Biotecnologia de Enzimas Inmovilizadas

Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnologa
Biotecnologa de enzimas: Inmovilizacin
Sergio Huerta Ochoa
UAM-Iztapalapa
Catlisis enzimtica heterognea
Para combinar las ventajas de la catlisis homognea y heterognea,
se desarroll la heterogenizacin de la catlisis homognea
Las enzimas inmovilizadas son enzimas fsicamente confinadas o
localizadas en una cierta regin definida de espacio con la localizadas en una cierta regin definida de espacio con la
retencin de sus actividades catalticas, que pueden ser usadas
repetidamente y continuamente
Los mtodos ms comunes de inmovilizacin de enzimas
Heterogenizacin de enzimas solubles a travs del acoplamiento de
un soporte insoluble mediante: adsorcin o enlace covalente, por
entrecruzamiento de la enzima o por atrapamiento en un enrejado o
en microcpsulas
Enzima Soporte
Propiedades bioqumicas Caractersticas qumicas
Las propiedades de las enzimas inmovilizadas estn gobernadas
por las interacciones de las propiedades de la enzima y el material
del soporte
Mtodo de inmovilizacin
Rendimiento (%)
Propiedades bioqumicas Caractersticas qumicas
Tipo de reaccin y cintica Propiedades mecnicas
Efectos de transferencia de masa
Eficiencia ()
Comportamiento
Consumo de enzima (U/kg producto)
Productividad (kg producto/U)
Estabilidad operacional
# de ciclos
Inmovilizacin de enzimas
Costo de la enzima
Grado de purificacin requerido de la enzima
Costo del proceso de inmovilizacin
Estabilidad de la enzima
Efectos de inhibicin y envenenamiento
Pros y contras de la Inmovilizacin
PROS
Alta estabilidad y resistencia al
esfuerzo cortante y a la
contaminacin
COTRAS
Existencia de la resistencia a la
transferencia de masa
contaminacin
Fcil de desarrollar procesos
continuos
Rpidas tasas de reaccin
Fcil separacin de los productos
Uso repetitivo del catalizador
Necesidad del proceso de
inmovilizacin
Costos adicionales de reactivos
para la inmovilizacin
Prdida de actividad durante la
etapa de inmovilizacin
Inmovilizacin de enzimas
La inmovilizacin es la restriccin espacial de la movilidad de la enzima
Mtodos de inmovilizacin
A: Mtodos de enlace a
soportes
a) Enlace covalente;
b) Adsorpcin fsica;
A
b) Adsorpcin fsica;
c) Fuerzas electrostticas
B: Entrecruzamiento
C: Atrapamiento
Enzyme in Industry: Production and Applications, pg 66.
B C
Atributos ideales de un soporte
Alta rea superficial
Permeable
Insoluble Insoluble
Alta rigidez
Regenerable
Resistente a ataque microbiano y qumico
Estable mecnicamente y trmicamente
Hidrofobicidad controlada
Mtodos de inmovilizacin claves
Unin Covalente
Glutaraldehido
CNBr-activacin
cidos cclicos (glicoproteinas)
Carbodimidas
Adsorcin
Ms comn para enzimas
Intercambio inico
Hidrofobicidad
Entrecruzamiento
Encapsulacin
Geles polimricos
Liposomas y otras bicapas
Mtodos emergentes
Avidin/streptavidin y biotin
Oligonucletidos-protein fusions
Materiales biocatalticos
Silicones/silicatos/sol-geles
Ms comn para clulas
Mtodos de inmovilizacin: Soportes
Tipos de Soporte
Inorgnicos: p.ej.
Tipos de enlace
Enlace covalente
Inorgnicos: p.ej.
Slica, Vidrio poroso
Orgnicos: p.ej.
Poliamida,
Poliacrilamida
Biolgicos: p.ej.
Celulosa, Quitosano
Enlace covalente
Adsorcin fsica
Enlace inico
Enlace Covalente
Handbook of Heterogeneous Catalysis, Vol. 1, pg. 237
El soporte en este caso es amino alkoxy silano
Enlace Covalente
Handbook of Heterogeneous Catalysis, Vol. 1, pg. 237
Adsorcin Fsica
Los biocatalizadores enlazan a los soportes por
interacciones fsicas tales como interacciones
hidrofbicas, fuerzas de van der Waals, etc. hidrofbicas, fuerzas de van der Waals, etc.
Frecuentemente se usan soportes inorgnicos.
Actualmente, estn disponibles varios materiales
naturales que tienen fuertes capacidades de adsorcin.
Unin a un soporte por adsorcin fsica
El mtodo se basa en la adorcin fsica de las molculas de
enzima en la superficie de una matriz slida, poniendo en enzima en la superficie de una matriz slida, poniendo en
contacto una solucin acuosa de enzima con el soporte.
Procedimiento esttico
Electrodeposicin
Proceso de reactor
Bao con agitacin
Mtodos de
adsorcin fsica
Mtodos de inmovilizacin : Atrapamiento
El mtodo de atrapamiento de inmovilizacin est
basado en la localizacin de una enzima dentro de un
enrejado de una matriz polimrica o membrana de tal enrejado de una matriz polimrica o membrana de tal
forma que previene la liberacin de proteina mientras
permite la penetracin de substrato.
- La enzima no se enlaza de ninguna forma a la matriz
del gel o a la membrana.
Mtodos de inmovilizacin : Entrecruzamiento
Definicin: Formacin de enlaces covalentes entre las
molculas de enzima, por medio de reactivos bi- o
multifuncionales, formando agregados entrecruzados multifuncionales, formando agregados entrecruzados
tridimensionales.
Mtodos: Adicin de una cantidad apropiada de agente
entrecruzante a una solucin de enzima bajo condiciones
que den un aumento en la formacin de enlaces covalentes
mltiples.
Mtodos de inmovilizacin: Entrecruzamiento (cont)
Handbook of Enzyme Biotechnology, pg. 585
Limitaciones difusionales en sistemas de enzimas
inmovilizadas
( )
maximum rate of reaction
maximum rate of diffusion
m s
s L b s
m s
m
Da
V S
J k S S
K S
V
k S
= =
+
= =
maximum rate of diffusion
Da
L b
k S
Da
<<1
Limitado por reaccin
Da
1
Reaccin y difusin -
resistencias comparables
Da
>>1
Limitado por difusin
Da
= mero de Damhkler
Factor de efectividad
Para reacciones donde las limitaciones pueden ser importantes, la
tasa de reaccin aparente es frecuentemente expresada en trminos
de un factor de efectividad,
reaction with diffusional limitations reaction with diffusional limitations
intrinsic reaction rate
=
Para una reaccin enzimtica que sigue la cintica de Michaelis-Menten
m s
surface
m s
V S
r
K S
=
+
Limitaciones difusionales para enzimas inmovilizadas
en pellets porosos
Perfil de concentracin en estado estacionario en pellets
porosos
Consideraciones:
Cintica de Michaelis-Menten
Enzima uniformemente distribuida a travs del pellet
No hay particin de substrato entre el interior y el exterior del pellet
Ecuaciones gobernantes:
2
2
0
2
( )
0
m
e
m
s
r
V S d S dS
D
dr r dr K S
S R S
dS
dr
=

+ =

+

=
=
Adimensionalizacin
, ,
m
s s
K S r
S r
S R S
= = = Definir variables adimensionales:
Introducir en los balances de masa y las condiciones frontera
2
2
2
0
2
1
(1) 1, 0,
m m
e
r
d S dS S
r dr S
dr
V K dS
S R
D
dr
=
+ =
+
= = =
A menos que la reaccin sea de 1
er
orden, el sistema no tiene solucin
analtica con la cintica de Michaelis-Menten
Grfica versus en el sistema Michaelis-Menten
Minimizar el radio de partcula
dentro las limitaciones
mecnicas
Diseo de pellets inmovilizados
Optimizar la carga de la
enzima
Alto contenido de enzima
incrementa la tasa intrnseca de la
reaccin pero disminuye el factor
de efectividad
Bajo contenido de enzima
incrementa el factor de
efectividad pero disminuye la tasa
intrnseca de la reaccin
Reactores enzimticos
Discontnuos (Enzimas libres e
inmovilizadas)
Tipos de
reactores
Contnuos (Enzimas inmovilizadas)
Reactores discontnuos
Tipo tanque agitado con paletas
Tipo tanque agitado con mamparas
que incluyen enzimas inmobilizadas
Tipo tanque agitado con paletas
Reactor de lecho empacado
con reciclado total
Reactor de lecho fluidizado
con reciclado total
Reactores contnuos
Tipo tanque agitado con recuperacin por ultrafiltracin
Reactor de lecho
empacado
Reactor de lecho
fluidizado
Reactor de fibra
hueca
Reactor de tanque agitado contnuo
Reactor de lecho empacado
Reactor de lecho fluidizado
Reactor de membrana
Tecnologa de enzimas comerciales
High fructose corn syrup (xylose isomerase)
L-Amino acids (amino acylase, amino acid dehydrogenases, lyases)
D-Amino acids (hydantoinase)
L-Aspartic acid (aspartase)
L-Malic acid (fumarase)
Glycidyl butyrate (lipase)
Cis-dihydrodiols (dioxygenase)
Muconic acid, chiral amines (aminotransferase)
Semisynthetic penicillins and cephalosporins (penicillin amidase)
Acrylamide (nitrile hydratase)
Phenolic resins (peroxidase)
Food applications (many)
Industrial enzyme market ca. $1.5 billion
Chiral market estimated at $5-10 billion
Discovery markets - ??? (pharma spends ca. $15B/yr)
GI es un tetrmero de 4 unidades
idnticas de cerca de 45,000 kDa
Informacin estructural
Aplicaciones industriales
Glucosa isomerasa inmovilizada
Compuesto como un dmero de
dmeros
Cada monmero est compuesto
de aproximadamente 16 hlices
alfa y 15 lminas beta
La interface monmero-
monmero es 3 veces ms
grande y fuerte que la interface
dmero-dmero
2 Mn
2+
son necesarios para la
actividad xilosa y 2 Co
2+
para la
actividad glucosa isomerasa
From Bacillus Coagulans, Isolated by
Novozyme, Inc.
La isomerizacin de glucosa a jarabes de maz de alta fructosa
(HFCS), exclusivamente como un reemplazo de costo reducido para
soluciones de sacarosa y azcar invertida soluciones de sacarosa y azcar invertida
Background:
Altas temperaturas de reaccin para altos rendimientos de fructosa
pH 7 para la actividad y estabilidad de la enzima
PERO, la glucosa y la fructosa son inestables, fcilmente se
descomponen a cidos orgnicos y subproductos coloreados
El tiempo de reaccin debe ser minimizado
Condiciones del proceso:
En reactores de lecho fijo contnuos En reactores de lecho fijo contnuos
Temperatura: 55-60
o
C
pH: ptimo pH de la enzima
Los grnulos de la enzima deben ser
suficientemente rgidos para prevenir la
compactacin durante la operacin
Mtodo de Inmovilizacin
Rendimiento
(kg producto
seco/ kg enzima)
1. La enzima, despus del aislamiento y
purificacin, es covalentemente
inmovilizada sobre un soporte inerte
20,000
2. Entrecruzamiento de clulas que
contienen las enzimas deseadas
2,000-4,000
3. La enzima parcialmente purificada es
inmovilizada sobre resinas de
intercambio inico
7,000- 10,000
Conclusiones
La inmovilizacin permite el uso repetitivo de la enzima
lo que significa un ahorro significativo en los costos lo que significa un ahorro significativo en los costos
La seleccin de los mtodos de inmovilizacin debern
estar basados en los requerimientos tcnicos especficos
y en el marco global de su aplicacin comercial

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