarosa-5 (U). E. Inactivaciones trmicas realizadas por incubacin en tampn bicarbonato de pH 9,0 a
250C de los derivados de /3-galactosidasa: 6.2-glioxil-agarosa-75 (e); nativa-glioxil-agarosa 75 (i) ; y 6.2-
glioxi]-agarosa-5 (U).
0 46 96 144 192
240
tiempo <horas)
0 12 24 38 48 60 72
tiempo (horma)
127
CAPITULO II RESULTADOS YDISCUSTON
Cuandola enzima inmovilizada deba usarse en medios neutros, ser necesaria una
reaccin adicional de entrecruzamiento intramolecular, utilizando los oligoscaridos
endgenos oxidados como agente entrecruzante polifuncional.
ApH 7,0 la termoestabilizacin por unin multipuntual de la enzima aminada es
menor que la lograda en inactivaciones a pH cido o bsico, segn se recoge en el
correspondiente apanado. Sin embargo el que la activacin de los azcares por oxidacin
no afecte a su termoestabilidad en este medio, hace que el posterior entrecruzamiento
sea sea globalmente positivo obtenindose un derivado 600 veces ms estable que la
enzima soluble modificada con EDA (Figura 11.11).
100
~75
4. -
0
-a
e
0
e
(u
~50
1.-
0
< u
-o
.5
-a
~25
o
12 24 36 48 60 72 84 96
tiempo (horas)
Figura fl.11. Efecto de losdiferentes procesos (modificaciones qumicas e inmovilizacin) realizados sobre
la /3-galactosidasa de A.oryzae sobre la estabilidad a pH 7,0 y 50
0C. Se indica las diferentes etapas:
(1)modificacin qumica con EDA5.2 de la enzima soluble), (2)inmovilizacin multipuntual sobre soporte
glioxil-agarosa-75, (3)oxidacin y (4)entrecruzamiento intramolecular.
o
128
CAPITULO II
RESULTADOS YDISCIJSION
En resumen, se han preparado derivados inmovilizados covalentemente de 3-
galactosidasa de A.otyzae con una estabilizacin de 400 y 600 veces respecto a la misma
enzima soluble. Para ello se han desarrollado dos estrategias fisico-quimicas que han
permitido la rigidificacin de la estructura 3D de la enzima. La primera de estas
estrategias han sido el enriquecimiento de la superficie de la enzima en grupos reactivos
con el fin de que la inmovilizacin covalente al soporte tenga lugar a travs de mayor
nmero de puntos; de este modo se pretendi compensar el impedimento estrico que
supone la presencia de las cadenas glicosdicas a la inmovilizacin multipuntual de la
enzima. La segunda estrategia se ha desarrollado sobre los derivados inmovilizados
obtenidos y consistio en la utilizacin de las cadenas glicosdicas como agentes
entrecruzantes intrinsecos.
Estos procesos de estabilizacin se encuentran asociados a modificaciones
qumicas: la reaccin de los grupos carboxilo superficiales de la enzima con EDAy la
oxidacin de las cadenas de carbohidratos con NaJO
4. Elloha supuesto la modificacin
de la carga electrica superficial de la molcula y provablemente habr alterado su
comportamiento y el tipo de interaccin con el medio, pudiendo ser este el motivo de
los diferentes valores de estabilizacin alcanzados en los diferentes medio estudiados: pH
4,5, 7.0 y 9,0.
129
CAPITULO III
Inmovilizacin-establizacin de enzimas
oligomricas: Inmovilizacin-estabilizacin de las
/3-galactosidasas de Kluyveromyces lactis y de
Eseherichia cdi para la hidrlisis de lactosa.
1 30
H1
1 1 ]
CAPITULO fil
INTRODUCCION
INTRODUCCION
El abordaje de la inmovilizacin y de la estabilizacin de enzimas para posibilitar
su implantacin como catalizadores en reacciones a gran escala se hace ms complejo
al complicarse su estructura molecular. De la complejidad estructural, se derivan nuevos
mecanismos de inactivacin, siendo necesaria la adaptacin de las metodologas para
lograr el mantenimiento de su actividad enzimtica.
Muchas de las enzimas que, debido a sus propiedades catalticas, poseen inters
como catalizadores de posible uso a nivel industrial son oligomricas, es decir estn
formadas por dos o ms cadenas o subunidades polipeptdicas, o necesitan para su
actividad de la presencia de uno o ms componentes no proteicos o cofactores. La
relacin estructura-actividad de las enzimas oligomricas no han sido ampliamente
estudiada. Aunque han aparecido publicaciones en las que las subunidades libres
muestran actividad enzimtica (68), en general se cree que el mantenimiento de la
estructura cuaternaria es, cuanto menos, muy importante para su funcin biolgica. As
pues, para lamayara de las enzimas oligomricas, las subunidades aisladas son inactivas
aunque conserven intacta su estructura terciaria (69, 70), debido a que es la constitucin
del centro activo se ven involucrados residuos de varias subunidades del mismo
oligmero (71).
A las causas de inactivacin generales para toda enzima como son las
interacciones intermoleculares (agregacin o autolisis) o procesos intramoleculares
desencadenados por diferentes agentes o condiciones del medio que actan favoreciendo
la desnaturalizacin o desplegamiento de la estructura tridimensional caracterstica de
la cadena polipeptdica, determinante de su actividad, habr que aadir fenmenos de
disociacin que surgen debido a la naturaleza no covalente de las interacciones entre
subunidades o entre la fraccin proteica y los cofactores.
En la figura 111.1 se recoge a modo de esquema el complejo sistemaque regularia
la estabilizacin y por lo tanto la funcionalidad de una enzima dimrica que, adems
necesite la presencia de un determinado ion para su actividad ptima.
131
CAPITULO III
INTRODUCCION
A
I T
i ~tJ
4
4
A
o
u
u
o
A
lA
o
E-II
II
<II
a
41 u
Figura 1111.1 Mecanismo de inactivacin de enzimas polimricas que adems presentan un catin (cofactor)
que inteviene en el proceso cataltico.
132
CAPITULO TU
INTRODUCCION
El que predomine uno u otro de los diferentes mecanismos implicados depender
tanto de la enzima en s (de las diferentes interacciones intramoleculares que en ella se
reunen para mantener su configuracin>, como de las condiciones del medio.
La utilizacin de enzimas inmovilizadas a nivel industrial implica una gran
dilucin del catalizador, tanto por la participacin de un mismo derivado enzimtico en
varios ciclos de reaccin, como por su uso en reactores con sistemas de flujo continuo
de substrato. Esto quiere decir que los fenmenos de disociacin adquirirn especial
importancia. Si adems esta reaccin tiene lugar en condiciones experimentales
moderadamente drsticas, los posibles cambios conformacionales de los protmeros
disociados, aceleraran la disociacin de subunidades, aumentando la velocidad de
inactivacin del derivado enzimtico. Por otro lado, la disociacin de la molcula
significara la prdida de la fraccin disociada en el eluido del reactor, lo cual
contaminara la solucin producto de la reaccin (72,73).
La liberacin de subunidades supondra importantes limitaciones a la utilizacin
de enzimas de cualquier microorganismo en tecnologa alimentaria. Sin embargo y
debido a que la estabilizacin de la estructura cuaternaria es suficiente para garantizar
la limpieza del proceso enzimtico pues ninguna subunidad se liberara en el alimento,
sera posible el uso de enzimas procedentes de todo tipo de microorganismos, incluso de
los incluidos entre los denominados ORAS (generalmente aceptados como seguros).
Por otro lado, la estabilizacin de la estructura cuaternaria podra traducirse, en
muchos casos, en un espectacular aumento de la estabilidad trmica de los derivados
enzimticos en procesos en los que el paso clave de la inactivacin fuera la disociacin
de subunidades.
Las tcnicas biofisico-qulmicas de modificacin de enzimas oligomricas nativas
correctamente plegadas y ensambladas podran ser las estrategias de eleccin a la hora
de mantener las estructuras terciaria y cuaternaria activas en los casos en los que el
diseo de estrategias de ingeniera gentica para unir qumicamente y de en modo
correcto enzimas industriales parece bastante complicado por incluir el plegamiento de
cada subunidad y el posterior ensamblaje de las mismas. Es interesante la integracin de
los diferentes procedimientos factibles en el proceso de inmovilizacin, tanto por lo que
supone la obtencin de biocatalizadoresheterogneos de enzimas con utilidad industrial,
133
CAPITULO III
INTRODUCCION
como por permitir el desarrollo de nuevas estrategias de estabilizacin sobre los
derivados iinsolubilizados.
Hasta ahora, la estabilizacin de enzimas oligomricas se ha abordado
fundamentalmente a travs de la utilizacin de agentes polifuncionales para lograr
entrecruzamientosintramoleculares capaces de estabilizar laestructura cuaternaria o, por
lo menos, de reducir los fenmenos de disociacin (33, 74-76). Por otro lado la
aplicacin de estrategias de inmovilizacin de enzimas oligomricas ha estado orientada
a llevar a cabo estudios de la actividad cataltica de las subunidades (68) para la
comparacin de sus propiedades enzimticas con las del oligmero correspondiente, o
con el fin de investigar los efectos de determinados ligandos sobre una enzima alostrica
y sobre uno solo de sus protmeros unido covalentemente a una matriz insoluble (74),
pero no hacia la estabilizacin de su estructura cuaternaria.
1 . PROPUESTAS PARA LA ESTABILIZACION DE ENZIMAS OLIGOMERICAS
Dos son las propuestas para el tratamiento de estas enzimas en las que toma gran
importancia los procesos de disociacin:
- Inmovilizacin covalente multi-subunidades (Figura IJJ.2).
Utilizando slidos porosos que presenten una morfologa interna de
superficies amplias y altamente activadas con grupos reactivos, se posibilita que
en el proceso de inmovilizacin de protenas oligomricas se vean involucradas
varias o todas sus subunidades, de forma que sea el mismo soporte rgido el que
acte como entrecruzante (78). Ello permite no slo que los protmeros no
puedan disociarse, sino que, aunque tendiern a hacerlo por efecto del pH o de
la temperatura, mantengan una disposicin favorable para el re-ensamblaje, lo
cual no ocurre en el caso de un entrecruzamiento simple con reactivo bifuncional
o con un polmero flexible. Evidentemente, slidos que no presenten grandes
superficies internas o que tengan un grado de activacin bajo sern menos
adecuados paradesarrollar este tipo de estrategias, por no favorecer la interaccin
multipuntual enzima-soporte.
134
CAPT~ ULO III
INTRODUCCION
DISOCIACION
Figura 111.2. Inmovilizacin covalente multisubunidades como estrategia de estabilizacin de la estructura
cuaternaria de enzimas oligomricas.
Disponiendo, adems de diferentes tipos de activacin para los soportes
que condicionarn la inmovilizacin de las molculas a travs de diferentes
residuos y, probablemente, a travs de diferentes areas de su superficie, se podr
evaluar cal es la que confiere a las molculas la orientacin ms adecuada para
que se produzca la inmovilizacin multi-subunidades. En este caso, el problema
de la distancia entre residuos entrecruzables es mnimo cuando se pueden
preparar soportes con ms de 50-100 residuos activos por molcula de protena
y por lo tanto no ser tan dificil que residuos de varias subunidades intervengan
en el proceso de inmovilizacin, siempre que su orientacin sea la adecuada.
135
ji.
CAPITULO m
INTRODUCCION
Por todo ello, esta parece la estrategia ms fcil de desarrollar siempre que
se utilicen los soportes, los mtodos de activacin, los grados de activacin y los
procesos de inmovilizacin apropiados.
II.- Entrecruzamiento desubunidades con reactivos polifuncionales (Figura
IJJ.3 )
La estabilizacin de la estructura cuaternaria de protenas olgomricas por
inmovilizacin covalente a un soporte slido a travs de la unin simultanea de
todas sus subunidades, puede dificultarse al aumentar la complejidad de la
enzima, lo mismo que ocurre con la inmovilizacin multipuntual de enzimas
monomricas. Sin embargo, el disponer de derivados de la enzima ya
insolubilizadapermite desarrollar sobre ellos estrategias adicionales que permitan
culminar la estabilizacin de la estructura cuaternaria. Por ello se propone el
diseo de un primer proceso de inmovilizacin involucrando el mayor nmero de
subunidades, seguido de un entrecruzamiento qumico posterior utilizando
macromolculsr polifuncionales.
El diseo de procesos de entrecruzamiento con reactivos bifuncionales
como dialdehdos o bis-epxidos (79-81) es muy dificil ya que, por un lado, un
exceso de reactivobifuncional debe producir una modificacin global de todos los
residuos de la protena, y por otro lado, ha de elegirse el reactivo del tamao
adecuado para que sea capaz de reaccionar con dos residuos localizados en
diferentes subunidades. Lautilizacin de macromolculasflexibles polifuncionales
parece una tcnica ms adecuada ya que cada macromolcula que se una a un
residuo de la protena deja cubierta una zona vecina relativamente grande a la
cual no podrn acceder otras macromolculas y con la cual se encontrarn
favorecidas nuevas interacciones de la misma cadena polifuncional. Por otro lado,
la distancia a la que se encuentren los grupos a entrecruzar (en diferentes
subunidades) ya no va a ser crtica para esta molcula larga, flexible y
polifuncionalizada (76-82).
136
CAPITULO TU INTEODU CCION
+ _______________________
Figura 111.3. Entrecruzamientos con agentes polifunionales de cadena larga como estrategia adicional para
la estabilizacin de la estructura cuaternaria de enzimas oligomricas.
La modificacin qumica de protenas en fase slida presenta grandes
ventajas con respecto a modificaciones similares de enzimas solubles. En primer
lugar, la fijacin de las molculas de enzima sobre el soporte a una distancia
relativamente grande impide cualquier proceso de entrecruzamiento
intermolecular y hace que la reaccin de protenas con reactivos polifuncionales
produzca nica y exclusivamente entrecruzamientos dentro de la misma molcula.
Por el contrario, trabajando con enzimas solubles los procesos intermoleculares
entre molculas solubles, muy reactivas y con todos sus grados de libertad
(rotacionales, vibracionales y transacionales) podran ser, incluso, mucho ms
137
DISOCIACION
CAPITULO Hl
INTRODUCCION
rpidos que los entrecruzamientos intramoleculares entre dos residuos fijos sobre
la superficie de la protena que, en principio no estn alineados con los grupos
reactivos de los agentes entrecruzantes.
Desde un puntode vista ms prctico, la modificacin de protenas en fase
slida permite a la vez el diseo mucho ms sencillo de los experimentos pues:
- se facilita el control de la modificacin, ya que el agente entrecruzante
que no ha reaccionado se encuentra en la disolucin y se puede analizar sin
interferencias de la protena o del reactivo que ya ha reaccionado con sta,
- el final de la reaccin se consigue por simple filtado del derivado,
separndose de este modo todo el reactivo de la protena insolubilizada y
modificada,
- se pueden utilizar condiciones de reaccin donde la protena soluble
podra agregar, mxime trabajandoa las concentraciones altas (20-40 mg/m) que
se pueden conseguir con derivados inmovilizados,
- se pueden disear fcilmente complejas modificaciones qumicas con
cambio de pH, eliminacin de reactivos solubles, etc.
Todas estas ventajas para trabajar a nivel de laboratorio, facilitaran
enormentente el escaladode estas modificaciones, optimizadas a pequea escala,
hasta un nivel industrial.
2. ESTABILIZACION DE ENZIMAS OLIGOMERICAS DEPENDIENTES DE
CATIONES DIVALENTES
En muchos casos, la actividad y la estabilidad de enzimas oligomricas estn
fuertemente afectadas por la presencia de cationes divalentes como Mg
2~, Ca2~, Mn2~,
etc. Estos cationes pueden encontrarse en la interseccin entre dos subunidades
formando puentes salinos entre grupos cidos de la protena muy prximos
pertenecientes a subunidades diferentes. En ausencia de estos iones, los grupos carboxilo
vecinos tendern a repelerse provocando la disociacin de las subunidades o, si sta no
fuera posible, ensamblajes incorrectos, lo cual dara lugar a la inactivacin de la enzima
an sin disociar. Por otro lado, estas enzimas, al mismo tiempo que necesitan la
138
CAPITULO TU
INTRODUCCION
presencia de ciertos cationes para mantenerse activas y estables, suelen ser muy sensibles
a la presencia de otros cationes divalentes que podran reemplazar a los primeros
producindose asociaciones incorrectas entre los protmeros. As pues, la estabilizacin
de la estructura cuaternaria de este tipo de enzimas multimricas puede ser un paso
necesario, pero no suficiente para conseguir un gran aumento en su estabilidad.
De todos modos, la estabilizacin de estas estructuras multimricas y, cuando sea
posible, la estabilizacin adicional de cada uno de sus protmeros podra dar lugar a
importantes estabilizaciones y a minimizar la dependencia de los diferentes cationes,
tanto de los que son necesarios para la enzima nativa, como de los que provocan
inactivaciones. En el caso de enzimas que deban de actar sobre fluidos lcteos, como
es el caso de las 3-galactosidasas que en el presente trabajo servirn de modelo para la
aplicacin de las estrategias propuestas, este tipo de procesos deben ser importantes
debido a la amplia variedad de cationes presentes en estos sistemas de composicin
compleja.
3. DOS ENZIMAS OLIGOMERICAS DE INTERES INDUSTRIAL
Las I3-galactosidasas de Escherichia coli y de Kuyveromyces lactis son dos enzimas
de enorme inters industrial como catalizadores para la hidrlisis de lactosa en fluidos
lcteos. La actividad ptima de estas dos 3-galactosidasas se desarrolla a pH entorno a
7,0, lo cual permite su utilizacin en hidrlisis de lactosa en leche (pH 6,6) y en suero
dulce (pH 6,1). Sin embargo su aplicacin industrial se encuentra limitada a la obtencin
de derivados enzimticos que permitan buenos rendimientos del proceso, la fcil
separacin del catalizador, la suficiente estabilidad de la enzima durante largos perodos
de utilizacin, soportando temperaturas altas y grandes diluciones.
La enzima de K. Ladis se utiliza actualmente como aditivo soluble. Al ser esta
levadura un microorganismo ORAS no existen grandes inconvenientes para catalizar en
un nico ciclo de reaccin la hidrlisis de lactosa. Sin embargo, la estructura dnirica
de esta enzimay la importante dependencia de su estabilidad de la presencia de cationes
Mg
2~ y Mn2t as como su inactivacin por Na~ hacen muy complicada la posibilidad de
reutilizacin durante varios ciclos de reaccin de la enzima inmovilizada.
El caso de la enzima de E. coil es ms complejo. El microorganismo de origen no
est incluido entre los ORAS, y por ello el uso de esta enzima a nivel alimentario no est
139
CAPITULO TU
INTRODUCCION
permitido.
La estabilizacin de la estructura cuaternaria de estas enzimas supondra un
importante pasopra lograr aumentar las posibilidades de uso industrial de estas enzimas
y en general de cualquier otra enzima oligomrica de inters. Para ello se ha de impedir
la liberaccin de subunidades al medio de reaccin, se ha de reducir la dependencia
estabilizante y/o inactivante de los cationes divalentes presentes en el medio, y, por
ltimo, se ha de aumentar la estabilidad trmica de estas enzimas y la estabilidad de los
derivados durante el uso continuado en suspensiones muy diluidas durante muchos ciclos
de reaccin.
3.1. p-GALACTOSIDASA DE Kluyveromyces lacds
La lactasa (EC 3.2.1.23) de Kluyveromyces (Saccharomyces) lactis es un dmero
cuyas subunidades idnticas poseen un peso molecular algo mayor de 100.000 D. y se
encuentra glicosilada en un 45% (plp) (83).
La enzima tiene una actividad ptima a 35-40
0Cy pH 7,2 6,5, respectivamente,
segn acte sobre el substrato sinttico (oNPG) o sobre lactosa; por enzima de esta
temperatura pierde rpidamente su actividad, dependiendo de la presencia de
estabilizantes, de la concentracin y de determinados iones. El catin divalente Mn2~ y
en menor proporcin el Mg2~ protegen a la enzima de la inactivacin trmica a 450Cy
pH 6,6, siendo su estabilidad alta por debajo de 200Cincluso en ausencia de tales iones.
La presencia de Ca2~, Zn24 y Cu2~ provocan una fuerte desactivacin, pudiendo
recuperarse parcialmente la actividad por eliminacin del ion del medio. Su estabilidad
tambin depende de la concentracin de K~ (84).
En cuanto al extracto enzimtico comercial, Maxilact LX-SOOO, de Oist-Brocades
(Holanda>, contiene 564,5 gIl de glicerina como agente estabilizante. Es relativamente
estable en presencia de iones K~ y por debajo de los 409C. Muestra una clara
dependencia de la estabilidad con la concentracin de enzima en el medio (73).
La adicin de Mg2~ a la mezcla de reaccin consigue estimulacin de la actividad
enzimtica, siendo 2 mMla concentracin que permite la actividad mxima en relacin
a oNPG (83).
140
1 .
CAPITULO Hl
INTRODUCCION
Los valores de V~ de 77,6 y 123,7 gmoles de producto por mm y por mg de /3-
galactosidasa para oNPG y lactosa, respectivamente y de Km de 1,7 y 17,3 mM,
respectivamente (85). Los productos finales de la reaccin enzimtica (glucosa y
galactosa) muestran diferente poder de inhibicin sobre la enzima, siendo menor el de
glucosa (K
1 sI u : 42 mM) que el de galactosa (K1 saI : 794 mM) (85).
3.2. /3-GALACTOSIDASA DE Eseherichia coil
Los estudios sobre la regulacin de la produccin de la /3-galactosidasa (EC
3.2.1.23) de Escherichia coli llevaron a Jacob y Monod a proponer el primer modelo del
operon para la regulacin de la sintesis de protenas (86) que todava hoy es una de la
ms usadas en Biologa Molecular. Sin embargo, su inters para el presente trabajo se
basa en su actividad 13-galactosidasa y en su potencial utilizacin como catalizador de la
hidrlisis de lactosa en la industria lctea.
La determinacin reciente de su estructura por rayos-X ha confirmado muchas
de la caractersticas propuestas hasta entonces por diferentes autores (87). Se trata de
un tetrmero cuyos monmeros idnticos (116.248 D) (88) se disponen en un plano y
entre los cuales tienen lugar dos tipos de interacciones monmero-monmero (89)
(Figura JJI.4). Cada subunidad se compone de una nica cadena polpeptidica de 1,023
aminocidos (87) que plegada da lugar a 5 dominios adems de un segmento ms
extendido en el extremoN-terminal. Cadamolcula posee dos sitios activos involucrando
cada uno a un par de monmeros y en los cuales se dispone un Mg
2~ por monmero.
Cada monmero posee 20 residuos de Lys, lo cual supone un nmero bajo para
ser una cadena tan larga. De estas Lys, 5 se encuentran en la primera mitad de la cadena
y 11 entre los residuos 515 y 772, la ltima es la que posee el carboxilo terminal, lo cual
ha llevado a suponer que gran parte de la zona N-terminal y C-terminal se encontrarn
en el interior de la molcula (87).
141
fi fi .
CAPITULO Hl
OBJETIVOS
OBJETiVOS
En este captulo se desarrollarn diferentes estrategias propuestas para la
estabilizacin de la estructura cuaternaria y terciaria de dos enzimas multimricas de
inters para la industria lctea: las 3-galactosidasas de Kluyveromyces lactAs, enzima
dimrica dependiente de cationes Mg
2~ y Mn24 y deEscherichia col, enzima tetramrica
dependiente de Mg2~.
En ambos casos se pretende la estabilizacin de la estructura cuaternaria por
inmovilizacin simultanea de todas sus subunidades sobre soportes preexistentes
activados con diferentes grupos funcionales. Cuando sea posible, se intentar que,
adems de la unin multi-subunidades, pueda tener lugar un intenso proceso de
interaccin multipuntual para favorecer la estabilizacin de cada una de las subunidades.
Si la inmovilizacin no es posible realizarla con la participacin de todas las subunidades,
se proceder a la estabilizacin adicional por entrecruzamientos intramoleculares con
macromolculas polifuncionales tipo dextrano.
En todos los casos se estudiar la estabilizacin de la estructura cuaternana
mediante el anlisis por SDS-PAGE, y posteriormente se evaluarn las modificaciones
que permitan conservar buenas actividades enzimticas remanentes. Se estudiarn los
mecanismos de inactivacin tanto de las enzimas nativas como de los diferentes
derivados preparados, analizando su estabilidad trmica en diferentes condiciones
experimentales y en presencia de diferentes cationes divalentes.
143
CAPITULO TU
METODOS
METODOS
1 . ACTIVACION DEL SOPORTE AGAROSA.
En el presente captulo se han utilizado tres soportes de agarosa que difieren en
el grupo reactivo y por lo tanto en el modo de activacin. Estos soportes son el gel
glioxil-agarosa, el gel MANA-agarosa y el gel glutaraldehdo-agarosa. La descripcin de
cada uno de los mtodos de activacin se encuentra desarrollada en Mtodos del
Captulo 1.
2. PREPARACION DE DERIVADOS ENZIMATICOS.
2.1. PREPABACION DE DERIVADOS DE$-GALACTOSIDASADEKkyveromyceslact.
2.1 .1 . PREPABACION DEL DERIVADO GLUTARALDEHIDO-AGAROSA-3
Se preparauna solucin de extracto enzimtico comercial de 380 U/ml en tampn
fosfato potsico 20 mMde pH 7,0 conteniendo MgCI
2 2 mMy KCl 0,1 M. Se separa una
alicuota que se utilizar como control del comportamiento de la enzima en solucin. Al
resto se le aade el gel glutaraldehido-agarosa de 3 xmoles de grupos reactivos por ml de
soporte, en relacin 1:3 (v:v). Comprobado que el pH no se haya modificado, se
mantiene homognea la suspensin mediante agitacin suave y se incuba a temperatura
ambiente durante 1 hora. Se le aade el mismo volumen de tampn bicarbonato potsico
40 mM de pH 9,75 conteniendo MgCl2 2 mM, KCI 0,1 M y se agrega NaBH4 hasta
concentracin final 1 mg/ml de suspensin. Transcurrida media hora de incubacin con
agitacin suave a pH 9,7-9,8, se procede al lavado con abundante tampn fosfato
potsico 20 mM de pH 7,0 con MgCl2 2 mM y KO 0,1 M.
144
CAPITULO Hl
METODOS
2.1.2. PREPARACION DEL DERIVADO GLUTARALDEHIDO-AGAROSA-75
El procedimiento ha sido el mismo que se describe en el Apartado 2.1.1., con la
diferencia de que el gel utilizado posee 75 moles de grupos reactivos por ml de soporte
y se lcuba en relacin 1:6 (v:v).
2.1.3. PREPARACION DEL DERIVADO GLIOXIL-AGAROSA
Se prepara una solucin de extracto enzimtico comercial de unas 20 U/ml en
tampn bicarbonato potsico 40 mMde pH 10,0 conteniendo MgCI
2 2 mMy KO 0,1 M
a 4
0C. Se separa alicuota que se utilizar como control del comportamiento de la enzima
en soluci y se aade el gel glioxil-agarasa de 75 moles de grupos reactivos por ml de
soporte, en relacin 1:10 (v:v). Comprobado que el pHy la temperatura nunca superen,
respectivamente, 10,0 y 40C, se mantiene homognea la suspensin mediante agitacin
suave durante 1-1,5 horas. Una vez que se haya insolubilizado ms del 50 % de la
enzima ofrecida, se pasa la suspensin a temperatura ambiente y se contina el proceso
dos horas ms. En este tiempo se produce la solubilizacin del total de la enzima
ofrecida y se favorece la interaccin enzima-soporte. Se agrega NaBH
4 hasta
concentracin final 1 mg/ml de suspensin; transcurrida media hora con agitacin suave
y pH 9,7-9,8, se procede al lavado con abundante tampn fosfato potsico 20 mM de pH
7,0 conteniendo MgCI2 2 mM y KO 0.1 M.
2.2. PREPABACION DE DERIVADOS DE fi-GALACTOSIDASA DE Eseherichia coi.
2.2.1 . PREPARACION DEL DERIVADO GLIOXIL-AGAROSA
Se preparauna solucin de extracto enzimticocomercial (0,25 mg/m) en tampn
bicarbonato 50 mMde pH 10,0 conteniendo MgCI2 2mM y lactosa 5%. Se separa una
alicuota como control del comportamiento de la enzima en solucin y sobre el resto se
aade el gel glioxil-agarosa de 75 moles de grupos reactivos por ml de soporte, en
relacin 1:5. La suspensin se mantiene homognea con agitacin suave duTante 20
horas. Transcurrido este tiempo se agrega NaB!4 (1 mg/ml suspensin) y, despues de 30
minutos de agitacin suave, se filtra y se lava con abundante tampn fosfato sodico 25
mM, MgCI2 2 mM de pH 7,0.
145
CAPITULO Hl METODOS
22.2. PREPABACION DEL DERIVADO MANA-AGAROSA
Se prepara una solucin de extracto enzimtico comercial (0,2 mg/m) en tampn
fosfato 20 mM de pH 7,0 conteniendo MgCI
2 2mM y se enfra (4
0C). Se separa una
alicuota como control del comportamiento de la enzima en solucin y sobre el resto se
aade el gel MAN-agarosa de 75 moles de grupos reactivos por ml de soporte, en
relacin 1:6 (v:v). La suspensin se mantiene homognea con agitacin suave,
comprobando el mantenimiento del pH y de la temperatura. A las 2 horas se permite
el calentamiento de la suspensin hasta temperatura ambiente y se contina la
incubacin durante 20 horas ms. Transcurrido dicho tiempo se diluye la mezcla de
reaccin a la mitad con fosfato 20 mM de pH 6,0 conteniendo MgCl
2 2 mM, se ajusta
el pH a 6,0 y se aade CDI hasta concentracin final 1.10.2 M. Despus de 2 horas se
filtra y se lava con abundante tampn fosfato 25 mM de pH 7,0 con MgCI2 2 mM.
2.23. PREPARACION DEL DERIVADO GLUTARADEHIDO-AGAROSA-75
Se preparauna solucin de extractoenzimtico comercial (0,25 mg/m) en tampn
fosfato 20 mMde pH 8,6 conteniendo MgCI2 2mM y lactosa 5%. Se separa una alicuota
como control del comportamiento de la enzima en solucin y sobre el resto se aade el
gel glutaraldehdo-agarosa de 75 moles de grupos reactivos por ml de soporte, en
relacin 1:5. La suspensin se mantiene homognea con agitacin suave, comprobando
el mantenimiento del pHdurante la incubacin. Transcurridas 20 horas se aade tampn
bicarbonato 20 mM de ph 10,0 conteniendo MgCI2 2 mM y lactosa 5% hasta una
relacin 1:10 (v:v), se ajusta el pH a 10,0 y se aade NaB!4 hasta concentracin final 1
mg/ml supensin. Despus de 30 minutos se filtra el derivado resultante y se lava con
abundante tampn fosfato 25 mMde pH 7,0 con MgCI2 2 mM.
22.4. PREPARACION DEL DERIVADO GLUTARADEHIDO-AGAROSA-3
El procedimiento ha sido el mismo que se describe en el Apartado 2.2.3, con la
diferencia de que el gel utilizado posee 3 moles de grupos reactivos por ml de soporte
y se incuba en relacin 1:2 (v:v) durante 1 hora.
1 46
CAPITULO TU
MR~ ODOS
3. PREPABACION DE AGENTES POLIFUNCIONALES
Se han preparado soluciones de polnieros polialdehdicos a partir de dextrano
comercial de 6.000, 18.300 y 87.000 D, y de polnieros poliaminicos a partir de las
soluciones polialdehdicas anteriores.
3.1 . PREPARACION DE POLIMEROS POLIALDEHIDICOS
A 50 ml de solucin de dextrano 33,3 mg/ml en agua se le aaden 4,36 g de
NaIO
4, agitndose hasta su completa disolucin. Transcurridas 2 horas a temperatura
ambiente y comprobado el consumo total de NaIO4, se dialializa la solucin resultante
frente a agua.
La concentraciones en cada caso fueron 5,5, 1,8 y 0,38 mM para los dextranos
6.000, 18.300 y 87.000, respectivamente.
3.2. PREPARACION DE POLIMEROS POLLAMINICOS
En un volumen de solucin polialdehdica (obtenida segn se describe en el
apartado 3.1) se disuelve TMB en concentracin final 150 mM con agitacin enrgica
a temperatura ambiente. La solucin resultante se enfra (4
0C) y sobre ella se aade un
volmen idntico de EDA0,5 Ma pH5,0 y 40Cen 4 fracciones distanciadas entre s 15
minutos, cuidando el mantenimiento de la temperatura a 40C de la mezcla de reaccin
en bao de hielo. Transcurridos 15 minutos desde la adicin de la ltima fraccin, se
permite el calentamiento progresivo de la solucin hasta alcanzar la temperatura
ambiente y se sube su pH hasta 10,0 aadiendo NaOH. Se agrega NaB!
4 hasta una
concentracin final 20 mg/ml y despus de 30 minutos de agitacin suave la solucin se
dializa. Es conveniente que el primer medio de dilisis sea una solucin tampn de pH
10,0 para evitar la formacin excesiva de H2 producto de la degradacin de NaB!4; el
resto de las diluciones pueden ser en agua destilada.
La concentracin final de las soluciones obtenidas son 1,0 0,14 mM, segn sea
el dextrano de partida 6.000 o 87.000.
147
CAPITULO 1 1 1
M~ VODOS
4. ENTRECRUZAMIENTO INTRAMOLECULAR CON AGENTES
POLIFUNCIONALES LA ENZIMA INMOVILIZADA
Se han realizado tratamientos de algunos de los derivados enzimticos
inmovilizados obtenidos con los nuevos agentes entrecruzantes polifuncionales con la
intencin de que se produzcan entrecruzamientos intramoleculares en la enzima
inmovilizada.
La cantidad de agente entrecruzante ofrecido en la reaccin se expresa en moles
por molcula de enzima, lo cual hace imprescindible conocer en cada caso la cantidad
de enzima inmovilizada en cada derivado.
4.1. ENTRECRUZAMIENTO CONPOLIMEROS POLLALDEHIDICOS
Se suspende el derivado enzimtico en una solucin de TMAiB 200 mM, fosfato
15 mMde pH 7,0 conteniendo MgCI
2 2 mM, en relacin 1:4 (v:v). Sobre la suspensin
obtenida se agrega la cantidad de solucin de polmero (Apartado 3.1) correspondiente
a 20 moles de polmero por mo] de enzima inmovilizada. Despus de varias horas (3,5-
144 horas) de agitacin suave, se diluye hasta relacin 1:10 (v:v) con tampn bicarbonato
25 mMde pH 10,0 conteniendo MgCI2 2mM, se aade NaB!4 hasta 1 mg/ml total y se
contina la incubacin durante 30 minutos ms. Transcurrido este tiempo se lava el
derivado con fosfato 25 mMde pH 7,0 con MgCI2 2 mM y se fltra.
4.2. ENTRECRUZAMIENTO CONPOLIMEROS POLIAMINICOS
Se suspende el derivado enzimtico en tampn fosfato 20 mM, MgCl2 2 mM de
pH 6,0 en relacin 1:4 (v:v). Sobre la suspensin obtenida se agrega la cantidad de
solucin de polmero (Apartado 3.2) correspondiente a 10 moles de polmero por mol
de enzima inmovilizada. Despus de 4 horas de agitacin suave, se aade CDI
(concentracin final: 1.lOtl.102 M) y se continua la incubacin durante 1,5 horas ms.
Transcurrido este tiempo se lava el derivado con fosfato 25 mM de ph 7,0 conteniendo
MgCl2 2 mMy se filtra.
148

.1 k 1
CAPITULO III
MgIODOS
5. ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMATICA
5.1 . ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DE /3-GALACTOSIDASA DE K. ladis
Auna cubeta con 2 ml de solucin de substrato sinttico oNPG(o-nitrofenil-/3-D-
galactopiransido) 5-40 mMen tampn fosfato potsico 20 mM de ph 7,0 conteniendo
MgCI
22 mMy KO0,1 M, termostatizada a 25
0C y con agitacin suave, se le aade una
muestra de 25-200 A de solucin enzimtica o de suspensin de derivado. Del registro
del incremento de absorbancia que se produce a 405 nm en funcin del tiempo
transcurrido, se determina la velocidad inicial de hidrlisis para este substrato la cual se
expresa en Unidades de Actividad. Una Unidad de Actividad se define como la cantidad
de enzima que es capaz de hidrolizar 1 gmol de oNPG por minuto a 250C. El E del o-
fenol en las citadas condiciones es 3150 M1. cmt
5.2. ENSAYO DE ACTIVIDAD ENZIMATICA DE /3-GALACTOSIDASA DE E. coil
Auna cubeta con 2 ml de solucin de substrato sinttico oNPG(o-nitrofenil-/3-D-
galactopiransido) 5-40 mMen tampn fosfato 20 mMde pH 7,0, termostatizada a 250C
y con agitacin suave, se le aade un muestra de 25-200 A de solucin enzimtica o de
suspensin de derivado (si la muestra tuviera mucha actividad enzimtica ser necesaria
su dilucin previa con el mismo tampn). Del registro del incremento de absorbancia
que se produce a 410 nm en funcin del tiempo transcurrido, se determina la velocidad
inicial de hidrlisis para este substrato la cual se expresa en Unidades de Actividad. Una
Unidad de Actividad Hidroiltica se define como la cantidad de enzima que es capaz de
hidrolizar 1 gmol de oNPG por minuto a 250C.
6. ENSAYOS DE ESTABILIDAD ENZIMATICA.
El proceso consiste en la medida de actividad enzimtica de muestras extradas
a diferentes tiempos de una incubacin de enzima soluble o derivado enzimtico en las
condiciones detalladasen cada caso. Se representan grficamente los valores de actividad
frente al tiempo y de este modo se pueden comparar estabilidades de diferentes
derivados o del mismo en diferentes condiciones de incubacin, as como determinar las
vidas medias en dichas condiciones.
149
. 1
CAPITULO TU
MEIODOS
6.1 . ESTUDIO DEL EFECTO DE LA DILUCION SOBRE LA ESTABILIDAD
ENZIMATICA.
Se ha estudiado el comportamiento en canto a su estabilidad de las enzimas
oligomricas frente a la dilucin, tanto sobre la enzima en solucin como sobre los
diferentes derivados enzimticos obtenidos, para ello se han incubado en las condiciones
indicadas para la estabilidad trmica soluciones o suspensiones enzimticas en dos
concentraciones, siendo estas siempre las mismas para poder comparar los resultados
obtenidos en diferentes experimentos.
Las diluciones realizadas del extracto comercial deK lactAs (2150 U./ml extracto)
fueron 46 U./ml solucin) y 0.16 U./ml solucin, siendo las suspensiones de los
diferentes derivados idnticas en el caso de los derivados multipuntuales por estar ms
cargados y la mitad en cada caso en los derivados unipuntules. En el caso de la enzima
de E. coIl las diluciones realizadas van desde 1 mg/ml hasta 1.iCY
3 mg/ml.
7. ELECTROFORESIS DE PROTENAS EN GELES DE ACRILAMIDA CON SDS.
La separacin e identificacin de la enzima de inters del extracto enzimtico
comercial se ha realizado mediante SDS-PAGE (SDS-Polyac,ylamide Gel Electrophoresiv)
que consiste en la electroforesis de zona en gel de poliacrilamida preparado en sistemas
de tampn con SDScomo agente disociante. Para la preparacin del gel se ha empleado
el sistema de tampn discontinuo o multifsico (92,93).
El gel de separacin utilizado es homogneocon un 10% (p/v) de poliacrilamida,
permitiendola buenaseparacin de las cadenaspolipeptdicas a estudiar. Comopatrones
de calibracin se ha utilizado una mezcla comercial de protenas de pesos moleculares
por subunidad de: 94.000 (fosforilasab de musculo de conejo), 67.000 (albumina de suero
bovino), 43.000 (ovalbumina de clara de huevo), 30.000 (anhidrasa carbnica de eritrocito
bovino), 20.100 (inhibidor de trz~sina de semilla de soja) y 14.400 (a-lactalbu,nina de leche
bovina).
Preparacin de las muestras:
1 ~ La muestra enzimtica se diluye con tampn de ruptura (2x) en relacin 1:2
(V~ ~ ~ tantosi setrata de una solucin proteica como de un derivado enzimtico
1 50
CAPITULO III METODOS
inmovilizado. En el caso de derivado enzimtico inmovilizado se habr diluido
previamente con agua en relacin 1:1,1 (Ve~v,~:Vrw.)para facilitar la toma de
sobrenadante
2~ La muestra se hierve al bao-mara durante 5 minutos. Una vez que la muestra
haya enfriado, est preparada para ser aplicada en el gel y proceder a la electroforesis.
32 El volumen de muestra aplicado al gel fue de 10 pl.
151
CAPITULO TU
RESULTADOSYDISCUSION
RESULTADOS Y DISCUSION
1 . fi-GALACTOSIDASA DE Kluyveromyces ladis
El estudio realizado sobre la estabilizacin de la estructura cuaternaria de la /3-
galactosidasa de K lactAs se ha centradoinicialmente en el comportamiento de la enzima
nativa en solucin. Se ha analizado el efecto de la dilucin sobre el mantenimiento de
la estructura cuaternaria de la molcula travs de su estabilidad en condiciones ptimas,
as como su comportamiento ante la presencia o ausencia de determinados cationes
(Mt~ y Mn
2~) Posteriormente y para minimizar las interferencias que supondra la
presencia de estabilizantes y sales del extracto comercial crudo, se ha preparado un
derivado enzimtico por inmovilizacin de la enzima a un soporte de agarosa de forma
que la estructura de la molcula de enzima se vea mnimamente afectada por el proceso,
manteniendo un comportamiento lo ms parecido al de la enzima en solucin; para estar
seguro de ello, la intencin es lograr la innimovilizacin de la enzima a un soporte por
la mnima cantidad de enlaces. La ltima parte del trabajo estudia el comportamiento
de los dos tipos de derivados multipuntuales obtenidos por inmovilizacin de la enzima
al soporte utilizado dos estrategias de inmovilizacin diferentes. A partir de los
resultados obtenidos se han propuesto hiptesis en relacin al comportamiento de la
enzima dependiendo del sistema de inmovilizacin y de la presencia de determinados
iones.
1 .1 . ESTUDIO DEL COMPORTAMIENTO DE LA ENZIMA SOLUBLE
Se estudi el comportamiento de la /3-galactosidasa de K lactAs en solucin a su
pH ptimo de actividad, pH 7,0, con la intencin de analizar el efecto de la dilucin de
la enzima sobre su estabilidad. Los experimentos se realizaron en presencia y en ausencia
de cationes MgZ+ y Mn2~, con la intencin de conocer como influyen estos iones en la
estabilizacin de la enzima. En cada una de las curvas mostradas en la figura 111.5 se
representan las actividades remanentes de dos soluciones del extracto enzimtico
comercial siendo la relacin entre sus concentraciones de 1/300 y estando incubadas en
el mismo medio.
152
CAPITULO m
RESULTADOS YDISCUSION
En ausencia de cationes divalentes en el medio de incubacin, existe una clara
dependencia de la estabilidad con la concentracin a la cual se encuentra la enzima. A
concentraciones bajas de enzima, la incubacin a altas temperaturas desencadena una
inactivacin enzimtica mucho ms rpida. Los valores de semivida son 8 horas para la
solucin concentrada y 30 minutos para la solucin diluida 300 veces respecto a la
primera. Al encontrarse la enzima ms diluida, se favorece el desplazamiento del
equilibrio entre la forma asociada (activa) y disociada (inactiva) en el sentido de la
disociacin. Los monmeros aislados no slo son inactivos sino que son ms sensibles
a posteriores distorsiones provocadas por la tempertura, acelerando de nuevo el proceso
de disociacin.
Cuando la incubacin tiene lugar en un medio con Mg
24, la solucin enzimtica
diluida conserva mayor porcentaje de actividad enzimtica residual que si este catin no
esta presente. El resultado es una semivida de 8 horas para la solucin concentrada y 2
horas para la solucin diluida. Parece que el Mg2~ estara ayudando al mantenimiento
de la estructura cuaternaria de la enzima, dificultando la disociacin y, en consecuencia
transmitiendo mayor estabilidad al dmero.
La presencia de Mn2~, unida a la de Mg2~ hace que el proceso de inactivacin sea
independiente de la concentracin de enzima, conservando ambas soluciones el 50-55%
de actividad despus de 8 horas de incubacin a 450C.
1.2. DERIVADO PREPARADO SOBRE GEL GLUTARALDEHIDO-AGAROSA-3
El extracto comercial, segn especificaciones comerciales, contiene estabilizantes
que podran estar interfiriendoen los resultados de estabilizacin obtenidos. Para evitar
que los estudios realizados con la enzima nativa reflejen dichas interferencias,
obtenindose resultados no reales del comportamiento de la enzima en solucin, se ha
considerado la posibilidad de trabajar con la enzima inmovilizada covalentemente sobre
un soporte slido.
Para poder estudiar el comportamiento puro de la molcula de enzima la
inmovilizacin ha de tener lugar a travs de una interaccin muy suave con el soporte,
que afecte mnimamente a su conformacin. Para ello se ha elegido un soporte como el
2e1 2lutaraldehdo-agarosa de gran reactividad en medios ligeramente bsicos prximos
a la neutralidad (7,0-8,6), condiciones en las cuales slamente los grupos amino de
154
CAPITULO Hl
RESULTADOSVOISCUSION
menor pK (como los aminos terminales de la cadena polipeptidica) podrian reaccionar,
con una densidad superficial de grupos reactivos muy baja (3 moles por ml de gel),
adems la reaccin ha transcurrida a pH 7.0 con lo cual la reactividad, incluso de los
grupos amino terminales, se encuentra muy mermada, y por ltimo, el tiempo de
interaccin enzima-soporte permitido ha sido corto (1 hora) para limitar, una vez
producida la insolubilizacin a travs de un enlace, la posibilidad de reacciones entre
grupos amino menos reactivos de la enzima, favorecidas por la cercana al soporte. De
este modo se pretende la insolubilizacin de las molculas de enzima al soporte por el
mnimo nmero de enlaces, para no modificar su estructuran ni alterar su
comportamiento.
Durante la preparacin de este derivado, se ha comprobado que tanto la
disminucin de la temperatura como la reduccin de la cantidad de enzima ofrecida no
permiten la inmovilizacin de cantidad suficiente de enzima, por ello se ha ofrecido gran
cantidad de la misma y la incubacin se ha realizado a temperatura ambiente.
El efecto de la dilucin sobre la estabilidad del derivado obtenido se representa
en la figura 111.6. La ausencia de cationes en el medio permite apreciar la mayor
inestabilidad trmica del derivado en funcin de la dilucin. Cuando la enzima
inmovilizada dispone de Mg
2~ en el medio la prdida de actividad de la incubacin
menos concentrada es ms suave, aunque no alcanza la estabilidad de la suspensin de
derivado concentrada. La presencia de Mn2~ y Mg2~ en el medio de incubacin no slo
evita la desestabilizacin de la suspensin diluida, sino que mantiene la actividad
enzimtica de ambas suspensiones en el 100% durante 8 horas.
Los resultados reflejan el idntico comportamiento de la enzima inmovilizada
sobre el gel glutaraldehdo-agarosa-3 al que mostraba la enzima soluble, tanto en
ausencia de cationes como en presencia de Mg24~
155
CAPITULO III
RESULTADOSVOISCUSION
1 00
4>
=
o>
e
O
E
o>
O
0
-y
O
78
50
28
o
1 00
E
o>
o
O
75
SO
25
O
1 00
ja
e
O>
e
O
E
o>
O
0
< u
75
50
28
o
Figura 111.6. Inactivaciones tnnicas del derivado de /3-galactosidasa de 1< anis preparado por
mmoviizacin covalente sobresoporte gluxaradehdo-agarosa-3 incubado endos concentracines diferentes:
(0) 24 U.ImI y (.)0,07 U.Iml, realizadas a 45
0Cen tampn fosfato potsico 20 mM de pH 7,0 conteniendo
KO 0,1 M: (A) en ausencia de cationes divalentes, (B) con MgCI
2 2 mMy (C> con MgCI2 2 mM y MnCh
0,2 mM.
156
fi fi
O 2 4 6 0
tiempo <horas)
2
4 6 8
tiempo <horas)
(C)
o
2 4 6 8
tiempo (horas)
CAPITULO III RESULTADOSVOISCUSION
En ausencia de cationes la disociacin de subunidades es el principal mecanismo
de inactivacin de la enzima cuando se encuentra diluida y la presencia de Mg
2~ es capaz
de disminuir los procesos de disociacin de las subunidades. Cuando adems se dispone
de Mn2~, la dilucin de la enzima deja de influir en la velocidad de inactivacin, lo
mismo que para la enzima en solucin, sin embargo en el caso del derivado se produce
una ganancia de estabilidad adicional de la suspensin enzimtica que no se observa
cuandoel estudio se realiza con la enzima soluble, parece que el Mn2~ ejerce dos efectos
sobre la enzima inmovilizada: reduce los fenmenos de disociacin y estabiliza la
conformacin asociada activa. Estos resultados manifiestan que en la preparacin del
derivado enzimtico deben haberse formado tan pocos enlaces que slo han permitido
la unin de las molculas de enzima al soporte a travs de una de sus dos subunidades,
por ello los procesos de disociacin no se han visto afectados por la inmovilizacin.
La confirmacin de que el derivado obtenido posee la mayora de las molculas
de enzima inmovilizadas a travs de una de las dos subunidades idnticas que las
componen se ha logradoal realizarla electroforesis del sobrenadante de una suspensin
de este derivado incubado en un medio disociante y reductor (SDSy 13-mercaptoetanol).
En la figura 111.7 se puede observar la presencia de la banda correspondiente a la
subunidad de la enzima homodimrica (= 100.000 D).
Figura TU.7. Electroforesis en geles de acrilamida con SDS de la /3-galactosidasa de K ans: (P)patrn,
(A) solucin enzimtica control, (B) derivado glu taraldehdo-agarosa- 75 y (C) derivado giutaraldehdo-
agarosa-3 y (D) derivado gioxil-agamsa- 75.
157
CAPITULO 1 1 1
RESULTADOSYDISCUSION
1 .3. DERIVADO PREPARADO SOBRE GEL GLUTARALDEHIDO-AGAROSA-75
Se ha preparado un derivado enzimtico utilizando el mismo soporte
glutaraldehdo-agarosa y en un medio al mismo pH (pH 7,0), con una densidad
superficial de grupos reactivos sobre el gel mxima (75 moles grupos reactivos/ml gel)
y el tiempo de interaccin se ha prolongado (20 horas). De este modo se pretende que
las molculas de enzima se unan al soporte con la misma orientacin que en el derivado
anterior, pero esta vez a travs de una interaccin mucho ms intensa, forzando la
formacin de numerosos enlaces enzima-soporte.
Al realizar la electroforesis del sobrenadante resultante al final del proceso de
inmovilizacin sobre el soporte glutaraldehdo-agarosa-75 se ha comprobado que toda
la protena del extracto comercial que se haba ofrecido inicialmente al soporte se ha
inmovilizado, tanto la correspondiente a la banda de 100.000 D comootras protenas que
se detectan de una muestra diluida del extracto enzimtico comercial utilizado.
Cuando en el gel de electroforesis se aplica una muestra del sobrenadante de una
suspensin del derivado enzimtico incubado en SDSy mercaptoetanol (Figura 111.7) se
comprueba que no se ibera ninguna cadena polipeptdica, ni de las correspondientes a
la subunidad, ni de las otras protenas que impurifican el extracto comercial que s se
haban unido al soporte. Se puede, por lo tanto, asegurar que ha tenido lugar la unin
covalente de la fi-galactosidasa al soporte a travs de sus dos subunidades pues el
tratamiento disociante no consigue la aparicin de monomros en el sobrenadante.
Realizando inactivaciones trmicas de suspensiones de este derivado en el que se
ha confirmado la unin al soporte por ambas subunidades, se ha observado que en
ausencia de cationes divalentes la inactivacin debida a la dilucin es mucho menos
importante de lo que lo era tanto para la enzima libre en solucin, como para la enzima
inmovilizada a travs de uno de sus dos monmeros (Figura 111.8 A). Cuando la
inactivacin se realizaen un medio con Mg
2t los valores de semivida son independientes
de la concentracin de enzima en la suspensin (Figura 111.8 B). Por incubacin en
presencia de Mn2~, independientemente de que adems se encuentre presente M? ~,
tiene lugar, por un lado la inactivacin independiente de la dilucin y, por otro lado la
estabilizacin adicional de las suspensiones enzixnticas, sus semividas se duplican en
relacin a las obtenidas con Mg2~ (Figura 111.8 Cy D).
158
CAPITULO III RESULTADOSYDISCUSION
100
a
a
r
.5
25
o
18 24 0
e
ti
e
a
E
O
lB 24
0 8 1 2 1 8 0 8 1 2 1 8
ti empo (ho w as) ti empo (ho ra)
Figura TUi. Inactivaciones trmicas del derivado de /3-galactosidasa de K tactis preparado por
inmovilizacin covalente sobre soporte gluaratdehdo-agarosa-75 incubado en dos concentracines
diferentes: (U) 45 U.ImI y (>0,16 U.ImI, realizadas a 45
0C en tampn fosfato potsico 2OmM de pH 7,0
conteniendo KCI 0,1 M: (A) en ausencia de cationes divalentes, (B) con MgCI
2 2 mM, (C) con MnCI2 0,2
mM y < D) con MgCI2 2 mMy MnCI2 0,2 mM.
En resumen, el Mg
2~ parece ser capaz de anular los procesos de inactivacin
dependientes de la concentracin, haciendo independientes: velocidad de inactivacin
trmica y concentracin de enzima en la mezcla de incubacin y la presencia de Mn2~
en el medio no slo evita la dependencia de la estabilidad de la concentracin, sino que
adems alarga la vida media de la enzima incubada.
159
(A)
(B)
o
1 00
~ 75
E
O
1
3
lo o
75
O
a
~5o
a
1 25
o
0 6 1 2
ti empo (ho ras)
6 12
ti empo (ho ras)
CAPITULO TU RESULTADOSYDISCUSION
1.4. DERIVADO PREPARADO SOBRE GEL GLIOXIL-AGAROSA-75
El soporte glioxil-agarosa es capaz de reaccionar con los grupos E-amino de los
residuos Lys, disponibles en gran cantidad en la superficie de la mayora de las enzimas,
por ello en el presente trabajo se ha propuesto su utilizacin para la inmovilizacin
multipuntual de esta enzima.
Antes de intentar la inmovilizacin se ba estudiado si la estabilidad de la enzima
en solucin le permite mantener la suficiente actividad en un medio tan bsico como el
necesario para el proceso de interaccin enzima soporte (pH 10,0). En la figura 111.9 se
representan grficamente las actividades enzimticas remanentes respecto al tiempo
transcurrido de incubacin de la enzima concentradaen solucin a 4
0Cy pH 10,0, a 200C
y pH 9,4, y a 200C y pH 10,0.
100
~75
c i>
e
a>
e
< U
~5o
0
(U
0
3
~25
o
120
ti empo (mi nu to s)
Figura 111.9 Estabilidades trmicas de la /3-galactosidasa de K. ladis soluble incubada en tampn
bicarbonato potsico 40 mM conteniendo MgC2 2 mMy KCI 0,1 M : (X) de pH 10,0 a 40, (e) de pH 9,4
a 200C y (U) de pH 10,0 a 200C.
0 30 60 90
160
CAPITULO TU RESULTADOSYDISCUSION
La inestabilidad de la enzima a 20
0C en un medio de pH 10,0, obliga a plantear
la inmovilizacin en dos etapas: una primera etapa a 40C y pH 10,0 con la intencin de
simplemente insolubilizar la enzima en su forma activa sin pretender una unin muy
intensa de las molculas al soporte y una segunda etapa en la que se permite el
calentamientoprogresivo de la mezclaenzimtica hasta alcanzar la temperatura ambiente
manteniendo el pH 10,0 con lo cual se favorece la interaccin a travs de ms grupos de
la protena insolubilizada con el soporte. Durante el transcurso de esta segunda etapa,
el control de la actividad remanente de la enzima inmovilizada permite llegaT a una
solucin de compromiso entre la duracin de la incubacin en busca de mayor nmero
de interacciones enzima-soporte y el porcentaje de actividad remanente de la enzima
inmovilizada.
El curso de la inmovilizacin se ha recogido en la figura 111.10. En ella se
representa: la actividad residual de una solucin enzimtica (solucin control) con la
misma concentracin y en idnticas condiciones que la ofrecida al soporte, para evaluar
el comportamiento de la enzima en solucin; la actividad enzimtica del sobrenadante
de la suspensin en la que sucede la inmovilizacin, que reflejar tanto las perdidas de
actividad de la enzima soluble por las condiciones del medio como la insolubilizacin de
la enzima sobre el soporte; y, por ltimo, la actividad total de la suspensin enzimtica
que recoge la de la fraccin soluble como la insolubilizada.
Del anlisis de los resultados (Figura 111.10) se deduce una mayor velocidad de
inactivacin de la enzima soluble (solucin control) respecto a la suspensin, teniendo
en cuenta que la fraccin soluble de la suspensin se comporta de forma idntica a la
solucin control, la mayor actividad remanente de la suspensin es debida a la fraccin
de enzima que ya se encuentra inmovilizada, lo cual indica que la simple insolubilizacin
provoca cierta estabilizacin. Esta estabilizacin se ve favorecida con el aumento de la
temperatura y la prolongacin de la incubacin enzima-soporte, al menos durante la
primera hora de incubacin a 200C.
El resultado final es la inmovilizacin del 100% de la enzima ofrecida, en
condiciones en las que la enzima en solucin pierde prcticamente toda su actividad
(actividad residual de la disolucin-control: 8%), conservando una actividad remanente
del 40-45% en el derivado enzimtico. La unin de la enzima al soporte glioxil-agarosa-
75 ha significado estabilizacin de la enzima en medio bsico.
161
CAPITULO III RESULTADOS YDISCUSION
100
~ 2 75
a>
c
a>
c
< U
~50
1 .~
0
(u
0
.5
4-
~25
o
180
tiempo <mi nu to s)
Fgura TU.1O. Curso de inmovilizacin de la /3-galactosidasa de K anis sobre gel glioxil-agarosa-75:
suspensin (.), solucin-control (soluble) (e) y sobrenadante (U ) .
~ Efecto de la dilucin y de la presencia de cationes divalentes sobre la
estabilidad del derivado glioxil-agarosa-75
La electroforesis realizada (Figura 1 1 1 .7) manifiesta la ausencia de protenas en
el sobrenadante de una suspensin de derivado glixil-agarosa-75 incubadoen condiciones
reductoras y disociantes, lo cual indica que el soporte utilizado para la inmovilizacin as
como las condiciones en las que sta se ha llevado a cabo han permitido la unin de
todas las protenas del extracto comercial y, concretamente en el caso de olgomeros
(como es la j3-galactosidasa que se est estudiando), esta unin ha tenido lugar a travs
162
4
0C
4
400 * 200C
0 30 60 90 120 150
.1 . ..
CAPITULO TU
RESULTADOSYDISCUSION
de ambas su bu n i dades.
Los r esu l tados en c u an to a l a estabi l i z ac i n l og r ada p or l a i n mov i l i z ac i n se
r ep r esen tan en l a f i g u r a 111. 11:
lo o
75
ti
ti
c
ti
a
~1
.5
2 25
o
75
a
E
ti
E
3
~ 25
0 6 1 2 1 8 24
ti empo (ho ras)
75
ti
50-
ti
.5
25-
0
(O)
o
1 00-4
75.
a
c
E ~
ti
ti
3
25-
6
1 2
t MY , po (ho ras)
lO 24 o
6 1 2
ti empo (ho ras)
1 8 24
1 8 24
Figura TILil. Inactivaciones trmicas del derivado enzimtico preparado por inmovilizacin covalente
sobre soporte glutaraldehdo-agarosa.75 incubado en dos concentracines diferentes: (0) 45 U.Irnl y (.)
0,16 U.Im], realizadas a 45
0C en tampn fosfato potsico 20 mM de pH 7,0 conteniendo KCI 0,1 M: (A)
en ausencia de cationes divalentes, (B) con MgCI
2 2 mMy (C) con MnCI2 0,2 mM, y (D) con MgCI2 2 mM
y MnCI2 0,2 mM.
163
H .VJ f
lo o
(B>
0 6 1 2
tiempo (horas)
(D)
CAPITULO TU RESULTADOSYDXSCUSION
La i n ac ti v ac i n t r mi c a si mu l tan ea de su sp en si on es de este der i v ado en di f er en tes
c on c en tr ac i on es man i f i esta en au sen c i a de i on es ( F i g u r a 111. 11 A) mayor v el oc i dad de
i n ac ti v ac i n c u an to mayor es l a di l u c i n de l a en z i ma en el medi o; si se en c u en tr a
p r esen te Mg
24 en el medi o ( F i g u r a 111. 11 B ) el ef ec to de l a di l u c i n n o v ar a en r el ac i n
a l a estabi l i dad, f av or ec i n dose l a desestabi l i z ac i n al baj ar l a c on c en tr ac i n de en z i ma
i n c u bada; l a p r esen c i a de Mn 2~, c on ( F i g u r a 111. 11 C) o si n Mg 24 ( F i g u r a 11. 11 D ), l og r a
h ac er i n dep en di en te l a estabi l i dad de l a di l u c i n a l a qu e se en c u en tr e l a en z i ma, adems
de c on f er i r estabi l i dad adi c i on al al der i v ado.
S i se c omp ar an l os r esu l tados de estabi l i dad del der i v ado g l i ox i l -ag ar osa-75
( F i g u r a 111. 11) c on el c omp or tami en to de l a en z i ma sol u bl e ( F i g u r a 111. 5) o de l a en z i ma
i n mov i l i z ada a tr av s de u n a de su s su bu n i dades ( der i v ado f 3-g al -g l u tar al deh do-ag ar osa-
3) ( F i g u r a 111. 6), se dedu c e qu e l a inmovilizacin multipuntual sobre el soporte glioxil-
ag ar osa-75 h a r edu c i do en or memen te l a i n ac ti v ac i n p r ov oc ada p or l a di l u c i n , si bi en
p ar a an u l ar di c h o mec an i smo de i n ac ti v ac i n ser n ec esar i a l a p r esen c i a ex c l u si v a de
Mn 24, el c u al adems c on f i er e estabi l i z ac i n adi c i on al al der i v ado en z i mti c o; en el
der i v ado j 3-g al -g l u tar al deh do-ag ar osa-75 l a p r esen c i a de c u al qu i er a de l os c ati on es
di v al en tes estu di ados ( Mg 24 o Mu 24) es c ap az de ev i tar el ef ec to de l a di l u c i n , si en do
el i on Mu 24 el qu e p r ov oc a l a estabi l i z ac i n adi c i on al
1. 5. ES TUD IO COMPARATIVO DE LOS DERIVADOS ENZIMATICOS OBTENIDOS.
DISCUSION
S e h an r eal i z ado ter moi n ac ti v ac i on es de l os tr es der i v ados en z i mti c os p r ep ar ados
a baj a c on c en tr ac i n , c on el f i n de c omp ar ar l a estabi l i dad en c on di c i on es en l as qu e se
encuentran f av or ec i dos todos aqu el l os p r oc esos de i n ac ti v ac i n dep en di en tes de l a
c on c en tr ac i n . La f i g u r a 111. 12 A mu estr a qu e l a estabi l i z ac i n se l og r a s l o c u an do l a
inmovilizacin de las molculas de enzima ha tenido lugar por enlaces en los que
p ar ti c i p an ambas su bu n i dades, es dec i r en l os dos der i v ados mu l ti p u n tu al es.
164
pi
CAPITULO 1 1 1
RESULTADOS YDISCUSION
loo
a>
E
a>
E
(u
E
a>
~0
0
5
t
(u
75
50
25
o
loo
t
a>
a>
E
(u
E
a>
(u
o
(u
75
50
25
o
Figura 111.12. Inactivacin tnnica de /3-galactosidasa de IC ladis en tampn fosfato potsico 20 mM de
pH 7,0 conteniendo MgCI2 2 mMy KCI 0,1 Ma 45
0C: soluble (O) , inmovilizada sobre gel glutaraldehdo-
agarosa.3 (o), inmovilizada sobre gel glutaraldehdo-agarosa-75 (U> e inmovilizada sobre gel glioxil-
agarosa-75 (e). (A) a baja concentracin de enzima: 27-46 U/mI (B) a alta concentracin de enzima (0,07-
0,16 U/mI).
165
(A)
0 6 1 2 1 8
24
tiempo (horas)
0 1 2 24
tiempo <horas)
CAPITULO m RESULTADOSYDISCUSTON
En condiciones en las que los fenmenos de disociacin no se encuentren
favorecidos, es decir cuandoen las suspensiones de los derivados enzimticos incubados
la concentracin de enzima es alta (Figura 111.12 B) solamente la unin multipuntual al
soporte glioxil-agarosa permite la estabilizacin.
A la vista de los resultados de la inactivacin, parece ser que la inmovilizacin
sobre el soporte glioxil-agarosa-75 no slo limita la inactivacin por dilucin al evitar la
disociacin de las subunidades de la molcula de enzima, como se mostraba en la figura
111.12 A, sino que adems logra estabilizaciones adicionales independientes de la dichos
procesos. El tipo de activacin de ste ltimo soporte ha permitido la formacin de un
mayor nmero de enlaces entre cada subunidad y el soporte lo cual ha dotado al dmero
de una estructura 3Dms rgida y por lo tanto ms resistente a posibles distorsiones que
provocarian su inactivacin trmica.
Respecto a la influencia de la inmovilizacin multipuntual sobre el efecto de la
presencia de cationes covalentes, se observa que:
- el Mg2
4 es capaz de evitar la inactivacin por dilucin cuando se trata del
derivado /3-gal-glu:araldehldo-agarosa-75, sin embargo no ejerce ningn efecto sobre el
derivado f3-gal-glioxil-agarosa-75. Probablemente la mayor multiinteraccin enzima-
soporte en el ltimo derivado citado ha afectado de algn modo al centro de unin
correspondiente a ste catin quedando impedida su entrada y por lo tanto a su
colaboracin en el mantenimiento de la estructura cuaternaria correcta del dmero.
- la accin del catin Mn2t por el contrario, no se v afectada por el diferente
grado de multiinteraccin entre los derivados pues en ambos casos protege de la prdida
de la estructura cuaternaria y alarga la semivida de la enzima en ausencia de procesos
de disociacin de subunidades.
2. fl-GALACTOSIDASA DE Eseherichia coil
La inmovilizacin de /3-galactosidasa de E. col persigue como primer objetivola
unin simultnea de sus cuatro protmeros. La acometida del proceso ha de cumplir dos
requisitos interrelacionados: conferir a la molcula la orientacin adecuada y permitir
nultiinteraccin. Para que al menos en cada subunidad tenga lugar la formacin de una
enlace con el soporte este ha de poseer el tipo de grupo reactivo capaz de conferir a la
166
CAPITULO 1 1 1 RESULTADOS YDISCUSION
molcula de enzima la disposicin espacial ptima para que sus subunidades sean
capaces de interaccionar con l, para ello la densidad de grupos reactivos sobre el
soporte ha de ser suficiente y las condiciones de la reaccin ha de favorecer la,
interaccin.
El conseguir la estabilizacin de la estructura cuaternaria con la inmovilizacin
de la enzima olgomrica por unin covalente, pertitir el desarrollo, sobre los derivados
enzimticos obtenidos, de estudios posteriores orientados al incremento de la estabilidad
de la enzima como catalizador; analizar los factores que intervienen en los diferentes
mecanismos de inactivacin y aplicar mtodos adecuados a cada caso o desarrollar
nuevos procedimientos de estabilizacin.
2.1. INMOVILIZACION MULTIPUNTUAL SOBREDIFERENTES SOPORTES
Se han aplicado las diferentes estrategias disponibles para la inmovilizacin por
unin covalente de enzimas a un soporte. Se han empleado soportes con diferentes
grupos reactivos y activados al mximo. Alos soportes glioxil-agarosa la enzima se unir
por su zona ms rica en Lys, a los geles MAN-agarosa lo har a travs de la zona mas
rica en grupos carboxilo (Isp o Glu), y p or g r u p os amino de bajo pK como el amino
trminal tendr lugar la unin a los soportes activados conglutaraldehdo. En condiciones
de reaccin propicias para la interaccin intensa, se han preparado derivados enzimticos
con el proposito de evaluar cada una de las orientaciones adoptadas por la enzima en
cuanto a su capacidad para estabilizar la estructura cuaternaria de esta enzima
tetramrica.
2.1 .1 . INMOVILIZACION SOBRE SOPORTE GLIOXJL-AGAROSA-75
La insolubilizacin es muy rpida, en 30 minutos queda en el sobrenatante el 8%
de la enzima ofrecida (1 mg/ml gel), conservndose toda la actividad de la fraccin de
enzima inmovilizada. Sin embargo se mantiene la incubacin en las mismas condiciones
durante 20 horas con la intencin de favorecer la multiinteraccin enzima-soporte y, en
consecuencia, la participacin del mayor nmero de subunidades que permita la
orientacin conferida por el mtodo. Transcurrido dicho tiempo la actividad remanente
de la enzima inmovilizada es del 31%, lo cual indica que las condiciones de la
167

m~flM
c~ rrru~ o m
RESULTADOSYDISCUSION
DERIVADO Actividad (a) Disociacin de
subunidades (b)
g l i ox i l -ag ar osa-75 31 +++
MANA-ag ar osa-75 64
g l u tar al deh i do-ag ar osa-75 100 +
(a) Actividad enzimtica que conserva la /3-galactosidasa de E. coli despues del proceso de inmovilizacin
sobre diferentes soportes de agarosa.
(b) Valoracin de la aparicin de la banda correspondiente a Vaovo D. en la electroforesis de os
sobrenadontes de losdiferentes derivados enzimticos incubados en condicionesfavorablespara la disociacin
de subunidades.
Tabla 111.1. Derivados de 3-galactosidasa de E. coiL
S eg n se r ec og e en l a tabl a 111. 1 l a i n mov i l i z ac i n de l a oligoenzima travs de sus
r esi du os de Lys (derivado glioxil-agarosa-75) n o p er mi te l a u n i n al sop or te de su s c u atr o
p r ot mer os p u es p or el ec tr of or esi s se obser v a l a ap ar i c i n de l a ban da de p r ote n a
c or r esp on di en te 100. 000 D , ban da i den ti f i c ada c omo l a correspondiente al monmero
( 85> . Cu an do l a i n mov i l i z ac i n tu v o l u g ar sobr e el soporte MANA-agarosa- 75 p or r eac c i n
a tr av s de l os c ar box i l os de l a c aden a p ol i p ep t di c a, n o se ap r ec i a p r ote n a l i ber ada del
sop or te. El derivado glutaraldehldo-agarosa-75 p er mi te l a di soc i ac i n de u n a p equ ea
f r ac c i n de p r ote n a.
Estos r esu l tados i n di c an qu e l a or i en tac i n c on f er i da p or inmovilizacin al soporte
MANA-agarosa-75 es l a n i c a qu e h a p er mi ti do u n a u n i n al sop or te de g r an i n ten si dad
y en l a qu e p ar ti c i p an su s c u atr o su bu n i dades, p u es l a i n c u bac i n del der i v ado en
c on di c i on es al tamen te di soc i an tes (SDSy 13-mercaptoetanol), p r ev i a a l a el ec tr of or esi s n o
es c ap az de l i ber ar al sobr en adan te c an ti dad ap r ec i abl e de p r ote n a.
Cu an do el tetr mer o se or i en ta en r el ac i n al sop or te p or su z on a ms r i c a en Lys
l a en z i ma mostr u n a i mp or tan te c a da de ac ti v i dad atr i bu i bl e a l a i n ten si dad de l a
i n ter ac c i n ya qu e el p r oc eso se h a l l ev ado a c abo baj o c on di c i on es de al ta r eac ti v i dad,
si n embar g o en l a u n i n n o se h an v i sto i n v ol u c r adas todas su s su bu n i dades y p or el l o
l a el ec tr of or esi s mu estr a u n a i mp or tan te ban da p r otei c a. En el der i v ado p r ep ar ado sobr e
gelgluuzraldehldo-agarosa-75, si bi en tambi n p er mi te l a l i ber ac i n de p r ote n a, seg n l a
i n ten si dad de l a ban da r eg i str ada en l a el ec tr of or esi s, l a c an ti dad de su bu n i dades n o
169
CAPITULO m RESULTADOSYDISCUSION
u n i das al sop or te p ar ec e men or qu e en c as an ter i or , adems l a ac ti v i dad en z i mti c a
r eman en te es del 100%. En r esu men : c u an do el tetr amer o se or i en ta c on r esp ec to al
sop or te p or su z on a i p s r i c a en Lys n o se v en i n v ol u c r adas su s c u atr o su bu n i dades y
p i er de u n 70% de su ac ti v i dad; si n embar g o si l a i n mov i l i z ac i n de l a en z i ma est
di r i g i da a l a r eac c i n a tr av s de su s ami n os t r mi n al es n o af ec ta a l a ac ti v i dad
en z i mti c a l l eg an do a p ar ti c i p ar u n mayor n mer o de su bu n i dades p or mol c u l a.
Estas h i p tesi s su r g i das de l os r esu l tados obten i dos p or el ec tr of or esi s, se v en
af i an z adas si se an al i z a l a estr u c tu r a tr i di men si on al r ep or tada, l os p r ot mer os se
di sp on en en u n p l an o a l o l ar g o de dos ej es de si metr a p er p en di c u l ar es, i n ter ac c i on an do
dos-a-dos p or su s c ar as i d n ti c as ( v er F i g u r a 111. 4), as l as dos su p er f i c i es p l an as qu e
of r ec e el tetr mer o al medi o son i d n ti c as y en l l os p r ot mer os op u estos of r ec en su
mi sma z on a, l a c ar a c on tr ar i a a l a qu e of r ec en l os p r ot mer os si tu ados en l os otr os dos
op u estos ( 86). S i se su p on e qu e estas dos c ar as de c ada su bu n i dad o p r ot mer o n o
p oseen l a mi sma den si dad en g r u p os r eac ti v os ( p . e. Lys), dos su bu n i dades p odr n
i n ter ac c i on ar i n ten samen te c on el sop or te mi en tr as l as otr as dos n o, p u es su c ar a r eac ti v a
se en c on tr ar a del otr o l ado del tetr mer o. Esto p odr a ser l o qu e su c ede en el derivado
multipuntual glioxil-agarosa, p u es adems se sabe qu e de l os 1023 ami n oc i dos qu e
c omp on en el mon mer o de / 3-g al ac tosi dasa de E. coil, s l o 20 c or r esp on den a Lys, l o
c u al i n di c a su baj a den si dad su p er f i c i al en u n a c aden a polipptidica tan v ol u mi n osa. Por
otr o l ado, el ex tr emo ami n o ter mi n al de c ada su bu n i dad se en c u en tr a en l o qu e en el
tetr mer o c or r esp on de a dos v er ti c es op u estos mu y p r x i mos c ada dos mon mer os, l o
c u al i n di c a qu e ser p osi bl e l a i n ter ac c i n de l os c u atr o r esi du os c on el sop or te si emp r e
qu e l as c on di c i on es de i n c u bac i n f av or ec i er an l a r eac ti v i dad de l os g r u p os. As en el
derivado glutaraldehldo-agarosa-75 p odr an h aber p ar ti c i p ado tr es o l as c u atr o
su bu n i dades en u n a g r an p ar te de Is mol c u l as i n mov i l i z adas.
S obr e l os der i v ados en l os qu e l a i n mov i l i z ac i n n o h a c on seg u i do l a estabi l i z ac i n
de l a estr u c tu r a c u ater n ar i a de l a en z i ma, se h a p r op u esto el desar r ol l o de estr ateg i as
c omp l emen tar i as c omo el en tr ec r u z ami en to, qu e p er mi tan l a f or mac i n de p u en tes
en l ac es c ov al en te en tr e l as su bu n i dades n o u n i das al sop or te y l as qu e ya se en c u en tr an
i n ter ac c i on an do c on l den tr o de l a mi sma mol c u l a.
170
CAPITULO fi
RESULTADOS YDISCUSION
2.2. ENTRECRUZAMIENTO CON AGENTES POLWUNCIONALES DE ENZIMAS
OLIGOMERICAS
S e h a estu di ado l a ap l i c ac i n de estr ateg i as de en tr ec r u z ami en to c omo
h er r ami en ta de estabi l i z ac i n de l a estr u c tu r a c u ater n ar i a de der i v ados en z i mti c os
i n mov i l i z ados en l os qu e l a or i en tac i n c on f er i da a l a mol c u l a n o h a p er mi ti do l a u n i n
si mu l tan ea de todas su s su bu n i dades al sop or te. Los ag en tes en tr ec r u z an tes u ti l i z ados se
h an g en er ado a p ar ti r de mol c u l as de dex tr an o de di f er en te p eso mol ec u l ar : p ol mer os
p ol i al deh di c os o p ol mer os p ol i am n i c os.
El estu di o se h a desar r ol l ado sobr e u n der i v ado i n mov i l i z ado a gel glutaraldehdo-
agarosa-75 p or dos moti v os: en p r i mer l u g ar , p or qu e ser u n o de l os m todos qu e n o
p er mi te l a u n i n si mu l tan ea de todas l as su bu n i dades y, en seg u n do l u g ar , p or qu e el
p r oc eso de inmovilizacin no supone prdidas de actividad para la en z i ma l o c u al es
i mp or tan te si se ti en e en c u en ta qu e l a r eac c i n c on el ag en te entrecruzante supone la
modi f i c ac i n qu mi c a de l a en z i ma y p odr a af ec tar a su ac ti v i dad en z i mti c a.
2. 2. 1. ENTRECRUZAMIENTO S OB RE UN D ERIVAD O UNIPUNTU,4L
> l n mov l l z ac bi n w si p w du a sobr e sop or te g l u tar al deh do-ag ar osa
S e h a u ti l i z ado u n sop or te ac ti v ado c on 3 mol es de g r u p os r eac ti v os p or ml de
g el . La i n mov i l i z ac i n h a ten i do l u g ar en l as mi smas c on di c i on es qu e se p r ep ar el
der i v ado mu l ti p u n tu al (glutaraldeh(do-agarosa-75) c on el f i n de n o modi f i c ar l a
or i en tac i n p r ef er en te de l a mol c u l a en r el ac i n al sop or te, mar c ada p or l a r eac ti v i dad
de l os g r u p os de l a p r ote n a en esas c on di c i on es. El r esu l tado es l a i n mov i l i z ac i n de
men or c an ti dad de en z i ma p u es s l o se h a i n sol u bi l i z ado el 50% de l a en z i ma of r ec i da
( 1 mg / m ) y el man ten i mi en to de toda su ac ti v i dad en z i mti c a. La el ec tr of or esi s r eal i z ada
del sobr en dan te de u n a su sp en si n de este der i v ado i n c u bado en S D S y mer c ap toetan ol
h a dado c omo r esu l tado l a ap ar i c i n de u n a ban da ms i n ten sa qu e l a del der i v ado
mu l ti p u n tu al c or r esp on di en te al p r ot mer o.
171
CAPITULO Rl RESULTADOS YDISCUSION
* Entrecruzamiento con polmeras polialdehdicos
Se ha estudiado la influencia, sobre la eficacia del entrecruzamiento, de factores
como el tamao del polmero y el tiempo de reaccin. Se han utilizado polmeros de
diferentes pesos moleculares: 6.000, 18.300 y 87.000 y los tiempos de reaccin
transcurridos han sido entre 3,5 horas y 6 das. En todos los casos se han ofrecido para
el proceso 20 moles de polmero por mol de enzima inmovilizada, basndose en
experimentos realizados sobre otras enzima oligomricas que mostraron buenos
resultados (40). En la tabla 111.2 se recogen las condiciones en la que transcurrieron las
diferentes reacciones, el efectosobre laactividad enzimticainmovilizada ylos resultados
obtenidos en relacin con la electroforesis.
Con di c i on es r eac c i n
PMp oi i meyo ( a) ti emp o ( b)
Ac t
( c )
Disociacin de
subunidades (d)
- --- 100
6. 000 3, 5 100
87. 000 3, 5 94 ++++
6. 000 46 86
87. 000 46 71
18. 300 144 46 ++
87. 000 144 35 ++ fi
(a) Peso molecular (Ji)) del dextrano comercial a partir del cual se prepar el polmero.
<b)Duracin de la incubacin (horas) del derivado inmovilizado suspendido en la solucin de polmero en las
condiciones expecft7cadas en Mtodos.
(c) Porcenage de actividad enzimtica remanente del derivado inmovilizado una vezfinalizada la incubacin
y reducidos los posibles enlacesformados.
(4) Valoracin de la aparicin de la banda correspondiente a 100.000 D. obtenidas ppor electroforesis segn
se especifica en Mtodos.
Tabla 111.2. Modificacin qumica con polmeros polialdehdicos del derivado de /3-galactosidasa de E. coli
inmovilizada covalentemente sobre soporte glutaraldehido agarosa-3. Influencia de la concentracin de
polimero y de la duracin de la reaccin.
172
1 1
CAPITULO III RESULTADOSVOISCUSION
Han sidonecesarios tiempos de interaccin muy largos (varios das de incubacin)
para conseguir que la electroforesis refleje una pequea disminucin la disociacin de
subunidades en los derivados modificados. Los tratamientos que han dado lugar a esa
estabilizacin parcial de la estructura cuaternaria del derivado unipuntual han supuesto
prdidas de actividad enzimtica, mayores cuanto mayor es el tiempo de interaccin y
el tamao del polmero utilizado, lo cual indica la mayor modificacin qumica de la
en z i ma.
> Entrecruzamiento con polmneros polianilnicos
Se ha estudiado la influencia, sobre la eficacia del entrecruzamiento, de factores
como el tamao del polmero, la concentracin de CDI, y la temperatura de la reaccin.
En todos los casos se han ofrecido para el proceso 10 moles de polmero por mol de
enzima inmovilizada, basndose en experimentos realizados sobre otras enzima
oligomricas que mostraron buenos resultados (40). En la tabla 111.3 se recogen las
condiciones en la que transcurrieron las diferentes reacciones, el efectodel procesosobre
la actividad de la enzima inmovilizada y los resultados obtenidos en la electroforesis.
Los derivados incubados en presencia de los polmeros poliamnicos con una
concentracin de CDI de 1.10.1 Mno permiten que en condiciones altamente disociantes
se pueda detectar (por electroforesis) liberacin de protena del soporte, sin embargo,
la modificacin qumica de la enzima ha sido tan intensa que ha perdido su actividad
cataltica. El descenso de la concentracin de CDI en el medio de reaccin da lugar a
derivados con mayor actividad remanente pero en los que ya no se estabiliza la
estructura cuaternaria, aunque lafraccin proteica liberaday registrada por electroforesis
es menor que la que se aprecia en el derivado que no ha interaccionado con el polmero.
La menor concentracin de CDI utilizada, 1.10.2 M, ha permitidola obtencin de
derivados modificados conservando el 100% y el 55-65% de su actividad enzimtica,
segn se haya realizado el entrecruzamiento con un polmero de 6.000 o de 87.000
daltones. El efecto del tamao del polmero poliamnico sobre la actividad remanente
del derivado podra ser el reflejo de distorsiones de la enzima provocadas por
interacciones ms numerosas cuando la cadena de agente entrecruzante es larga.
173
1 1
CAPITULO Rl RESULTADOS YDISCUSION
Condiciones de reaccin Act.~mM
(d)
Disociacin de
subunidades (e)
PMpoijme,t, < a) CDI (b) Temperatura(c)
- --- 100
6.000 1.10- TA 2 -
5.10.2 TA 8 +
3.10~ TA 31 +
3(10.2) TA 36 ++
1,10.2 TA 100 ++
87.000 1.10- TA 3
1.10.2 lA 55 ++
1.10.2 F 65 ++
(a) Peso molcular (Daltones) del dextrano comercial a partir del cual se prepar el polmero.
(b) Concentracin (M) de CDI en el medio de incubacin.
(c) Temperatura (
0C) a la que transcurri la incubacin. TA: Temperatura ambiente (18-200C%, E: Fro (0C>.
(4) Porcentaje de actividad enzimtica remanente del derivado inmovilizado una vez finalizada la incubacin
y reducidos los posibles enlaces formados.
(e) Valoracin cualativa de la banda correspondiente a 100.000 D. obtenidas por electroforesis segn se
especiflea enMtodos.
Tabla RlJ. Modificacin qumica con polmeros poliamnicos del derivado de /3-galactosidasa de E. coli
mmovilizada covalentemente sobre soporte glutaraldehdo agarosa-3. Influencia de la concentracin de
polimero, de la concentracin de CDI en la reaccin y de la duracin de la incubacin.
2.2.2. ENTRECRUZAMIENTO SOBRE UN DERIVADO MULTIPUNTU4L
Basndose en el estudio de los diferentes factores que influyen en la eficacia del
entrecruzamiento sobre el derivado unipuntual, se han elegido las condiciones que
podran ser ms apropiadas y se han aplicado al derivado multipuntual obtenido por
inmovilizacin sobre el mismo soporte (gel glutaraldehdo-agarosa) que, segn se haba
comprobado por electroforesis tampoco presenta unidas al soporte sus cuatro
su bu n i dades.
174
CAPITULO LII
RESULTADOS YDISCUSION
Entrecruzamiento con polmeras pollaldehdicos
Se ha utilizado el polmero de 87.000 D, ofrecindose 20 moles por mol de
enzima inmovilizada y se ha incubado en presencia del soporte drante 6 das (144
horas). El derivado modificado resultante conserv el 67% de su actividad, lo cual
supone una inactivacin mucho menor con respecto a la sufrida por el derivado
unipuntual despus del mismo tratamiento. La electroforesis no permite apreciar la
aparicin de la banda correspondiente al protmero, lo que significa que el tratamiento
ha conseguido enlazar intramolecularmente las subunidades que no se encontraban
unidas al soporte a las que si formaban enlace covalente con l.
fr Entrecruzamiento con polmeras poliaminicos
El derivado se ha hecho reaccionar con el polmero de 6.000 daltones en un
medio con CDI 5.10.2 M (TA) y con el polmero de 87.000 en un medio con CDI 3.10.2
M (FA). Los derivados modificados, obtenidos despues de los citados tratamientos, al
ser incubados en SOS y mercaptoetanol no permiten la disociacin de subunidades. El
primero de los tratamientos di lugar a una derivado con el 24% de actividad enzimtica
remanente, mientras que el segundo conserv el 32%.
2.3. TERMOESTABILIDAD DE LOS DIFERENTES DERIVADOS INMOVILIZADOS
En la figura 111.13 se muestran los cursos de inactivacin obtenidos con diferentes
derivados de esta enzimaoligomrica y se han comparado conla estabilidad de la enzima
en solucin a la misma concentracin.
Se ha realizadola incubacin a 44
0Cdetres derivadosenzimticos preparados por
inmovilizacin sobre un mismo tipo de soporte cuyo grupo reactivo condiciona la
orientacin de la molcula. La diferencia entre ellos se encuentra en el nmero de
subunidades que se encuentran unidas covalentemente directa o indirectamente al
soporte sin posibilidad de disociarse del resto del tetramero para diluirse en el medio de
i n c u bac i n .
175
CAPITULO III RESULTADOS YDISCUSION
-loo
t75
e
e
e
u
u
3
t25
sc
o
Ti empo (ho ras)
Figura 111.13. Inactivaciones trmicas de /3-galactosidasa de E. coli soluble (5) y de tres derivados
mmovilizado de ella: derivado glutaraldehdo-agarosa-3 o Ec-1 (o), derivado glutaraldehdo-agarosa-75 o
Ec-2 (U) y derivado glutaraldehdo-agarosa estabilizado por modificacin con molculas polialdehdicas
o Ec-3 (e)
-En el derivado Ec-1 la enzima debe estar inmovilizada covalentemente a travs
de una de sus cuatro subunidades pues la baja densidad de grupos reactivos de
soporte obtenido y laescased de residuosproteicos con reactividad suficiente para
interaccionar con ellos no permitira la formacin de ms enlaces. Por
electroforesis se comprob disociacin de una fraccin importante de protmero.
-. El derivado Ec-2 debe tener una gran parte de la molculas inmovilizadas por
dos o ms subunidades pues el soporte posee gran candidad de grupos reactivos
y superficiales lo cual favorece la participacin de varios grupos y por lo tanto
1 2 3 4 5 6 7 8
176
CAPITULO m RESULTADOSYDISCUSION
de varias subunidades de la misma molcula, por eso no permite la disociacin.
- El derivado Ec-3, que mantiene las cuatro subunidades de la enzima
inmovilizadas unas directamente al soporte y las otras unidas a las primeras por
entrecruzamiento con molculas polaldehdicas, esunas 20 veces ms estable que
el derivadounipuntual o que la enzima en solucin, consecuencia de la
estabilizacin de su estructura cuaternaria.
Dos de los derivados glutaraldehido-agarosa-75 con la estructura cuaternaria
estabilizada por entrecruzamiento se incubaron a diferentes concentraciones a 44
0C.
Paralelamente se realiz la incubacin de la enzima en solucin en las mismas
condiciones. Las figura 111.14 A y B se recogen los cursos de inactivacin
correspondientes a estas incubaciones en dos concentraciones diferentes.
En ellas se observa que la dilucin de la enzima 10 veces provoca su
desestabilizacin en un medio a pH ptimo de actividad, tanto si esta se encuentra Ubre
en solucin como si sus molculas se han inmovilizado y todas sus subunidades se han
unido entre si.
Los derivados modificados muestran diferentesvelocidades de inactivacin segn
la concentracin a la que se encuentre la enzima en el medio, sin embargo se ha
conprovado que el proceso de estabilizacin desarrollado hasta obtener dichos derivado
no permite que se produzcan los fenomenos de disociacin de subunidades relacionados
con la dilucin de la enzima en el medio de reaccin. Esto hace suponer que en el
sistema enzimtico est teniendo lugar algn otro proceso relacionado con la dilucin
del derivado en el medio; algn otro proceso cuyo mecanismo se base en la modificacin
de las concentraciones de especies activas y no activas relacionadas travs de un
equilibrio de asociacin-disociacin.
177
1 . 1 .
u fi
CAPITULO III RESULTADOSVOISCUSION
e
e
e
e
0
E
O
0
~0
.5
o
4
100
75
50
25
o
100
t
ti
e
e
e
E
e
a-
~0
e
o
4
75
50
25
o
Figura 111.14. Inactivacionestrmicas en dos concentraciones diferentes de
derivado glutaraldehdo-agarosa-75, incubados en tampn fosfato 20 mM,
solucin concentrada () y solucin diluida (...) .
(A) la enzima soluble y (E) del
KCL 0,1 Mde pH 7,0 a 45
0C:
Si se tiene en cuentalos variados resultados obtenidos en reacin a la influencia
de determinados cationes en la actividad enzimtica, en su actividad optima, as como
el diferente efecto que manifiestan sobre cada substrato y al variar las condiciones del
medio, podra ser la presencia o ausencia de alguno de ellos la causante de la perdida
178
(A)
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Tiempo <horas)
x
-x
-x
(B)
. x . - -
0 1 2 3 4 5 8 7 8
Tiempo <horas)
1 1 .1 .
CAPITULO m
RESULTADOSYDISCTJSION
de actividad o de su menor estabilidad. Estos tomos pueden tanto jugar un papel
importante dentro del mecanismo cataltico de la enzima como desarrollar una
determinada funcin estructural en la molcula. La interaccin de estos cationes con la
cadena polpeptidica es de tipo inico y por ello el grado de ionizacin de determinados
grupos de la protena y todo la que pueda afectar a dicha asociacin, influir en mayor
o menor medida en su eficiencia.
131 estudio de esta enzima queda abierto a la investigacin de la posible influencia
de determinados cationes sobre su actividad y estabilidad en los derivados enzimticos,
2+
especialmente del Mg
3. DISCUSION
Se han estudiado la posibilidad de inmovilizacin y estabilizacin de la estructura
cuaternaria de dos enzimas oligomricas, las /3-galactosidasas de K lactis y de E. cok.
Con respecto a la primera, no ha resultado dificil la inmovilizacin covalente
simultnea a travs de las dos subunidades que la componen, el exito del proceso
depende llevar a cabo el proceso en unas condiciones que permitan la multiinteraccin
enzima soporte para favorecer la participacin de residuos pertenecientes a las dos
subunidades. En este caso particular ha sido suficiente con la utilizacin de un soporte
con alta densidad de grupos reactivos, sin ser necesario extremar las condicionees del
medio de incubacin para aumentar la reactividad de los grupos. Para ello se han
utilizado dos soportes: gel glutaraldehido-agarosa que interacciona esencialmente con el
residuo amino trminal de la cadena polipeptdica, y el gel glioxil-agarosa que
interaccionar con los residuos Lys superficiales de la misma.
Una vez comprabada la estabilizacin la estructura cuaternaria en cuanto a evitar
los fenmenos de disociacin de subunidades en el medio de reaccin, se ha visto que
ello supone la estabilizacin trmica de la enzima cuando esta es diluida. En
concentraciones en las cuales la disociacin no est favorecida la simple inmovilizacin
de las dos subunidades (derivado glutaraldehdo-agarosa-75) no es suficiente para
mostrar estabilizaciones trmicas, siendonecesaria una inmovilizacin ms intensacomo
la logradaen el derivado glioxil-agarosa-75, probablemente porque permite la formacin
de mayor cantidad de enzaces en cada subunidad lo cual confiere rigidez a su estructura
terciaria.
179
CAPITULO m
RESULTADOSYDISCUSION
Por otro lado, se ha estudiado el efecto de los cationes Mn
2~ y Mg2~ sobre los
diferentes derivados enzimticos obtenidos y los resultados obtenidos ha permitido
establecer hiptesis sobre el papel que pueden tener en la estabilidad de la enzima. En
la enzima en solucin ambos cationes actan estabilizando la estructura cuaternaria pues
reducen las diferencias de estabilidad causadas por la dilucin de la solucin enzimtica.
Cuandola enzima se encuentra inmovilizadaa travs de sus dos subunidades la presencia
de estos cationes no slo permite eliminar el efecto de la dilucin, sino que confieren
estabilizacin adicional.
En cuanto a la segunda de las enzimas estudiadas, la /3-galactosidasa de E. cok
es una enzima mucho ms compleja y su estudio tadava necesita ser ampliado pues los
resultados obtenidos son muy interesantes. A pesar de tratarse de una enzima
tetramrica, la disposicin ms o menos en un plano de sus protmeros ha permitido la
estabilizacin de su estructura cuaternaria siguiendo dos estrategias: la inmovilizacin
multi-subunidades a un soporte MANA-agarosa y la inmovilizacin parcial a un soporte
glutaraldehdo-agarosa que ha sido finalmente completada con el desarrollo de
estrategias adicionales de entrecruzamiento intramolecular con molculas poliamnicas
o polialdehdicas. La unin de sus cuatro subunidades por cualquiera de los dos mtodos
hapermitidola estabilizacin trmicade los derivados incubados a altas concentraciones.
Sin embargo, si bien los fenmenos de disociacin de subunidades han sido impedidos
por la inmovilizacin de todas ellas al soporte, esto no se refleja en la prolongacin de
las semividas de los derivados incubados diluidos. Por eso se ha pensado en que algn
otro mecanismo de inactivacin favorecido por la dilucin de la enzima que no ha sido
reducido por la estabilizacin de la estructura cuaternaria contine siendo el responsable
del proceso, como por ejemplo la disociacin de algn catin impresicindible para la
actividad.
Utilizando dos tipos de polimeros polireactivos se ha conseguido el
entrecruzamiento intersubunidades de un enzima tetramrica que previamente se haba
inmovilizado por unin covalente unipuntual. Esto supone disponer de una importante
estrategia deestabilizacin de la estructura cuaternaria de cualquier protena oligomrica
que no pueda ser inmovilizada por unin simultanea de todas sus subunidades al soporte.
A nivel industria el conseguir derivados inmovilizados de enzimas oligomricas en los
que no tenga lugar la disociacin de sus subunidades consecuencia de la dilucin del
catalizador durante los largos y numerosos ciclos de reaccin, ser de gran importancia
por evitarse la contaminacin de la mezcla de reaccin con el catalizador y la
180
CAPiTULO III
RESULTADOSYDISCUSION
c on sec u en te i n ac ti v ac i on .
Es importante sealarque el proceso de entrecruzamiento supone la modificacin
qumica de la enzima. Esta modificacin qumica puede afectar a su actividad enzimtica
por lo que es importante el control de la reaccin y de las variables que influyen en su
rendimiento y que dependern de la enzima sobre la que se desarrolle el mtodo. Para
la ptimizacin de las condiciones se ha de llegar a un compromiso entre la efectividad
del entrecruzamiento y su efecto sobre la actividad cataltica de la enzima.
En general, para el abordaje de la inmovilizacin y estabilizacin de cualquier
enzima hay que tener en cuenta que la complejidad de la molcula proteica hace
necesario ampliar los estudios sobre todos los variados procesos que en diferente medida
afectan a su actividad y a su estabilidad.
181
DISCUSION GLOBAL Y
CONCLUSIONES
182
DISCUSION GLOBAL Y CONCLUSIONES
DISCUSION GLOBAL Y CONCLUSIONES
Alo largode la presente Tesis Doctoral se han desarrollado diferentes estrategias
de Ingeniera Bioqumica para resolver los problemas asociados al diseo molecular de
derivados de renina y lactasas tilies para la hidrolsis de casena K y lactosa en leche.
Dado que dichos problemas son similares a los de otros sistemas enzimticos de inters
en qumica orgnica, qumica analtica e, incluso, en tecnologa de otros alimentos, se
han desarrollado tcnicas bioqulmico-fisicas de modificacin deenzimas que, en principio,
pudieran tambin ser vlidas para otros procesos enzimticos o para procesos
cromatogrficos en los que se emplean protenas y otras macromolculas como ligandos.
Estas tcnicas se pueden agrupar en:
- Inmovilizacin orientada de enzimas utilizando diferentes reas de su superficie
en el proceso de unin covalente al soporte.
- Utilizacin de slidos porosos con diferente morfologa interna como soportes
para la inmovilizacin de enzimas.
- Utilizacin de brazos espaciadores grandes, inertes, hidroflicos y flexibles para
optimizar la interaccin entre la molcula de enzima inmovilizada y el substrato,
cuando ste sea macromolecular y por lo tanto presente mayores condicionantes
estricas a la interaccin con la enzima.
- Utilizacin de molculas tipo dextrano como agentes espaciadores o como
agentes entrecruzantes.
-Utilizacin de las cadenas de carbohidratos de enzimas glicosiladas como brazos
espaciadores o como agentes entrecruzantes intrnsecos.
-Modificacin qumica previa de la enzima para optimizar las diferentes
estrategias de inmovilizacin o de entrecruzamiento. Lo cual permite simular los
183
1
DISCUSION GLOBAL Y CONCLUSIONES
resultados que por vas genticas se obtendran de un mododirigido y controlado,
al enriquecer en un determinado grupo la zona de la enzima que interese para
posteriores reacciones de inmovilizacin o de entrecruzamiento.
La aplicacin coordinadade las diferentes tcnicasde inmovilizacin ha conducido
a resultados muy importantes. As:
- se han obtenido derivados de renina de Mucor miehel que conservan despus de
la inmovilizacin el 33% de su actividad caseinoltica Estos resultados son
realmente espectaculares si se comparan con los datos de la literatura cientfica
donde la renina inmovilizada apenas mostrabaun 1% de esta actividad coagulante
con respecto a la enzima soluble.
- la combinacin de un proceso de aminacin controlada de la13-galactosidasa de
Aspergillus otyzae y el diseo del proceso de unin multipuntual y del
entrecruzamiento posterior con su propias cadenas glicosdicas ha permitido
estabilizaciones de 600 veces con respecto a la enzima soluble aminada y de ms
de 20 veces respecto a la enzima nativa.
- con la estabilizacin conjunta de la estructura cuaternaria y de la estrcutura
tercuiaria que se ha logradopor inmovilizacin multipuntual de la$-galactosidasa
de Kluyveromyces Iadds sobre geles de agarosa se ha aumentado su estqabilidad
trmica ms de 10 veces en relacin a la enzima nativa.
Entre los resultados expuestos en la presente Tesis Doctoral se resaltan
prevemente las siguientes conclusiones:
1. Tomando como enzimas modelo, cuatro enzimas de inters en la industria
lctea, se han desarrolladouna serie de metodologas de Ingeniera Enzimtica sobre la
base de la tecnologa bioquimico-fsica en fase slida para la obtencin de derivados
inmovilizados, reutilizables por lo tanto, abordando tres importantes condicionantes o
limitaciones surgidas de la complejidad de los catalizadores enzimticos, como lo son:
las enzimas que actan sobre substratos macromoleculares, las enzimas glicosidadas y la
184
DISCUSION GLOBAL Y CONCLUSIONES
en z i mas ol i g om r i c as.
2. Diseando cuidadosamente el proceso de inmovilizacin se han preparado
derivados de renina de Mucor me/id que conservan en todos los casos el 100% de su
actividad cataltica hacia el substratosinttico de bajo pesomolecular, utilizando soportes
con diferentes estructra interna, diseando procesos de inmovilizacin a travs de
diferentes reas de la enzima e interponiendo diferentes tipos de brazos espaciadores
entre los grupos activos que reaccionan con la enzima y el soporte sobre el cual estn
situados. Todos estos parmetros: lamorfologa del soporte, el tipo de grupo activo y el
brazo espaciador utilizado, resultaron decisivos par definir la accesibilidad de los
substratos macromoleculares hacia el centro activo de las molculas de enzima
inmovilizada. De este modo las actividades caseinolticas de los diferentes derivados
preparados varan en un margen muy amplio desde un 2% hasta un 33% de la actividad
corespondiente a la enzima nativa que haba sido inmovilizada.
3. Los mejores resultados, 100% de actividad hacia el hexaptido sinttico y 33%
de actividad hacia la casena ic se obtuvieron cuando la inmovilizacin de la renina de
Al. me/id tuvo lugar a travs de sus cadenas de carbohidratos a soportes con estructura
interna constituida por entramados de cadenas unimoleculares poliacrilicas. Esta
combinacin de un slido que promueve pocos impedimentos estricos y el brazo
espaciador intrnseco que supone la presencia de las propias cadenasglicosdicas de esta
glicoenzima ha permitido obtenier una actividad caseinoltica con renina inmovilizada
mas de 10 veces superiores a las reportadas hasta ahora en la literatura cientfica.
4. La /3-galactosidasa de Aspergillus oryzae est tambin altamente glicosilada y,
a pesar de ello, se ha inmovilizado, probablemente a travs de una unin bipuntual, a
geles glioxil-agarosa dando lugar a unos derivados que conservan un elevado porcentaje
de actividad cataltica (un 75%) pero solamente dos veces ms estables que la enzima
nativa. La aminacion adicional de la enzima soluble, por reaccin de sus residuos cidos
con etilendiamina, parece aumentar considerablemente las posibilidades de unin
multipuntual enzima-soporte, dando lugar a derivados inmovilizados estabilizados ms
de 500 veces con respecto a la enzima soluble aminada.
185
Vi L.
DISCUSION GLOBAL Y CONCLUSIONES
5. Se ha desarrollado una estrategia original de estabilizacin de enzimas
glicosiladas previamente inmovilizadas mediante entrecruzamiento intramolecular
utilizando sus propias cadenas de carbohidratos como agentes entrecruzantes intrinsecos.
La oxidadcin de estas cadenas da lugar a grupos aldehdo que, incubados en las
condiciones ptimas de temperatura, pH y tiempo, reaccionarn con residuos Lys o con
los residuos cidos modificados con etilendiamina que se encuentren en la superficie de
la molcula de enzima situados en la proximidad de dichas cadenas glicosidicas.
6. Tanto la unin covalente multipuntual de la 3.-galactosidasa de A. oyzae sobr e
los soportes glioxil-agarosa comoel posterior entrecruzamiento intramolecular utilizando
sus propias cadenas glicosdicas provocan un aumento importante de la rigidez de dicha
molcula, lo cual se traduce en estabilizaciones frente a condiciones inactivantes,
comotemperatura o pH. Sin embargo, para forzar estos procesos es preciso realizar dos
modificaciones qumicas de la enzima: la aminacin de sus residuos cidos y la oxidacin
de sus cadenas de carbohidratos. Estas modificaciones tienen efectos inactivantes per se
de diferente naturaleza y segn las condiciones de inactivacin. As mientras la
estabilizacin de los derivados frente a la enzima aminada y oxidada era superior a 500
veces, la estabilizacin relativa a la enzima nativa depende consideralemente de los
tratamientos realizados y de las condiciones de inactivacin. Una eleccin cuidadosade
los mtodos de modificacin y de las estrategias de estabilizacin ha permitido estabilizar
la enzima nativa ms de 20 veces frente al efecto del calor a pH 7,0.
7. La 3-galactosidasa de Kluyveromyces ladds fue inmovilizada sobre soportes
glioxil-agarosa y glutaraldehido-agarosa muy activados. En ambos casos se ha logrado
estabilizar la estructura cuaternaria de la molcula de enzima ya que la inmovilizacin
ha tenido lugar a travs de sus dos subunidades. Dicha estabilizacin se reflej en un
importante aumento de la estabilidad trmica de los derivados enzimticos. Mucho ms
espectaculares fueron los resultados obtenidos con los geles glioxil-agarosa,
probablemente por haberse prodiucido una interesante unin multipuntual involucrando
a varios residuos Lys de cada una de las subunidades de la misma molcula.
186
DISCUSION GLOBAL Y CONCLUSIONES
8. Se desarrollaron diferentes estrategias para estabilizar la estructura cuaternaria
de una protena todava ms compleja, la /9-galactosidasa de Escherichta col. Ciertas
inmovilizaciones involucrando la zona de la enzima ms rica en residuos carboxlo
produjeron la inmovilizacin de las cuatro subunidades. Sin embargo, la inmovilizacin
con diferente orientacin, a travs de residuos de Lys o del g r u p o amino tennnal no
ocurrieron a travs de todas las subunidades y se tuvo que recurrir al entrecruzamiento
con macromolculas polifuncionalizadas tipo dextrano como estrategia adicional de
estabilizacin a desarrollar sobre los derivados ya inmovilizados que no tenan la
estructura cuaternaria estabilizada. En este caso la estabilizacin de la estructura
tetramrica de la enzima refleja tambin un interesante incremento de termoestabilidad.
187
ft. .:* ~ -
BIBLIOGRAFLX
188
ib: r.~4
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