I.

- INTRODUCION

La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite determinar la
concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que las molculas absorben
las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende
de forma lineal de la concentracin. Para hacer este tipo de medidas se emplea un
espectrofotmetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que
pasa por una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. Asimismo es
la medida de la cantidad de energa radiante absorbida por las molculas a longitudes
de onda especficas. La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico mas usados
en las investigaciones biolgicas.
En esta prctica se darn a conocer las caractersticas generales y conceptos
relacionados con la espectrofotometra. A continuacin y tras la explicacin del
funcionamiento del espectrofotmetro se harn espectros de absorcin con el fin de
determinar la longitud de onda donde la muestra presenta la mxima absorcin, y tras
realizar las correspondientes rectas de calibrado se cuantificarn las concentraciones
de distintos volmenes utilizados. (Olave, 2007).


II.- OBJETIVOS

2.1.- Determinar la longitud de onda adecuada (longitud de onda de mxima
absorcin).
2.2.- Determinar los niveles de concentracin adecuados para el anlisis
cuantitativo por espectrofotometra.

III.- MATERIALES Y METODOS

3.1.- Muestra
Sustancia pura: azul de metileno (pH = 373.9 g/mol, segn Aldrich, 1990)

3.2.- Materiales

Matraces de 250 ml
Cubetas de plstico
Fiola de 1 L
Pipetas
Embudo
Papel tissue
Pizeta con agua destilada

3.3.- Equipos

Espectrofotmetro: Espectronic Genesis 6 Marca
Balanza analtica


3.4.- Metodologa

A) DETERMINACION DE LA LONGITUD DE ONDA MAXIMA

Para determinar la longitud de onda de mxima absorcin del azul de
metileno, se procedi de la siguiente manera:

1.- Pesar 1.7 mg de azul de metileno y diluir en 1 litro de agua destilada.
2.- Hacer un blanco con agua destilada, para fijar la densidad ptica o
absorbancia a cero.
3.- Realizar dos corridas

3.1.- PRIMERA CORRIDA: Realizar la lectura de absorbancia (A) vs.
Longitud de onda (), desde 400 hasta 750 nm de 25 nm en 25 nm.

3.2.- SEGUNDA CORRIDA: Realizar la lectura de absorbancia (A) vs.
Longitud de onda (), desde 640 hasta 680 nm de 2 nm en 2 nm.

4.- Graficar con los datos obtenidos en el espectrofotmetro
5.- Seleccionar la longitud de onda mxima.

B) DETERMINACION DEL RANGO DE CONCENTRACIONES ADECUADO HASTA
DETERMINAR LA DESVIACION DE LA LEY DE BEER.

Para determinar el rango de concentraciones adecuado para el azul de
metileno proceder de la siguiente manera:

1.- Pesar 30 mg de azul de metileno
2.- Diluir en 1 litro de agua destilada
3.- A partir de la solucin de azul de metileno de 30 mg/lt preparar
soluciones diluidas desde concentraciones de 2 mg/lt hasta 28 mg/lt
(100 ml de cada una)
4.- Medir una solucin blanco (agua destilada) y fijar a cero la absorbancia
en el espectrofotmetro.
5.- Trabajar con la longitud de onda mxima que fue hallada en el
procedimiento anterior.
6.- Realizar la lectura de la absorbancia vs. Concentraciones a ()
mx.
y
graficar.

IV.- RESULTADOS

A) DETERMINACION DE LA LONGITUD DE ONDA MAXIMA

-Se pes 1.7 mg de azul de metileno y luego se diluy en 1 litro de agua
destilada. Una vez obtenido nuestra muestra se hiso un blanco con agua
destilada, para fijar la densidad ptica o absorbancia a cero. Una vez hecho eso
se realizo dos corridas:
PRIMERA CORRIDA: Se realiz la lectura de absorbancia (A) vs. Longitud de
onda (), desde 600 hasta 700 nm.

Cuadro N01



Grafico N 01





SEGUNDA CORRIDA: Se realiz la lectura de absorbancia (A) vs. Longitud de
onda (), desde 600 hasta 700 nm.

Cuadro N 02









0.328
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0 2 4 6 8
Series1
Poly. (Series1)

Abs [ ]
600 nm
620 nm
640 nm
660 nm
670 nm
680 nm
700 nm
0.105
0.153
0.212
0.328
0.318
0.189
0.004

Abs [ ]
650 nm
660 nm
661 nm
664 nm
665 nm
666 nm
670 nm
0.278
0.328
0.332
0.337
0.339
0.336
0.317
Grafico N 02




B) DETERMINACION DEL RANGO DE CONCENTRACIONES ADECUADAS HASTA
DETERMINAR LA DESVIACION DE LA LEY DE BEER.

-Se pes 30 mg de azul de metileno, luego se diluy en 1 litro de agua destilada
a una fiola de 1 litro para luego agitarlo. Despus con una pipeta de 10 ml se
vaci 5 ml de la solucin a un matraz de 250 ml enrazndolo a 100 ml con agua
destilada. Luego se vaci 10 ml de la solucin a otro matraz enrazndolo a 100
ml con agua destilada, de ah se vaci de nuevo la solucin pero esta vez 20 ml
a otro matraz enrazndolo a 100 ml con agua destilada; y as sucesivamente se
vaci la solucin de 10 en 10 ml hasta llegar a 90 ml enrazndolo a 100 ml con
agua destilada. Y luego para nuestro blanco utilizamos el azul de metileno
concentrado.

Cuadro N 03
Solucin (ml)

Solucin
concentradas
Abs [ ]
5 ml
10 ml
20 ml
30 ml
40 ml
50 ml
60 ml
70 ml
80 ml
90 ml
100 ml
4.01 mol/L
8.02 mol/L
16.04 mol/L
24.06 mol/L
32.08 mol/L
40.10 mol/L
48.12 mol/L
56.14 mol/L
64.16 mol/L
72.18 mol/L
80.20 mol/L
-0.010
0.004
0.040
0.083
0.122
0.142
0.181
0.238
0.290
0.305
0.392


0.339
0.27
0.275
0.28
0.285
0.29
0.295
0.3
0.305
0.31
0.315
0.32
0.325
0.33
0.335
0.34
0.345
0.35
0 2 4 6 8
Series1
Poly. (Series1)
-Graficar la absorbancia vs. Concentraciones a ()
mx.


Grafico N 03




PARA LAS CONCENTRACIONES

C
1
= 30 mg = 30x10
-3
g x _1 mol = 8.02 x 10
-5
mol
L L 373.9 g L


-Para 5 ml -Para 70 ml
* V
1
x C
1
= V
2
x C
2
* V
1
x C
1
= V
2
x C
2

(5x10
-3
L)(8.02x10
-5
) = (0.1L) C
2
(70x10
-3
L)(8.02x10
-5
) = (0.1L) C
2

4.01 x 10
-6
mol = C
2
56.14 x 10
-6
mol = C
2

L L

-Para 10 ml -Para 80 ml
* V
1
x C
1
= V
2
x C
2
* V
1
x C
1
= V
2
x C
2

(10x10
-3
L)(8.02x10
-5
) = (0.1L) C
2
(80x10
-3
L)(8.02x10
-5
) = (0.1L) C
2

8.02 x 10
-6
mol = C
2
64.16 x 10
-6
mol = C
2

L L

-Para 20 ml -Para 90 ml
* V
1
x C
1
= V
2
x C
2
* V
1
x C
1
= V
2
x C
2

(20x10
-3
L)(8.02x10
-5
) = (0.1L) C
2
(90x10
-3
L)(8.02x10
-5
) = (0.1L) C
2

16.04 x 10
-6
mol = C
2
72.18 x 10
-6
mol = C
2

L L

y = 0.005x - 0.0412
R = 0.9876
-0.05
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0 20 40 60 80
-Para 30 ml -Para 100 ml
* V
1
x C
1
= V
2
x C
2
* V
1
x C
1
= V
2
x C
2

(30x10
-3
L)(8.02x10
-5
) = (0.1L) C
2
(100x10
-3
L)(8.02x10
-5
) = (0.1L) C
2

24.06 x 10
-6
mol = C
2
80.2 x 10
-6
mol = C
2

L L

-Para 40 ml
* V
1
x C
1
= V
2
x C
2

(40x10
-3
L)(8.02x10
-5
) = (0.1L) C
2

32.08 x 10
-6
mol = C
2

L

-Para 50 ml
* V
1
x C
1
= V
2
x C
2

(50x10
-3
L)(8.02x10
-5
) = (0.1L) C
2

40.1 x 10
-6
mol = C
2

L

-Para 60 ml
* V
1
x C
1
= V
2
x C
2

(60x10
-3
L)(8.02x10
-5
) = (0.1L) C
2

48.12 x 10
-6
mol = C
2

L

V.- DISCUSION

VI.- CONCLUSIONES

Se determin experimentalmente las longitudes de ondas de mximas absorcin
para las dos corridas del azul de metileno.

Se determin experimentalmente los niveles de concentracin de azul de
metileno adecuados para los anlisis cuantitativos por espectrofotometra,
hallando grficamente la ecuacin de la recta.


VII.- RECOMENDACIONES

VIII.- BIBLIOGRAFIA
http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf
http://www.metrologiaindust.com.ar/Servicios/Capacitacion/Curso2/Material/Diapositivas/5-Espectrofotometria.pdf