Estudio de polifenoles, taninos y mtodos qumicos para determinar
la actividad antioxidante de la semilla de Sacha Inchi (Plukenetia volubilis L) Ana Mara Muoz Juregui 1 , Carlos Alvarado-Ortz 1 , Fernando Ramos Escudero 2 , Benjamn Castaeda Castaeda 3 , Edy Barnett Mendoza 4 , Luis Crdenas Lucero 4 , Jaime Yez Farfn 5 , Delia Cajalen Asencios 6 , Christian Encina Zelada 7 RESUMEN Sacha inchi, es una euphorbiaceae conocida como man del Inca. Se encuentra distribuida en el Per, en San Martn, Hunuco, Amazonas, Madre de Dios y Loreto. Objetivo: Determinar la actividad de los compuestos fenlicos de las semillas de sacha inchi y su rol en el color, conservacin, sabor de los alimentos y bebidas. Material y Mtodos: El presente estudio se realiz con semillas de sacha inchi colectadas en Tarapoto por el Instituto Nacional de Investigacin y Extensin Agraria (INIA). En el Centro de Bioqumica y Nutricin de la Facultad de Medicina Humana de la USMP. La determinacin de polifenoles totales segn Aparicio et al. (1999), taninos totales descrito por Price y Butler (1977) y actividad antioxidante mediante el mtodo ORAC descrito por Prior y Cao (2000). Adems de la capacidad inhibicin de perxido de hidrgeno segn Wettasinghe y Shahidi (1999).y su poder reductor segn Srivastava et al. (2006). Se trabaj con el aceite y la torta, obtenindose de cada muestra extractos hidroflicos y lipoflicos. Resultados: se encontr mayor contenido de polifenoles totales, taninos totales, mayor poder reductor, mayor capacidad de inhibir perxido de hidrgeno y mayor capacidad antioxidante en el extracto hidroflico de la torta. Conclusiones: el extracto hidroflico de la torta de sacha inchi mostr mayor contenido de polifenoles totales y taninos con accin antioxidante. (Horiz Med 2013; 13(1): 11-18) Palabras clave: Polifenoles totales, antioxidantes y sacha inchi (fuente: DeCS BIREME) Study of Polyphenols, Tannins and Chemical Methods to determine Antioxidant Activity in Seeds of Sacha Inchi (Plukenetia volubilis L) ABSTRACT Sacha Inchi is a euphorbiaceae known as the Inca peanut that is found in Peru in San Martin, Hunuco, Amazonas, Loreto and Madre de Dios. Objective: To determine the activity of the phenolic compounds of sacha inchi seeds and its role in the color, durability, taste of food and drink. Material and Methods: This study was performed with sacha inchi seeds collected in Tarapoto by the National Institute of Agricultural Research and Extension (INIA) in the Center of Biochemistry and Nutrition, Faculty of Human Medicine USMP. The determination of total polyphenols was performed according to Aparicio et al. (1999), total tannins as described by Price and Butler (1977) and antioxidant activity by the ORAC method described by Prior and Cao (2000). Also, the ability to inhibit hydrogen peroxide according Wettasinghe and Shahidi (1999) and their reducing power by Srivastava et al. (2006). We worked with the oil and cake obtained of each sample obtaining hydrophilic and lipophilic extracts. Results: We found higher total polyphenol content, total tannins, higher reducing power, greater ability to inhibit hydrogen peroxide and increased antioxidant capacity in the hydrophilic extract of cake. Conclusions: cake hydrophilic extract of sacha inchi showed higher content of total polyphenols and tannins with antioxidant action. (Horiz Med 2013; 13(1): 11-18) Key words: Total polyphenols, antioxidants and Sacha Inchi (source: MeSH NLM) Investigador del Centro de Bioqumica y Nutricin. FMH-USMP 2 Doctorando Universidad de Sevilla- Espaa 3 Director del Instituto de Investigacin FMH-USMP 4 Docente del la Facultad de Ingeniera y Arquitectura de la USMP 5 Departament of Drug Metabolism and pharmacokinetics, Merck & Co., Inc. Merck Reserch Laboratories, Kenilworth, NJ 07033, USA. 6 Docente de la Facultad de Bromatologia y Nutricin, Universidad Faustino Snchez Carrin, Huacho, Per 7 Docente auxiliar de la Facultad Industrias Alimentarias UNA La Molina, Lima, Per REVISTA HORIZONTE MEDICO.indd 11 02/04/2013 1:03:23:p 12 Horiz Med 2013; 13 (1) INTRODUCCIN El sacha inchi (Plukenetia volbilis L.) se encuentra en nuestro pas en estado silvestre en diversos lugares de San Martn, Ucayali, Hunuco, Amazonas, Madre de Dios y Loreto. El presente informe evala la presencia de compuestos fenlicos, taninos y actividad antioxidante de la semilla de sacha inchi (1). La importancia de los compuestos fenlicos por sus propiedades adems de antioxidantes y por sus atributos sensoriales que brindan a los alimentos, como el sabor ya que algunos compuestos le dan amargor como el hidroxitirosol, la astringencia de los taninos; el color, algunos amarillentos y otros pardos, y la importancia que tiene por brindar estabilidad por la resistencia a la oxidacin lipdica (2) Asimismo son excelentes conservadores naturales, brindando estabilidad al alimento, desplazando a otros conservadores sintticos. La primera mencion cientica del Sacha nchi fue hecha en 1980 a consecuencia de los anlisis de contenido graso y proteico realizados por la Universidad de Cornell en USA, los que demostraron que las semillas del Sacha Inchi tienen alto contenido de protenas (33%) y aceite (49%)(3). En Per, Agroindustrias Amaznicas ha seleccionado variedades hasta con 54% de aceite; la protena presenta un importante contenido de aminocidos esenciales y no esenciales; adems es rico en vitaminas A y E(4). El IMET de EsSalud,determin carotenos (< 10 ppm), fenoles (0.96 mg/100g) y estanoles libres (<0.5 mg/g) en el aceite de sacha inchi extrado de semillas de la Regin Loreto (5). La proyeccin en cuanto su aplicacin en la industria alimentaria, cosmtica y farmacutica en el mundo esta en aumento, por tanto, evaluar sus propiedades antioxidantes y la presencia de polifenoles, permitir abrir nuevos mercados (6). El objetivo del presente trabajo en su primera parte ser determinar el contenido de polifenoles totales, taninos totales y actividad antioxidante segn el mtodo ORAC as como su poder reductor y capacidad de inhibir al perxido de hidrgeno de la semilla de sacha inchi. MATERIAL Y MTODOS Recoleccin de la muestra La muestra fue obtenida por el personal de la Sub- direccin de Recursos Genticos y Biotecnologa, del Instituto Nacional de Innovacin Agraria (INIA) en la Estacin Experimental Agraria El Porvenir- Tarapoto. Figura 1. Figura 1. Plantaciones de Plukenetia volbilis L: sacha inchi, en la zona experimental de INIA- Tarapoto. Preparacin de la muestra Antes de la extraccin del aceite de las semillas de sacha inchi, se procedi a separar la almendra de la cscara. Se utiliz un martillo y se separ manualmente, almacenndose en bolsas de plstico de grado alimenticio (ziploc) y mantenidas en refrigeracin. La extraccin del aceite de las almendras se llev a cabo por el prensado en fro. Las presiones a la que se utiliz en la extraccin fueron de 300 700 PSIA por espacio de 5 minutos, a la presin o temperatura ambiente. Las extracciones se llevaron a cabo con muestras de 90 gramos. Las muestras fueron colocadas en cilindro extractor de acero inoxidable, sometindose lentamente hasta llegar a las presiones establecidas, manteniendo la palanca de activacin a presin constante por espacio de 5 minutos, controlndose esto con un cronometro. Ana Mara Muoz Juregui, Carlos Alvarado-Ortz, Fernando Ramos Escudero, Benjamn Castaeda Castaeda, Edy Barnett Mendoza, Luis Crdenas Lucero, Jaime Yez Farfn, Delia Cajalen Asencios, Christian Encina Zelada : 11-18 REVISTA HORIZONTE MEDICO.indd 12 02/04/2013 1:03:24:p Enero - Marzo 2013 13 Terminado el proceso de extraccin, la torta residual obtenida luego del prensado, fue secada a 45 C durante 2 horas. Luego fue envasada y sellada en bolsas plsticas de grado alimenticio (ziploc) y se mantuvieron en refrigeracin. Polifenoles totales El contenido de polifenoles totales fue previamente acondicionado al mtodo descrito por Aparicio et al. (1999) (7), se us cido galico como estndar. Se tomo 500 L de cada fase y se adicion 900 L de folin-ciocalteau (F-C), la mezcla se coloc en vortex durante 5 minutos, despus de este tiempo se adicion 900 L de molibdato de sodio al 5 % en metanol al 60 %. La reaccin fue desarrollada durante 2 horas en oscuridad con agitacin constante (Glin et al., 2003) (8). La absorbancia fue medida a 725 nm. Taninos Se determin mediante el mtodo propuesto por Price y Butler (1977) (9). Una alcuota de 200 L de cada fase (lipoflica e hidroflica), se adicionaron 600 L de FeCl3 a 0.1 M en 0.1 N de HCl, luego se dej reaccionar por 5 minutos, despus de este tiempo se adicion 600 L de K3Fe(CN)6 a 0.008 M, se dej reposar por 10 minutos para el desarrollo del color, las lecturas se tomaron a 720 nm. Los resultados fueron expresados en mg catequina equivalente por kg de muestra. Actividad antioxidante A. Ensayo ORAC Este mtodo se usa para medir la actividad antioxidante indicando la capacidad de absorbancia de radicales de oxigeno. El fundamento del mtodo es el descenso de la emision de uorescencia que sufre la cobiliproteina P o 8Ficoetrina de Porphiridium cruentum a causa del dao qumico que afecta a su conformacin e integridad qumica provocado por especies reactivos (Prior y Cao, 2000) (10). La especie que se emple en el presente estudio fue la ABAP (2,2`-azobis(2-amidino-propane) dihydrochloride), generadora de radicales peroxilos, ya que estos son ms importantes tanto a nivel siologico como patologico. En la bibliografia se ha descrito otros tipos de especies reactivas (Prior y Cao, 2000), Cu 2+ -ascorbato (Glazer, 1990) y Cu 2+ - H2O2 para producir radicales hidroxilos; tambin Cu 2+ como oxidante, pero estos otros radicales estn menos relacionados con la situacion siologica. El AAPH sufre descomposicin espontnea y produce radicales peroxilos con un rango determinado primariamente por la temperatura. Para determinar la actividad antioxidante de una muestra es preciso hacer referencia a un antioxidante estndar; el antioxidante de uso mas generalizado es el TROLOX. La inhibicin de las especies reactivas por un compuesto antioxidante se reeja en la proteccin frente a Ia prdida de Ia uorescencia de Ia coeritrina. Esta proteccin resulta ser una medida de la capacidad antioxidante de dicho compuesto y se puede cuanticar mediante dos parmetros (Prior y Cao, 1999): - El tiempo que el antioxidante protege la coeritrina de sufrir el dao oxidativo. - El de la inhibicion a diferentes tiempos. a. Preparacin de los reactivos (Cao y Prior, 1999) - 8uffer Fosfato P8S (75 mV, pH 7) Se prepara una disolucin de K2HPO4, 0.75 M y una de NaH2PO4, 0.75 M. Se mezclan en la proporcin K2HPO4/NaH2PO4, 61.6/31.9 (v/v) y se diluye con agua desionizada. El pH de esta disolucin buffer debe ser 7, lo cual debe constar usando un pHmetro. - Ficoeritrina (68 mg/L) Se prepara una disolucin madre (170 mg/L) disolviendo 1 mg de coeritrina en 5.90 mL de P8S. La disolucin de trabajo se obtiene con buffer la solucin madre. - A8AP (160 mV) Se pesan 434 mg de ABAP y se disuelven en 10 mL de PBS. - TP0L0X (20 mol/L) Se prepara una disolucin madre disolviendo 5.0 mg de Trolox en 200 mL de PBS, la solucin de trabajo Estudio de polifenoles, taninos y mtodos qumicos para determinar la actividad antioxidante de la semilla de Sacha Inchi (Plukenetia volubilis L) REVISTA HORIZONTE MEDICO.indd 13 02/04/2013 1:03:24:p 14 Horiz Med 2013; 13 (1) se obtiene diluyendo la primera con PBS (1/4 v/v) b. Descripcin del mtodo El ensayo ORAC se lleva a cabo microcubetas uorimtricas. La reaccin ensayada en la siguiente: 150 L de muestra + 150 L de coeritrina (68 mg/ mL) + 75 L ABAP (160 mM) Se prepara tambin un blanco y un estndar (TROLOX) nmediatamente se mide la uorescencia (exitacion 540 nm, emisin 565 nm), cada 5 minutos durante 60 minutos, hasta que descienda aproximadamente a 0 o a menos de un 5 % del valor inicial. Se us un espectrouorometro PF1501 Shimadzu, con interfase a PC, fuente de luz lmpara de Xenn, los ltros de uorescencia con una longitud de excitacin de 540 nm y una longitud de emisin de emisin 565 nm. El valor ORAC se obtiene calculando la diferencia de reas bajo la curva de descenso de uorescencia de 8coeritrina a lo largo del tiempo entre el blanco y una muestra. Los resultados nales se expresan usando equivalentes en trolox. c. Clculos de los resultados Los resultados fueron expresados como valor 0PAC. La cuanticacion del rea bajo la curva (AUC) de emision de uorescencia, recogiendo simultneamente la informacin de intensidad y tiempo. A diferencia de otros mtodos que se emplean en la medida de la capacidad antioxidante. Se obtiene calculando la diferencia de reas bajo las curvas de descenso de uorescencia de coeritrina a lo largo del tiempo entre blanco y una muestra. B. Ensayo de Perxido de hidrogeno La extraccin del aceite como de la torta en fase hidroflica, fue disuelta en 3.4 mL de agua destilada y mezclada con 600 L de 43 mM solucin de perxido de hidrogeno (Wettasinghe y Shahidi, 1999) (11). La reaccin fue incubada a 37 C y despus de 40 minutos se registraron las absorbancias a 230 nm, se utiliz como estndar de referencia, catequina a 200 ppm. C. Ensayo de poder reductor El poder reductor de los extractos fue medido por incubacin de la reaccin a 50 C por 20 min., que contena KH2PO4 (0.2 mol/L, pH 6.6), ferrocianuro de potasio (1 g/100 mL en agua). La reaccin fue terminada por la adicin de TCA (10 g/100 mL en agua), luego fue centrifugada a 3000 rpm durante 10 min y el sobrenadante fue mezclado con cloruro frrico (0.1 g/100 mL en agua), la absorbancia fue medida a 700 nm (Srivastava et al., 2006) (12). El incremento de la concentracin en mg CE/kg indico el poder reductor. Anlisis estadstico mediante T tests (LSD) para variables. El anlisis de varianza (ANOVA) fue desarrollado mediante un diseo completamente randomizado y se utiliz la prueba de T tests (LSD) para variables, los datos fueron procesados por un Sistema de Anlisis Estadstico (SAS statistic analysis system), el nivel de signicancia establecido fue p < 0.01. RESULTADOS Polifenoles totales El contenido de polifenoles totales tanto en aceite y torta, en fase hidroflico y lipoflica se muestra en la Tabla 1, donde se aprecia mayor contenido en el extracto hidroflico de la torta. Condicin Fase Muestra Contenido (mg GAE/kg) CV (%) l|droli||co Ve0l:aua (0:10) Torla Z.1 0.12a 0.1Z L|poli||co lexaro Ace|le 15.50 0.3o 2.32 L|poli||co lexaro Torla 12.83 0.0c 1. l|droli||co Ve0l:aua (0:10) Ace|le 2.Z9 0.11d 1.99 AUC =(0.5 + 5/ 0 + 10/ 0 + 15/ 0 ++ 55/ 0 + 60/ 0) * CT Donde: j0 = es la uorescencia inicial en el ciclo zero. j60 = es la uorescencia en el ultimo tiempo CT = es el tiempo del ciclo a los 5 minutos AUC = se obtiene de la sustraccin del AUC del blanco de los datos de la muestra Tabla 1. Contenido de polifenoles totales en aceite y torta de sacha inchi Ana Mara Muoz Juregui, Carlos Alvarado-Ortz, Fernando Ramos Escudero, Benjamn Castaeda Castaeda, Edy Barnett Mendoza, Luis Crdenas Lucero, Jaime Yez Farfn, Delia Cajalen Asencios, Christian Encina Zelada : 11-18 REVISTA HORIZONTE MEDICO.indd 14 02/04/2013 1:03:24:p Enero - Marzo 2013 15 Color Contenido Terico Estimacin Espectrofotomtrica Aos (Z20 rr) EAL EAl ETL ETl Azu| |rlerso A|lo 0.Z1 - 3.2 Azu| A|lo 0.0 - 0.Z0 x Turquesa Voderadarerle a|lo 0.50 - 0.59 verde oscuro Voderadarerle 0.10 - 0.19 verde lrlerred|o 0.15 - 0.39 x verde ||rr 8ajo 0.01 - 0.11 x x Condicin Fase Muestra Contenido (mg GAE/kg) CV (%) l|droli||co Ve0l:aua (0:10) Torla 1Z.23 0.01a 0.09 L|poli||co lexaro Ace|le 9.38 0.01o 0.1 l|droli||co Ve0l:aua (0:10) Ace|le .18 0.03c 0.51 L|poli||co lexaro Torla 1.99 0.03d 0.3 Tabla 2. Contenido de taninos en aceite y torta de sacha inchi Tabla 4. Actividad antioxidante ORAC Tabla 3. Aspecto visual y espectrofotomtrico del contenido de taninos Letras (a - d), indican diferencia signicativa a p<0.01, la media corresponde a 3 replicas. Los datos fueron calculados a partir de una curva de estndar de cido galico (y = 0,0196x - 0,0211, R2 = 0.9996) Taninos En la Tabla 2, se muestra el contenido de taninos tanto del aceite como de la torta, en fase hidroflica y lipoflica. Mientras los resultados de la Tabla N 3, indican los aspectos visuales y espectrofotomtricos de las reacciones, siendo el extracto hidroflico de la torta el que presenta un color azul alto. Letras (a - d), indican diferencia signicativa a p<0.01, la media corresponde a 3 replicas. Los datos fueron calculados a partir de una curva de estndar de catequina (y = 0,0485x - 0,0053, R2 = 0,9996) EAL = extraccin aceite lipoflico; EAH = extraccin aceite hidroflico; ETL = extraccin torta lipoflico; ETH = extraccin torta hidroflico. Actividad antioxidante A. Ensayo ORAC El mtodo antioxidante ORAC muestra que el extracto hidroflico de la torta presenta mayor actividad antioxidante como lo muestra la Tabla 4 y la Figura 2. Estudio de polifenoles, taninos y mtodos qumicos para determinar la actividad antioxidante de la semilla de Sacha Inchi (Plukenetia volubilis L) REVISTA HORIZONTE MEDICO.indd 15 02/04/2013 1:03:24:p 16 Horiz Med 2013; 13 (1) CONCENTRACION C0N0lCl0N A830R8ANClA3 l202(rV) PR0V 30 l202 0,20 0,258 0,20 ,150 ,150 ,150 ,15 0,00 Calequ|ra l202 0,028 0,02 0,02Z 0,95 0,50 0,Z0 0,Z 0,02 Ace|le l202 0,132 0,131 0,133 3,2Z5 3,350 3,299 3,31 0,01 Torla l202 0,083 0,082 0,083 2,059 2,050 2,059 2,0 0,01 B. Ensayo de perxido de hidrgeno Los ensayos de capacidad de inhibicin de perxido de hidrgeno demostraron el extracto hidroflico de la torta que presenta mayor capacidad inhibitoria (ver tabla 6). Datos fueron expresados en mM de concentracin de perxido de hidrgeno C. Ensayo de poder reductor Expresa la capacidad de reducir el frrico a ferroso. Los resultados mostraron mayor poder reductor al extracto hidroflico de la torta (ver tabla 7). VuE3TRA r CE/| PR0V 30 ACElTE_LlP 1,083 0,883 0,82 0,883 0,200 ACElTE_ll0 1,85 1,88 1,185 1,85 0,200 T0RTA_LlP N0 N0 N0 T0RTA_ll0 28,9Z2 29,3Z3 28,ZZ1 29,038 0,305 Expresadas en funcin de catequina estndar. DISCUSIN El contenido de polifenoles que presenta el extracto hidroflico de la torta es mayor en forma signicativa en relacion con los otros extractos de sacha inchi evaluados. Segn estudios realizados en aceite de oliva, la concentracin de polifenoles es de 433 a 195 mg GE/kg (13) y vara segn el tipo de cepa, el grado de maduracin y otros factores externos como condiciones agronmicas, climticas, altura y tipo de cepa, procesamiento entre otros factores (14). El contenido de taninos es mayor en el extracto hidroflico de la torta, esto se explica por la estructura qumica de los taninos que tienen anidad por los solventes polares. Ana Mara Muoz Juregui, Carlos Alvarado-Ortz, Fernando Ramos Escudero, Benjamn Castaeda Castaeda, Edy Barnett Mendoza, Luis Crdenas Lucero, Jaime Yez Farfn, Delia Cajalen Asencios, Christian Encina Zelada Figura 2. Cintica de descenso de uorescencia de la 8coeritrina Tabla 5. Capacidad antioxidante de extracto hidrofli- co de aceite y torta de sacha inchi. Tabla 7. Poder reductor de semilla de sacha inchi Tabla 6. Ensayo perxido de hidrgeno Datos expresados como promedio +/- SD de 2 observaciones por muestra. Este ensayo se realiz en ausencia y presencia de un extracto hidroflico (MeOH:agua [60:40 v/v]) del aceite y semilla de sacha inchi , mostrando mayor capacidad antioxidante el extracto hidroflico de la torta (ver Tabla 5). Condicin Fase Muestra Valor ORACFe (mol TE/kg) CV (%) l|droli||co Ve0l:aua (0:10) Torla 1Z0.1 /- 0.02 0.01 l|droli||co Ve0l:aua (0:10) Ace|le Z.51 /- 0.08 1.11 : 11-18 REVISTA HORIZONTE MEDICO.indd 16 02/04/2013 1:03:24:p Enero - Marzo 2013 17 La actividad antioxidante de los polifenoles depende del nmero y la localizacin de los grupos hidroxilo que contiene en su estructura. Adems de su actividad antioxidante, se han atribuido otras propiedades biolgicas a los compuestos fenlicos: inhiben la agregacin plaquetaria y ejercen como agentes vaso relajantes, antiinamatorios y anticancergenos (15). El mtodo antioxidante ORAC muestra que el extracto hidroflico de la torta presenta mayor actividad antioxidante. Asimismo coincide con su poder reductor de perxido de hidrgeno y capacidad quelante, existiendo coherencia entre los resultados obtenidos aplicando los diferentes mtodos mencionados. Debemos resaltar que el mtodo ORAC utiliza un tipo de especie oxidante presente en el organismo como son los radicales peroxilo, ya que el empleo de radicales peroxilo hidroxilo en ensayos como ORAC, TRAP, TOSC, 0CFH0A les aade un mayor signicado biologico, ya que estas ROS son las ms importantes a nivel siologico (15). Existe una relacin directa entre el contenido total de polifenoles y su capacidad antioxidante en los extractos evaluados de la semilla de sacha inchi ya que el extracto hidroflico de la torta es la que presenta mayor contenido de polifenoles totales y mayor actividad antioxidante. En conclusin, el extracto hidroflico de la torta de sacha inchi muestra mayor contenido de polifenoles totales y taninos con accin antioxidante. El extracto hidroflico de la torta present mayor actividad antioxidante (segn el mtodo ORAC) y mayor inhibicin de peroxido de hidrgeno con mayor poder reductor. AGRADECIMIENTOS Agradecemos al Presidente de CONCYTEC, Dr. Augusto Mellado Mndez; a la USMP y al Decano de la Facultad de Medicina Humana Dr. Frank Lizaraso Capar por haber hecho posible la realizacin de esta investigacin. Fuentes de nancamento Este trabajo fue nanciado por C0NCYTEC y la USMP. Conctos de nters Los autores declaran no tener conictos de inters. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Valles, C. Sacha inchi, importante oleaginosa selvtica. Pura selva. p.40- 41. 2. Oliveras M. Calidad del aceite de Oliva virgen extra antioxidantes y funcin biolgica. Universidad de Granada. 3. Hazen y Stoewesand. Resultados de anlisis del aceite y protena del cultivo de sacha inchi. Universidad de Cornell. USA. 1980 4. Proyecto OMEGA. El Inca Inchi. Agroindustrias Amaznicas. Lima Per. 2002. p.6. 5. Instituto de Medicina Tradicional-IMET. POS Pilot Plant Corp. Canada. Bioprocessingsolutions: Analytical report to carotenes prole, stanols (free), total phenols. 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