19-5-2014

Licenciatura en nutricin
Control sanitario de los alimentos
reporte de la prctica #8 aislamiento de Salmonella
del manual de prcticas de control sanitario



Equipo #1
Armbula Simental Edgar Miguel
Ceballos Garca Lorenzo Antonio
Gmez Carren Jos
Ziga Amaro Jos Ral
Gonzlez Vergara Rubn
Prez Sosa Jess Salvador
3er semestre Grupo A
Catedrtica: MC. Iris Lizeth Jara Herrera

Practica realizada
el 28/04/2014
fecha de entrega
en la parte
superior
izquierda.
Introduccin
La salmonelosis es una enfermedad infecciosa del hombre y los animales causada
por microorganismos de dos especies de Salmonella (Salmonella entrica y S.
bongori). Aunque fundamentalmente son bacterias intestinales, Salmonella est
muy distribuida en el ambiente y se encuentran con frecuencia en vertidos de
granjas, en las aguas residuales humanas y en cualquier material con
contaminacin fecal. En el hombre, los microorganismos del gnero Salmonella
son agentes etiolgicos de infecciones intestinales y sistmicas, por lo general,
como contaminantes secundarios de los alimentos, de origen animal y ambiental
o, frecuentemente, como consecuencia de la infeccin subclnica en animales de
abasto que provoca la contaminacin de la carne, los huevos y la leche o la
contaminacin secundaria de frutas y verduras que se han fertilizado o regado con
desechos orgnicos. La salmonelosis humana es una de las enfermedades ms
frecuentes y de mayor impacto econmico causadas por estos microorganismos.
Los agentes de Salmonella se pueden encontrar tambin en los alimentos y
originando el transporte gastrointestinal asintomtico o enfermedades infecciosas
en los animales, particularmente en aves y en cerdos. En todos los pases existe
la salmonelosis, pero parece tener una mayor prevalencia en reas de produccin
animal intensiva, especialmente de cerdos, de terneros y de algunos tipos de aves
criadas en cautividad. Varios serotipos son especficos del hospedador (ej. S.
Abortusovis en ovejas o S. Typhi en humanos) o adaptados al hospedador (como
por ejemplo S. Choleraesuis y S. Dublin). La enfermedad puede afectar a todas las
especies de animales domsticos; los ms susceptibles son los animales jvenes,
en estado de gestacin, o lactantes. La manifestacin ms comn de la
enfermedad es la entrica, pero se puede observar un espectro muy amplio de
sntomas clnicos que incluye septicemia aguda, aborto, artritis y enfermedad
respiratoria. Muchos animales, en especial los cerdos y las aves, pueden estar
infectados sin manifestar la enfermedad clnica. Son importantes como fuentes de
contaminacin alimentaria y de infeccin humana.

Objetivo:
Aislar Salmonella en carne cruda de pollo o de res proveniente de diferentes
expendios de la Cd. de Durango, Dgo.
Material de estudio:
El material de estudio que se utiliz en la prctica de aislamiento de Salmonella
misma que forma parte del programa de laboratorio de control sanitario de los
alimentos para la licenciatura en nutricin 3er semestre de la FAMEN, fue 1 Kg de
carne molida cruda, ya que la carne cruda otorga el ambiente ideal para que se
desarrolle la bacteria mencionada anteriormente y aunado a unas malas
condiciones de higiene en el trato del producto va a propiciar que esta sirva como
un buen reservorio para la Salmonella.
La muestra fue comprada en un establecimiento encargado de la venta de
productos crnicos conocido como carnicera morguea ubicado en puerto la paz
sin nmero colonia maderera, tal establecimiento presentaba a simple vista un
buen control de la limpieza tanto en las maquinas como en la zona de despacho.
La carne se encontraba en una bandeja de aluminio con aproximadamente 3KG
de carne molida dentro de un local a puerta cerrada pero sin ningn tipo de
proteccin al medio que la rodeaba.
Se compr la cantidad de 1KG de carne molida con un costo de $30.00 la carne
fue tomada de la bandeja que contena la carne molida, tomada por el vendedor
usando una bolsa de plstico la cual se encontraba cubriendo su mano, tomo el
kilogramo de carne y lo introdujo a una bolsa de plstico comn y corriente.
La muestra presentaba un buen aspecto ya que no presentaba signos de
descomposicin ni de rancidez tpica de la oxidacin de las grasas, contaba con
una buena textura y agradable aroma, con un color rojo con partes blancas
correspondientes a la grasa.
Una vez adquirido el producto se introdujo en una bolsa con cerrado hermtico y
fue trasladado inmediatamente al laboratorio propio del rea de microbiologa de la
facultad de medicina y nutricin UJED en donde se le realizaron los anlisis
correspondientes.
Cabe destacar que la toma de la muestra que fue utilizada para el examen
bacteriolgico fue recolectada tomando en cuenta las precauciones necesarias
para evitar el ingreso de microorganismos ajenos al producto.
Materiales:
Los materiales utilizados en la prctica de aislamiento de Salmonella fueron los
siguientes:
1 matraz Erlenmeyer de 500ml conteniendo 225ml de caldo tetrationato
1 matraz Erlenmeyer de 500ml conteniendo 225ml de caldo selenito cistina
2 vasos de licuadora estriles
1 esptula estril
Asa de Henle vertical
Asa de Henle
2 cajas Petri con agar sulfito de bismuto
2 cajas Petri con agar verde brillante
2 cajas Petri con agar XLD
2 cajas Petri con agar Entrico de Hektoen
2 cajas Petri con agar SS
Tubos con agar TSI
Tubos con agar LIA
Equipo utilizado:
Balanza
Autoclave
Incubadora regulada a 42 C
Incubadora regula a 35+-2C


Reactivos:
solucin con hidrxido de sodio 1N estril
solucin de cido clorhdrico 1N estril
solucin de verde brillante 0,1%
solucin yodo-yoduro
Procedimiento:
El inicio de la prctica comenz con las instrucciones otorgadas por la M.C. Iris
Lizeth Jara Herrera, una vez que fueron dadas las instrucciones correspondientes
al inicio de la sesin de laboratorio, proseguimos a realizar el esterilizado de
nuestra mesa de trabajo con el propsito de reducir lo ms posible las bacterias
presentes en nuestro entorno y con esto lograr un dato con la mayor precisin
posible en la prueba realizada, evitando la contaminacin de la muestra una vez
que ha sido sacada del empaque.
Al terminar la desinfeccin de nuestra rea de trabajo todo el equipo se lav las
manos perfectamente para utilizando una solucin llamada todo el equipo se lav
perfectamente las manos para dar inicio al examen microbiolgico.
Para aislar salmonella a partir de alimentos crudos
Al empezar la prctica encendimos los mecheros para controlar la difusin de las
bacterias indgenas del ambiente y pesamos una porcin de 25g de la muestra
(carne molida) en una bscula para inmediatamente despus colocar los 25g de la
muestra dentro de un vaso de licuadora con 225ml de caldo selenito cistina, lo
licuamos durante 2 minutos para despus vaciar la mezcla en un matraz
Erlenmeyer de 500ml estril.
La muestra se dej reposar durante un minuto. Una vez transcurrido el tiempo de
reposo se midi el pH de la muestra con papel pH para asegurarnos que contara
con un pH cercano a la neutralidad. Ya que se verifico que el pH fuera el correcto
la muestra se incubo a 42 C durante 24 horas.
Es importante mencionar que esta fue la etapa de enriquecimiento en la cual se
pretende reparar las bacterias de Salmonella que se encuentren daadas
utilizando el caldo selenito cistina ya que en el medio de cultivo la peptona aporta
los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de
carbono fermentable y el mecanismo de accin del selenito, es inhibir el
crecimiento de bacterias intestinales, coliformes y Enterococos, principalmente en
las primeras 6 a 12 horas de incubacin. Salmonella sp, Pseudomona sp, no son
inhibidos.
Aislamiento en medios de cultivo diferenciales
Despus de 24 horas de incubacin regresamos al laboratorio de microbiologa
para continuar con el anlisis microbiolgico, nuevamente antes de iniciar con la
practica todo el equipo se lav correctamente las manos y se encendi el mechero
procurando tener una distancia entre el mechero y la muestra no mayor a 30 cm.
A partir de nuestro medio de enriquecimiento procedimos a sembrar utilizando la
tcnica de estra cruzada en distintos medios de cultivo los cuales fueron:
Agar verde brillante (VB)
Agar XLD
Agar Sulfito de Bismuto
Agar SS
Agar entrico de Hektoen
Todo esto fue realizado con la finalidad de obtener colonias bien aisladas para su
identificacin y para esto los medios de cultivo se dejaron incubando durante 24
horas ms a una temperatura de 35 C.
Al trmino del tiempo de incubacin de los medios de cultivo solidos volvimos al
laboratorio de microbiologa para identificar las colonias sospechosas de
Salmonella de acuerdo a sus caractersticas tpicas de acurdo al medio de cultivo
seleccionado.
(El agar sulfito de bismuto se dej incubando por 24 horas ms)


Identificacin bioqumica
Para realizar una prueba bioqumica correctamente primero se eligieron 2 colonias
que presentaran las caractersticas tpicas de la Salmonella, mismas que tuvieron
lugar en el medio de cultivo solido agar entrico de Hektoen y a las cuales se les
realizo la tincin de Gram.
Una vez que comprobamos que se trataba de Salmonella, utilizando una asa recta
se toc levemente el centro de una colonia tpica de Salmonella y se inoculo en un
tubo con agar TSI por estra en la superficie y en otro tubo con agar LIA por
picadura en el fondo una vez realizado esto se incubo durante 24 horas a una
temperatura constante de 35C.
Tambin se inocularon tubos con caldo de urea, en medio SIM, en agar citrato de
Simmons y en caldo Malonato esto para determinar la presencia de ureasa,
motilidad e Indol con produccin de sulfuros, utilizacin del citrato como nica
fuente de carbono y la utilizacin del Malonato como fuente de carbono.
Resultados:
Tabla #1. Caractersticas bioqumicas de Salmonella y Arizona
Prueba bioqumica Salmonella Arizona
Ureasa - -
Lisina carboxilasa + +
Malonato - +
Indol - -
Lactosa - V
Movilidad + +
H2S en TSI + +
Voges Proskauer - -
Citrato de Simmons + +
Manitol + +
Glucosa (gas) + +
Morfologa colonial observada en cada medio de cultivo diferencial:
1) Agar de sulfito de bismuto: este es un medio de cultivo diferencial y
selectivo, el cual es usado para el aislamiento e identificacin de
Salmonella entrica y Typhi, entre otras bacterias entricas. Las colonias
tpicas de dicha bacteria pueden ser cafs, grises o negras; con o sin brillo
metlico, rodeadas de un halo color caf que posteriormente se torna
negro. Al analizar nuestro agar no
encontramos UFC con las caractersticas ya mencionadas si no con color
blanco casi transparente puntiforme con una elevacin plana y sin
presencia de halo de ningn tipo.
2) Agar verde brillante: Medio de enriquecimiento altamente selectivo y
diferencial para el aislamiento de enterobacterias patgenas como
Salmonella. en el medio la pluripeptona y el extracto de levadura,
constituyen la fuente de nitrgeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la
sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo fenol es el
indicador de pH, que vira a amarillo cuando hay produccin de cido a partir
de la fermentacin de azucares; el cloruro de sodio mantiene el balance
osmtico y el verde brillante acta como agente selectivo. Las colonias de
Salmonella se observan con coloracin rosa, blanca o transparente sobre
un fondo rojo y las fermentadoras de lactosa dan color amarillo, mas sin
embargo en nuestro agar VB solamente se presentaron UFC con un color
blanco lechoso, tenan una forma irregular con elevacin plana, sin
presencia de color rojo a su alrededor, con lo que llegamos a la conclusin
de que no eran UFC tpicas de la Salmonella.
3) Agar XLD: Importante medio para el aislamiento y diferenciacin de
enterobactericeas patgenas especialmente especies de Shigella y
Salmonella. la diferenciacin entre Salmonella y Shigella se da porque la
primera produce fermentacin de xilosa, descarboxilacin de lisina y genera
cido sulfhdrico. La forma de accin del medio se basa en que la degradacin
de a cido de la xilosa, lactosa y sacarosa produce un viraje del medio a
amarillo, por el indicador rojo de fenol. El tiosulfato y la sal de hierro, revelan la
formacin de cido sulfhdrico por la precipitacin de sulfuro de hierro (negro)
en las colonias. Las bacterias que descarboxilan la lisina, se reconocen por un
color rojo purpureo debido al aumento de pH alrededor de sus colonias. Las
colonias de Salmonella se presentan con pigmentacin rosa o roja algunas
veces transparentes con o sin centro negro y/o completamente negras. Las
UFC que presento nuestro medio fueron de un color blanco, con una forma
circular y con la presencia de una elevacin con borde entero por lo cual
tambin se descart que fueran UFC de Shigella ya que estas son
transparentes o del color del medio de cultivo y mucho menos UFC
representativas a la Salmonella.
4) Agar Entrico de Hektoen: Medio de cultivo selectivo y diferencial empleado
para la demostracin y aislamiento de bacterias intestinales patgenas. Las
bacterias de Salmonella se desarrollan con la produccin de cido sulfhdrico y
un halo transparente alrededor dando las caractersticas de un color verde o
azul verdes con o sin centro negro. Mencionado esto nos dimos cuenta que
nuestro medio de cultivo presentaban una forma circular, con elevacin plana y
borde entero, con un color azul verdoso sin centro negro. Con lo que todos los
miembros del equipo coincidimos en que eran UFC tpicas de Salmonella.
5) Agar SS: Este medio es selectivo y diferencial. La selectividad est dada por
las sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias
Gram positivas, de la mayora de coliformes y el desarrollo invasor del Proteus.
Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa y a la produccin de cido
sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio. Salmonella desarrolla colonias
traslucidas ocasionalmente opacas, algunas con centro negro a causa de la
produccin de cido sulfhdrico. En nuestro medio logramos observar UFC con
un color rosa con rojo, de forma puntiforme y elevacin plana, esto nos indic
que estas UFC son atpicas a la Salmonella al igual que no forman parte de las
UFC del genero Shigella ya que estas son trasparentes, traslucidas u opacas y
suelen ser lisas.



Tabla #2. Resultados de las pruebas bioqumicas.
Medio de cultivo Informacin que
proporciona
Resultado


TSI
Fermentacin solamente
de glucosa
+
Fermentacin de lactosa +
Fermentacin de
sacarosa
+
Produccin de gas +

SIM
Produccin de sulfuros +
Produccin de indol +
Movilidad +

Agar Citrato de Simmons
Utilizacin de citrato
como nica fuente de
carbono
+

LIA
Desanimacin de la LYS +
Descarboxilacin de la
LYS
+
Caldo Urea Presencia de la ureasa +
Caldo Malonato Utilizacin del malonato
como fuente de carbono
+
Muestra analizada: carne molida
Numero de colonias sospechosas provenientes de caldo selenito-cistina: +300
Colonia Medio de cultivo TSI LIA
1 Agar Entrico de
Hektoen
+ +


Una vez recolectados los datos de las pruebas bioqumicas y verificar las
caractersticas bioqumicas de la Salmonella nos dimos cuenta que no presentaba
los resultados tpicos a dicha bacteria ya que presento un resultado positivo en la
mayora de las pruebas y para dar positivo a Salmonella tendra que haber dado
un resultado negativo en la prueba de la ureasa, malonato, indol y lactosa lo cual
no sucedi. Tuvimos un parecido similar con la bacteria Arizona aunque esta
obtuvo un resultado ms cercano que la bacteria Salmonella obteniendo un
resultado positivo en la ureasa y el indol los cuales deberan de haber arrojado un
resultado negativo, pero a pesar de esto obtuvo un resultado mayor de resultados
que coinciden con dicha bacteria por esta razn la bacteria Salmonella Arizona en
25g de carne molida se determin como presente.
Tambin se compararon los resultados con la bacteria Klebsiella oxytoca ya que
supero la cantidad de resultados positivos que las bacterias anteriormente
descritas y pensando que tambin podra estar presente debido a que este tipo de
agares son selectivos para bactericeas.
Conclusiones:
Una vez analizados los resultados a detalle llegamos a la conclusin de que la
bacteria encontrada en el alimento fue un subespecie de la bacteria Salmonella
conocido como Arizona la cual utiliza el malonato como fuente de energa
diferencindose de otras subespecies las cuales utilizan por lo regular citrato como
nica fuente de carbono. Esta conclusin la obtuvimos tomando en cuenta que su
fermentacin es de tipo cido mixta, con reaccin negativa de Voges-Proskauer.
Son en general productoras de cido sulfhdrico y son ureasa negativa.
Descarboxilan la LYS.
La carne molida adquirida tuvo presencia de Salmonella Arizonae la cual es
entrica y se encuentra en los reptiles, las aves y los animales domsticos. Con lo
cual se hace dudosa la procedencia de la carne y presenta un riego para el
consumo humano ya que la ingestin de alimentos contaminados con dicha
bacteria produce gastroenteritis y la salmonelosis.
Trabajos citados
Cubillos, D. A. (10 de Enero de 2009). universidad nacional de colombia . Obtenido de
http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis198.pdf
Villavicencio, C. (2 de febrero de 2010). slideshare. Obtenido de
http://www.slideshare.net/lilicarito1/identifcacion-de-salmonellas?qid=94208b5b-5e2d-
4500-ad33-d21b21b056c5&v=qf1&b=&from_search=6