El dolor neuroptico crnico, como resultado de daos en el sistema nervioso central o

perifrico, es una condicin prevalente y debilitante, que afecta 7-18% de la population1,2. Los
sntomas incluyen espontnea (hormigueo, ardor, elctrico similar al shock) Dolor, disestesia,
parestesia, alodinia (dolor resultante de estmulos normalmente no dolorosos) e hiperalgesia
(una respuesta aumentada a los estmulos dolorosos). Los sntomas sensoriales son
comrbidos con discapacidades de comportamiento, como el insomnio y la depresin. Para
estudiar el dolor crnico neuroptico varios modelos animales imitacin lesin de nervios
perifricos se han desarrollado, es uno de los Bennett y Xie (1988) unilateral del nervio citico
constriccin crnica ms ampliamente utilizado lesin (CCI) 3 (Figura 1). Aqu presentamos un
mtodo para realizar CCI y pruebas de hipersensibilidad dolor. CCI se realiza bajo anestesia,
con el nervio citico en un lado expuesto haciendo una incisin en la piel, y cortar a travs de
la conectivo tejido entre los glteos y superficial de los msculos bceps femoral. Cuatro
ligaduras intestino crmico se atan flojamente alrededor del nervio citico a 1 mm intervalos,
slo ocluyen pero no detienen el flujo de sangre epineural. La herida se cierra con suturas en el
msculo y grapas en la piel. El animal es luego se dej recuperarse de la ciruga durante 24
horas antes de que comience la prueba de hipersensibilidad dolor.
Para las pruebas de comportamiento, las ratas se colocan en el aparato de ensayo y se les
permite habituarse al procedimiento de ensayo. El rea de prueba es la superficie central de la
planta de la pata trasera (Figura 2), que se inscribe en la distribucin del nervio citico. Umbral
de retirada mecnica se evala por estimular mecnicamente ambas patas traseras lesionadas
y no lesionadas mediante un plantar dinmico electrnico von Frey aesthesiometer o manual
von Frey hairs4. El umbral de retirada mecnica es la presin mxima ejercida (en gramos) que
desencadena la retirada de la pata. Para la medicin de latencia de retirada trmica, primero
descrito por Hargreaves et al (1988), la pata trasera est expuesta a un rayo de calor radiante a
travs de un transparente superficie de vidrio usando un meter5,6 analgesia plantar. La
latencia de retirada de los estmulos de calor se registra como el tiempo para la retirada de la
pata en tantoheridos y pata trasero ileso. Despus de CCI, el umbral de retirada mecnica, as
como la latencia de retirada trmica en la pata lesionada son tanto significativamente
reducida, en comparacin con las mediciones iniciales y la pata lesionada (Figura 3). El modelo
CCI de lesin del nervio perifrico combinada con pruebas de hipersensibilidad dolor
proporciona un sistema modelo para investigar la eficacia de agentes teraputicos potenciales
para modificar el dolor neuroptico crnico. En nuestro laboratorio, utilizamos CCI junto
sensibilidad trmica y mecnica de las patas traseras para investigar el papel de interacciones
neuro-inmune en la patognesis y el tratamiento del dolor neuroptico.
Protocolo
1. citico constriccin crnica del nervio
Tcnicas aspticas deben utilizarse para el procedimiento quirrgico. Desinfectar la superficie
de trabajo quirrgico con etanol al 70% y preparar con antelacin instrumentos estriles (por
ejemplo, tijeras, pinzas finas y retractor), gasas, grapas y los hisopos en autoclave. Para
mltiples cirugas, limpio y instrumentos reesterilizar con etanol al 70% o un esterilizador seco
del grano entre las ratas. Una mscara quirrgica, sombrero de pelo y guantes estriles deben
ser usados.
Para la constriccin del nervio, preparar la sutura catgut crmico cortndolo en piezas
pequeas de aproximadamente 3 cm de longitud sumergido en solucin salina estril, a evitar
que se seque. Para el cierre de la herida, utilizar suturas de seda disponibles comercialmente
estriles.
1. anestesiar la rata en una cmara de induccin usando 5% de isoflurano en O2, a
continuacin, entregar 2% de isoflurano en O2 a travs de una mascarilla por encargo, y vigilar
el animal anestesiado durante el procedimiento. Anestsicos alternativos comunes son
inhalados halotano o sodio intraperitoneal pentobarbital. La ketamina, como N-metil-D-
aspartato (NMDA) antagonista del receptor, debe evitarse ya que estos receptores son
importantes en el desarrollo del dolor neuroptico.
2. Shave la pata trasera izquierda de la rata. Luego, coloque el animal en una estera de
calefaccin termo-regulado a 37 C y aplicar lubricante oftlmico ungento para los ojos.
3. Esterilizar la zona afeitada con tres aplicaciones alternas de 70% de alcohol isoproplico y
solucin de yodo.
4. Con la rata acostada en su pecho / trax, elevar la pierna trasera izquierda y mantenga en su
posicin con la femoro a 90 de la columna vertebral utilizando cinta adhesiva en el pie.
5. Hacer una incisin en la piel en paralelo, pero 3-4 mm por debajo de la femoro, y liberar a la
piel del msculo que rodea la incisin cortando a travs del tejido conectivo.
6. Usando tijeras de punta roma, cortar a travs del tejido conectivo entre los glteos y
superficial de los msculos bceps femoral.
7. Use un retractor para ampliar la brecha entre los dos msculos, lo que permite una clara
visualizacin del nervio citico.
8. Con unas pinzas de punta roma curvas y micro-tijeras, suavemente libre de
aproximadamente 10 mm del nervio citico (proximal a la citica trifurcacin) del tejido
conectivo circundante.
9. Bajo el microscopio y una buena fuente de luz, empatar cuatro ligaduras (intestino crmico
4.0, Ethicon, EE.UU.) con un nudo doble, 1 mm de diferencia, proximal a la trifurcacin del
nervio citico. Para cada ligadura, comenzar con un solo lazo suelto, luego sujete los dos
extremos cercanos al bucle y apretar hasta que el lazo est apenas ajustado y la ligadura no se
desliza a lo largo del nervio. Para mantener el bucle en su posicin correcta, colocar un
segundo bucle en la parte superior de la primera para completar el nudo. Finalmente, cortar
los extremos sueltos de la ligadura a alrededor de 1 mm. La constriccin del nervio debe ser
mnima, y se detuvo inmediatamente si se observa una breve contraccin, para evitar la
detencin del flujo de sangre epineural. Apretar demasiado las ligaduras conduce a axotoma y
autotomy (automutilacin), ambos efectos secundarios no deseados que se opongan con xito
las pruebas de hipersensibilidad dolor.
10. Utilice suturas (Mersilk 5.0, Ethicon) para cerrar la capa y grapas muscular (Autoclip, 9 mm)
para sujetar la piel. A continuacin, utilice una solucin de yodo
(Riodine) para esterilizar la herida.
11. Observar la rata de cerca durante el perodo de recuperacin de anestesia, y permita que
se recupere en una jaula separada con ropa de cama de papel plana (no el ropa de cama de la
cra de animales estndar), a fin de evitar la asfixia animal inconsciente.
Antes de dar ningn investigadores analgesia postoperatoria debe considerar el hecho de que
esto puede interferir con las pruebas de hipersensibilidad dolor. De hecho, hay evidencia de
que la aplicacin local de anestsico, lidocana, en el momento de la lesin puede alterar el
desarrollo del dolor neuroptico, y disminuir el grado de hiperalgesia en el weeks7 anterior.
Para una mayor discusin sobre este asunto vase la revisin de Bennett et al8.
2. Las mediciones de dolor Comportamientos
1. manejo diario de las ratas durante varios das antes de comenzar el experimento se
recomienda con el fin de acostumbrar a las ratas a su manejador, reducir estrs y el riesgo de
morder.
2. Antes de las pruebas de comportamiento, las ratas necesitan ser habituado a los
procedimientos de control y el recinto de animales. El entorno de prueba debe ser mantenido
tranquila y bien controlada, con niveles de temperatura y humedad constantes, y llevado a
cabo a la misma hora del da cada sesin de evaluacin.
Pruebas de hipersensibilidad 3. dolor debe realizarse varias veces antes de CCI (lnea de base) y
en diferentes puntos de tiempo despus de ICC, segn se desee.
Umbral 3. retirada mecnica
1. En el da de la prueba, las ratas lugar en la malla elevada anonadado pruebas de jaula de 15-
30 minutos antes de medir los umbrales de retirada, permitiendo actividades de exploracin y
de aseo jaula para ratas y dejan a convertirse relajado y estacionaria.
2. Con una dinmica plantar von Frey aesthesiometer (Ugo Basile, Italia), coloque la unidad
touch-estimulador con el filamento directamente debajo del superficie central de la planta de
la pata trasera, evitando la malla metlica, y pulse la tecla de inicio. Esto levanta el filamento
para estimular mecnicamente el superficie plantar de la pata trasera con una fuerza
creciente.
Manuales de pelos de von Frey son una serie de filamentos de dimetro creciente que se
calibran para inducir una fuerza especfica cuando se aplica a la piel.
Se pueden utilizar como una alternativa a una dinmica plantar von Frey aesthesiometer
electrnica para la medicin de umbral de retirada de la pata, comopreviamente described4.
Tambin hay varios fabricantes alternativos de aesthesiometers von Frey electrnicos (como el
CITI, EE.UU. y Somedic, Suecia).
3. Registre el umbral de retirada mecnica de ambas patas traseras lesionados y no lesionados,
en un orden alternado. Este dispositivo se aplica presin a la pata y despus de la reaccin de
retirada del sistema de registros de forma automtica y muestra la fuerza mxima aplicada (en
gramos). Si una respuesta ambigua se produce (es decir, en el caso de la deambulacin o aseo
personal), repetir el estmulo y registrar el umbral de nuevo. Si chupan o sacudidas de la pata
trasera despus de la estimulacin es un signo de comportamiento asociados con el dolor.
4. Repita la estimulacin mecnica 3 veces con un intervalo de aproximadamente 5 min entre
estmulos, registrar los umbrales, y luego calcular la media de los umbrales de retirada de la
pata.
4. trmica Retiro Latencia
La intensidad de infrarrojos (IR) de calor del instrumento de prueba plantar debe ajustarse
antes de iniciar el experimento. En nuestro laboratorio, que se ajusta el I.R. intensidad para dar
una latencia media de retirada de la pata de unos 10 segundos en ratas ingenuas, y nos
pusimos en la latencia de corte a 20 segundos para evitar dao tisular en caso de que no se
retire una pata.
1. En el da de la prueba, las ratas lugar en el vaso anonadado pruebas de jaula de 15-30
minutos antes de medir la latencia, lo que permite la exploracin de la jaula y actividades de
cesar y ratas de aseo para convertirse relajado y estacionaria.
2. Usando un instrumento analgesia plantar trmica (Ugo Basile, Italia), coloque la fuente de
infrarrojos directamente debajo de la superficie central de la planta de la pata trasera, y pulse
la tecla de inicio. Esto expone la superficie plantar de la pata trasera a un rayo de calor
radiante a travs de un vidrio transparente superficie. Tambin hay fabricantes alternativos de
instrumentos de analgesia plantares trmicos (por ejemplo, CITI, EE.UU. y Stoelting, EE.UU.).
3. Registre la latencia de retirada de ambas patas traseras lesionados y no lesionados, en un
orden alternado. Este dispositivo registra automticamente la tiempo empleado (en segundos)
desde el inicio del estmulo trmico para retirada de la pata de la fuente de calor. Si una
respuesta ambigua se produce (es decir, en el caso de la deambulacin o aseo personal),
repetir el estmulo y registrar la latencia de nuevo. Lamer o sacudidas de la pata trasera
despus de la estimulacin es un signo de comportamiento asociado con el dolor.
4. Repetir la estimulacin de calor, al menos, 3 veces con un intervalo de alrededor de 5 min
entre los estmulos, grabar las latencias, y luego calcular la media de las latencias de retirada
de la pata.
4. resultados representativos
Un ejemplo de umbral mecnico retiro y retirada de latencia trmica en el ipsilateral
(lesionado) y (ileso) patas contralaterales
de ratas Wistar se muestra antes (lnea de base) y 2-12 das despus de ICC en la Figura 3A y la
Figura 3B. A partir de estas cifras se puede observar que CCI
causa una reduccin significativa en ambos umbrales de retirada mecnicas y trmicas
latencias de retirada de la pata trasera ipsilateral, indicando la
presencia de hipersensibilidad mecnica y trmica dolor, ambas caractersticas del dolor
neuroptico crnico.
Discusin
CCI es un modelo de lesin de nervio perifrico ampliamente utilizada de dolor neuroptico
crnico. Es relativamente simple de realizar, y produce robusto y
hipersensibilidad dolor estable durante al menos un mes despus de la lesin. Despus de CCI,
las ratas muestran una postura anormal de la pata trasera lesionada (dedos de los pies a cabo
juntos y plantar-flexionada y la pata evertido), as como repetidos temblores, vigilancia y
lamido de la pata trasera heridos que sugiere la presencia
pain9 de espontnea. Adems de la disfuncin sensorial, varios investigadores han
demostrado que el CCI evoca discapacidades de comportamiento, como
interacciones sociales interrumpidas, trastornos del sueo, behaviours10-13-depresiva como y
la ansiedad-como, sin embargo, esto es en contraste con el fracaso en encontrar
tales discapacidades conductuales por others14,15. Por lo tanto, CCI se utiliza comnmente
para investigar tanto la fisiopatologa y el potencial teraputico
agentes para el tratamiento del dolor neuroptico.
Se describe la constriccin unilateral del nervio citico izquierdo, sin embargo debe tenerse en
cuenta que muchos experimentadores han realizado en el CCI
nervio citico derecho, con dolor similar y los resultados conductuales. Algunos investigadores
pueden encontrar ms fcil realizar la ciruga en un lado especfico debido
al uso de las manos, mientras que otros han cambiado de bando en experimentos para
descartar cualquier sesgo. Es de destacar que varias variaciones al original
procedimiento se ha informado incluyendo el uso de slo 2 ligaduras alrededor de la
nerve16,17 y usando material de sutura catgut crmico distinto tales como
catgut simple y poliglactina (Vicryl) 18,19 en las ratas. Adems, el modelo de CCI tambin ha
sido modificado para su uso en ratones, donde el procedimiento es idntico,
excepto por el uso de ligaduras 2-3 con diversos materiales de sutura incluyendo catgut
crmico, nylon, y prolene15,20,21.
Una limitacin de este modelo es el grado de variacin entre las ratas sometidas a CCI, debido
a la variabilidad en la estanqueidad de las constricciones
producido por atar nudos con las suturas. Esto puede ser parcialmente superada por tener un
investigador experimentado que realiza la ciruga en un
de manera coherente. Adems, el tipo de material de sutura utilizado para ligar el nervio
tambin puede contribuir a la variabilidad, y se cree que
productos qumicos desde el intestino crmico mediar algunos de los efectos conductuales y
neuroqumicos observados en este model19,22. consideracin especialse debe dar a la
eleccin del gnero de rata (hombres versus mujeres) 23, la edad (jvenes contra viejos)
24,25, diet26 y strain27, que puede significativamente
influir en el desarrollo de hipersensibilidad dolor despus de CCI.
Pruebas de hipersensibilidad dolor, utilizando un aesthesiometer von Frey electrnico o
manual pelos de von Frey para el umbral de retirada mecnica
y una analgesia plantar (Hargreaves) metros para la retirada de latencia trmica, son medidas
cuantitativas fiables de dolor bien establecido y
hipersensibilidad en animales pequeos. Su uso, en combinacin con modelos de dolor
neuroptico, estn muy extendidas y permitir comparaciones directas de
pata sensibilidad a estmulos mecnicos y trmicos a travs de diferentes opciones de
tratamiento, y entre diferentes cepas de ratas. Cabe sealar que
otros ensayos de comportamiento, tales como la prueba de pinchazo y alodinia fra, tambin
se utilizan para probar inducida por CCI hypersensitivity8 dolor.
Aunque el uso de retirada reflexiva de los estmulos mecnicos o trmicos es la principal
medida de dolor neuroptico en este modelo y otros, tiene
recientemente ha sido criticada por su escasa correlacin con los sntomas humanos y la
participacin de considerable bias28 experimentador. Por lo tanto, la
uso de paradigmas adicionales, tales como medidas de pain29 operantes y behaviours30
espontneamente emitida sera beneficioso.
Sin embargo, a pesar de estas limitaciones, el modelo de CCI y las pruebas de retirada de la
pata de medicin de hipersensibilidad dolor son fundamentales para
la comprensin de los mecanismos del dolor neuroptico y la identificacin de nuevos
objetivos analgsicas. En nuestro laboratorio, realizamos rutinariamente CCI y
medir los umbrales de retirada de la pata mecnicas y trmicas latencias de retirada de la pata,
a fin de comprender cmo las interacciones neuro-inmune
contribuir a pain31 neuroptico, y evaluar el potencial de modular el sistema inmune para
reducir la hipersensibilidad dolor.