Metodologa experimental

Preparacin de solucin de cultivo: Se prepara 1 litro de medio de cultivo 9K suplementado con

FeSO
4
(sulfato de hierro). Para la preparacin del medio 9K se disuelven en orden 0,4 g de
(NH
4
)2SO
4
(sulfato de amonio), 0,1 g K
2
HPO
4
(Fosfato monocido de potasio) y 0,4 g MgSO
4
(sulfato de magnesio) en un matraz con 500ml de agua destilada y se disuelven 33 g de FeSO
4
en
este medio. Cada sal se disuelve utilizando el matraz con barra magntica en el agitador
magntico, luego se afora hasta 1L en una Probeta de 1L.
Posteriormente se utilizan dos condiciones, en la primera se agregan 500ml del medio a un matraz
NO estril a y se ajusta el medio a un pH muy cido (pH 1,6) con acido sulfrico al 30% utilizando
un pH metro. En la segunda condicin se agregan los 500ml restantes del medio a un matraz
estril sin ajustar el pH del medio (pH 3,16).

Esterilizacin del medio de cultivo: Se realiza una filtracin al medio 9K suplementado de cada
matraz (estril y no estril) a travs de una matriz de poros de un tamao determinado (0,2m)
que permita la remocin de partculas suspendidas correspondientes a clulas contaminantes en
la solucin. Inicialmente se ensambla el matraz Kitasato junto al embudo Buchner y se conectan a
una bomba de vaco. Luego se posiciona el filtro sobre el embudo Buchner y ambientar con un
poco de medio de cultivo. Finalmente se inicia la filtracin activando la bomba de vacio sin superar
los 200 psi.
Esto se realiza debido a que la elevada concentracin de hierro en el medio dificulta el proceso de
esterilizacin del medio mediante autoclavado, en el cual se tendra precipitacin de este metal.

Inoculacin e incubacin del cultivo: Luego del proceso de filtracin del medio se procede a
inocular con .
Y se incuba en el shake a una temperaura a agitacin constante en condiciones aerobias.

Monitoreo de la fermentacin: Para monitorear la acidificacin del cultivo y aumento de biomasa
en la fermentacin, se distribuy la toma de muestra en 6 periodos. El tiempo 0 (t0) se toma
inmediatamente despus de la inoculacin (pi), el t1 se toma 26hrs pi, el t2 se toma 48,25hrs pi, el
t3 se toma 120,25hrs pi, el t4 se toma 143,25hrs pi, el t5 se toma 166,25hrs pi.
Para el muestreo se tom 10 ml de cada matraz estril sin ajuste de pH al medio (ME) y no estril
con ajuste de pH al medio (MNE) y se agregaron a tubos Falcon previamente tabulados (ME y
MNE).
Para monitorear la acidificacin del cultivo, se mide pH a cada muestra (a los 10 ml del ME y MNE)
utilizando papel pH.
Para monitorear el aumento de la biomasa se tom 1,5ml de los 10ml de muestra (de cada ME y
MNE) y se agregaron a un tubo eppendorf tabulado para cada condicin (ME/MNE), para ser
utilizarlos como blanco. Luego los tubos eppendorf se centrifugaron a 8000rpm por 10min en la
minicentrifuga y los 8,5ml restantes que se encuentran en tubos Falcon se le da un spin de 10
segundos a 2500rpm. Finalmente, se sacan tres muestras de cada tubo Falcon y se mide
absorbancia a 600nm en el espectrofotmetro contra su blanco correspondiente.

Anlisis de datos: Los datos obtenidos, luego del procedimiento descrito anteriormente, se
examinan mediante el uso de curvas de calibracin y mtodos matemticos, para luego discutirlos.


Metodologa Analtica

Determinacin de la biomasa mediante peso seco y turbidimetra: A partir de los cultivos agotados
de cada matraz (ME y MNE) se realizaron diluciones 1:1, en un volumen total de 15 ml, donde se
agregaron 7,5 de cultivo y 7,5 de agua, 1:3 donde se agregaron 5 de cultivo y y 10 de agua, y 1:5
donde agregamos 3 de cultivo y 12 de agua. Esto se hizo tanto para el cultivo con el pH ajustado y
sin ajustar pH. De estas diluciones se sacaron 1,5ml para el blanco que se centrifug por 10min a
8000rpm y el resto se centrifug por 10seg a 2000rpm, al igual que en el procedimiento de
monitoreo. Posteriormente se midi absorbancia a 600nm para cada dilucin por triplicado para
cada matraz.

Tambin se realizaron las mismas diluciones pero en un volumen de 30ml, por lo tanto se
duplicaron los volmenes anteriores, para cada matraz (ME y MNE). Estos volmenes fueron
utilizados para el peso seco, donde se tomaron 10ml y se pusieron en papeles aluminio masados
anteriormente, para hacer las muestras por triplicado, tambin para cada matraz y cada dilucin.
Todo esto para hacer la curva de calibracin de absorbancia vs concentracin para cada matraz
(ME y MNE).

Finalmente la ecuacin de la recta obtenida permiti interpolar un valor de absorbancia de una
muestra para obtener su masa.