Electroforesis

electroforesis proviene de los vocablos griegos lektron que significa mbar y

referencia a la electricidad y phoros que significa llevar o trasladar, por tanto
etimolgicamente puede definirse como un transporte o traslado bajo la accin de
electricidad. Ms propiamente, la electroforesis se define como un mtodo
para la separacin de molculas segn la movilidad de stas en un campo
travs de una matri porosa, la cual finalmente las separa por tama!os
moleculares y carga elctrica, dependiendo de la tcnica que se use.
"n #$%& el bioqu'mico sueco (rne )iselius dio a conocer un nuevo mtodo para separar las prote'nas de una mecla. *ste
consist'a en colocar un cierto volumen de una solucin de dos o ms prote'nas en un tubo de vidrio en forma de +, sin llenarlo
completamente. ,espus el espacio restante en cada e-tremo se ocupaba con el volumen
necesario de una solucin de electrolitos libre de prote'na, que actuaba como
amortiguador. .uego se sumerg'a un electrodo en la solucin amortiguadora libre de prote'na de
cada e-tremo, se conectaban los electrodos a una fuente de electricidad y se somet'a todo el
sistema a un campo elctrico. .os componentes de la mecla de prote'nas comenaban a moverse a
diferente velocidad /acia el electrodo de carga opuesta. 0e formaban frentes de movimiento
que reflejaban la movilidad electrofortica de cada componente, o grupos de componentes de la
mecla, por lo que se le dio el nombre de electroforesis de frentes en movimiento o
boundary electrophoresis a este sistema.
"ste fue uno de los pocos mtodos anal'ticos poderosos disponibles para los
investigadores en la poca del desarrollo inicial de la qu'mica de
a pesar de que presentaba importantes desventajas como escaso poder
resolucin, e-igir gran cantidad de muestra, ser muy laborioso y en la
permitir la separacin total de los componentes de la mecla, el sistema
dio paso a aquellos que usaban un soporte slido o gelatinoso,
en la solucin amortiguadora de p1, sobre el que ocurr'a la separacin
electrofortica y dadas las cantidades relativamente peque!as de
que pod'an aplicarse, la separacin total de los componentes en bandas
discretas se convert'a en algo realiable. (l desconectar el campo
cada componente de la mecla se manten'a por un tiempo suficiente
prcticos, en la ona del soporte que /ab'a alcanado durante la
electroforesis. 0e les llam genricamente electroforesis de zona
2uando una mecla de molculas ioniadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas e-perimentan una
fuera de atraccin /acia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las molculas cargadas
positivamente se desplaaran /acia el ctodo 3el polo negativo4 y aquellas cargadas negativamente se desplaaran /acia el
nodo 3el polo positivo4.
"l movimiento de las molculas est gobernado tambin por dos fueras
adicionales5 inicialmente la friccin con el solvente dificultar este
movimiento originando una fuera que se opone, por otro lado las
molculas poseen energ'a cintica propia por lo que tienden a moverse en
forma aleatoria o movimiento bro6niano. .a suma de todas estas
fueras provoca que las molculas no migren de una manera /omognea,
de tal manera que, si las molculas son colocadas en un cierto lugar de
solucin, los iones comenaran a moverse formando un frente cuya
anc/ura aumentara con el tiempo.
7ara reducir la anc/ura de este frente se reduce el movimiento de las molculas empleando un medio que le oponga
resistencia, por ejemplo un gel. *ste es un pol'mero soluble de muy alto peso molecular que atrapa molculas de agua y forma
que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migracin electrofortica de las molculas ser ms
lenta, pero el ensanc/amiento del frente se ver reducido tambin. se aplica un potencial de corriente continua a travs del
mismo durante un tiempo fijo. 2uando las separaciones se /an completado se interrumpe el paso de corriente y las especies
separadas se ti!en para visualiarse.
ELECTROFORESIS LIBRE
campo elctrico se aplica a disoluciones o suspensiones.
1istricamente, es el origen de la electroforesis tal y como /oy se
conoce y fue desarrollada por (rne )iselius en #$%&. (ctualmente est en desuso, ya
un fluido el medio en el que se desarrolla, tiene poco poder de
ELECTROFORESIS EN ZONA
las tcnicas ms utiliadas en bioqu'mica y biolog'a molecular por su
elevada resolucin. "l campo elctrico se aplica a un medio o soporte estabiliante 3en ve de a un fluido4 y la muestra se
deposita en una reducida ona del mismo.
7ara llevar a cabo una separacin electrofortica onal se necesitan8
9 :uente de alimentacin. 7roporciona el campo elctrico mediante dos electrodos, uno positivo 3nodo4 y otro negativo
3ctodo4 entre los que se establece una diferencia de potencial.
9 2ubeta. ;ecipiente en cuyos e-tremos se sitan los electrodos.
9 0oporte electrofortico.
2uando se utilia la electroforesis en ona, la muestra se dispone inicialmente en una peque!a ona del soporte, y
posteriormente lo va recorriendo impulsado por el campo elctrico.
7ara que esta situacin sea estable, tanto al comieno como a lo largo del proceso de
separacin, es necesario contrarrestar el efecto de la difusin y las posibles corrientes
de conveccin. 7ara ello se utilian reticulados moleculares 3el soporte de la
electroforesis4, que forman un entramado tridimensional que impide o reduce
dic/a difusin y permite la entrada de agua en sus poros5 el tama!o de estos poros
debe permitir el paso de molculas voluminosas como son los cidos nucleicos y
las prote'nas. (dems, el soporte debe ser inerte, es decir, no debe tener cargas que
interfieran con la migracin de las molculas de la muestra. .os diferentes tipos de
soportes se clasifican en dos grupos8 ;estrictivos y <o restrictivos.
SOPORTES NO RESTRICTIVOS TIPO I
"l )ama!o de poro no opone impedimento al paso de las molculas. "l agar es el ejemplo ms representativo y se obtiene a
partir de algas marinas y est formado por dos tipos de polisacridos8 la agarosa y la agaropectina. .a agarosa se utilia
ampliamente sobre todo para la separacin de cidos nucleicos y para el anlisis de prote'nas. .os diferentes tipos de
agarosas se caracterian por su punto de fusin 3entre %=>$=?24, su
f'sica y el grado de electroendsmosis.
SOPORTES RESTRICTIVOS TIPO II
0oportes ;estrictivos )ipo @@. "l tama!o de poro opone resistencia al paso de las molculas.
"l ejemplo caracter'stico son los geles de poliacrilamida, que no slo evitan la conveccin
y minimian la difusin, sino que adems participan en el proceso de separacin.
"stos geles son medios porosos en los que el tama!o de poro es similar al de las
prote'nas, de tal modo que e-iste un efecto de tamiado molecular y la separacin
electrofortica depende de la densidad de carga de las molculas y de su tama!o.
ELECTROFORESIS EN PAPEL
se aplica sobre una tira de papel filtro /umedecido con una
tampn, bien en el centro o en cualquiera de los e-tremos del
dependiendo de las sustancias a separar y del p1 del tampn.
e-tremos de la tira se sumergen en dos recipientes separados
contienen la disolucin tampn y en los que se /allan colocados
electrodos.
0e conectan los electrodos a una fuente de tensin continua y se aplica una
diferencia de potencial durante el tiempo adecuado. (l aplicar una corriente directa, las molculas cargadas de la mecla
emigran /acia los electrodos de polaridad opuesta formando bandas en el papel. .a velocidad de emigracin de una molcula,
depende preferentemente de su carga. 2ompletada la electroforesis, se desconecta la fuente de tensin y se secan las tiras
sobre una superficie, limpia, seca y lisa 3cristal, aulejo, etc.4.
se realia empleando los mismos mtodos que los utiliados en
cromatograf'a sobre papel, mediante la accin de los colorantes
adecuados.
electroforesis en papel se emplea principalmente en la separacin
sustancias de bajo peso molecular como aminocidos y pptidos.
electroforesis en papel tambin pueden /acerse en tiras de
celulosa, que son qu'micamente ms /omogneas y tienen la
ser transparentes, con lo que las sustancias a separar, una ve
reveladas, pueden cuantificarse por densitometr'a.
.a principal aplicacin es la separacin de prote'nas del suero o lipoprote'nas, conocindose el resultado como proteinograma
y lipograma respectivamente. 0e /an aplicado tambin para la separacin de isoenimas de la lactato des/idrogenasa y la
creat'n>quinasa.
ELECTROFORESIS EN EL
+n gel es un estado intermedio entre el slido y el l'quido. "ste tipo de electroforesis se /alla entre
los mtodos ms resolutivos y convenientes empleados en la separacin de
macromolculas. .os geles de uso ms generaliado son8 poliacrilamida y agarosa. *stos
poseen poros de diferentes dimensiones moleculares que delimitan la velocidad de traslado y
molculas trasladadas durante el proceso electrofortico. ,e esta forma, la separacin no se
produce slo por las diferentes cargas de las molculas, sino tambin por las diferencias de tama!o. .os geles estn formados
por un reticulado de pol'meros 3constituyendo una red enmara!ada4 y el l'quido intersticial en el que se encuentra inmerso esta
eles de a!arosa
.a agarosa es un polisacrido 3originalmente obtenido de algas4 cuyas
disoluciones 3t'picamente de A.= a B C4 poseen la propiedad de
permanecer liquidas por encima de =A ? 2 y formar un gel, semislido al
"ste gel est constituido por una matri o trama
tridimensional de fibras polimricas embebida en gran
cantidad de medio l'quido, que retarda el paso de las molculas, se usa
usualmente para separar molculas grandes de alrededor BA.AAA
nucletidos.
eles de "oliacrilamida
.os geles de poliacrilamida 37(D", polyacrilamide gel electrop/oresis4 se forman por
polimeriacin de la acrilamida por accin de un agente entrecuador, es
qu'micamente inerte, de propiedades uniformes, capa de ser preparado de forma rpida
y reproducible. :orma, adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles
en agua, relativamente no inicos y que permiten buena visualiacin de las bandas
durante un tiempo prolongado. (dems tiene la ventaja de que variando la
concentracin de pol'meros, se puede modificar de manera controlada en el tama!o del
poro, lamentablemente cada ve se emplea menos en diagnostico debido a su
neuroto-ocidad.
.a electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de los mtodos ms utiliados para la purificacin, anlisis y caracteriacin
de prote'nas. .a tcnica permite separar molculas cargadas y e-plota diferencias en movilidad cuando se les somete a la
accin de un campo elctrico. "-iste una gran variedad de tipos de electroforesis en gel de poliacrilamida, que se pueden
agrupar en dos categor'as8
#. "lectroforesis en gel en una dimensin 3continuo o discontinuo4
7(D">nativa
7(D">desnaturaliante 30,0>7(D"4
@soelectroenfoque
B. "lectroforesis en gel en dos dimensiones 3bidimensional4
PAE#NATIVA
.a 7(D">nativa se utilia para separar prote'nas en condiciones no desnaturaliantes, por tanto, en funcin de la carga
intr'nseca de las mismas.
PAE#$ESNAT%RALIZANTE

"n la electroforesis desnaturaliante, como su propio nombre indica, se utilian agentes desnaturaliantes de prote'nas, como
pueden ser8 detergentes 3p.ej. 0,0, sodio dodecil sulfato4, catropos 3p.ej. urea4 y agentes reductores 3B> mercaptoetanol,
,))4. 7ara la visualiacin de las prote'nas se utilian diferentes mtodos de tincin, siendo el ms /abitual el aul de
2oomassie. "n la 0,0>7(D", la separacin es funcin del tama!o 3masa molecular4, lo que permite determinar el peso
molecular de las prote'nas. 7ara ello se compara la movilidad electrofortica 3;f4 de la prote'na de peso molecular desconocido
con el de prote'nas de referencia de peso molecular conocido. .a 0,0>7(D" es muy til para calcular el peso molecular de
una prote'na concreta ya que separa las prote'nas segn su tama!o.
ISOLECTROENFO&%E
"sta tcnica, /abitualmente denominada electroenfoque se basa en el desplaamiento de las molculas en un gradiente de
.as molculas anfotricas, como los aminocidos, se separan en un medio en el que e-iste una diferencia de potencial y
un gradiente de p1. .a regin del nodo es Ecida y la del ctodo es alcalina. "ntre ambos se establece un gradiente de p1
que las molculas que se /an de separar tenga su punto isoelctrico dentro del rango. .as sustancias que inicialmente se
encuentran en regiones de p1 inferior a su punto isoelctrico estarn cargadas positivamente y migraran /acia el ctodo,
mientras aquellas que se encuentran en medios con p1 ms bajos que su punto isoelctrico tendrn carga negativa
/acia el nodo. .a migracin les conducir a una regin dnde el p1 coincidir con su punto isolctrico, tendrn una carga
neta nula y se detendrn. ,e esta forma las molculas amfotricas se sitan en estrec/as bandas donde coincide su punto
isoelctrico con el p1.
ELECTROFORESIS BI$I'ENSIONAL
.a electroforesis bidimensional se basa en separar las prote'nas en una mecla segn sus dos propiedades moleculares, una
en cada dimensin. "l procedimiento ms usado se basa en la separacin en una primera dimensin mediante
isoelectroenfoque y la segunda dimensin segn peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida.
(unque la electroforesis en gel en sus diversas formas resulta un mtodo comn y efectivo para la separacin de molculas, el
proceso de separacin puede durar varias /oras, siendo dif'cil de cuantificar y automatiar. .a electroforesis capilar 32"4 es
una tcnica de separacin que se /a desarrollado gracias a los avances de la cromatograf'a l'quida de alta eficacia junto con
los procedimientos ms tradicionales de electroforesis. "sta tcnica permite separar bastante bien biomolculas, donde la
cromatograf'a l'quida se muestra menos efica, y compuestos de peque!a masa molecular, dif'ciles de estudiar por los
procedimientos clsicos de electromigracin en soporte.
.a electroforesis capilar constituye una adaptacin particular de la tcnica de
electroforesis. "sta tcnica separativa se basa en la migracin de las especies de
la muestra en disolucin, portadoras de una carga elctrica global, bajo el efecto de un
campo elctrico y en contacto con un soporte 3medio de desplaamiento4 adecuado.
"n electroforesis capilar la tira se reemplaa por un tubo capilar abierto en sus
e-tremos, fabricado con un dimetro peque!o 3#= a #=AFm4. "l capilar oscila entre
BA y GAcm, y est lleno de una solucin buffer. +n detector se encuentra ubicado en
un e-tremo del capilar, cerca del compartimiento catdico. .a se!al obtenida es
la base de la obtencin del electroferograma, que muestra el registro de la composicin
de la muestra. 0olo las especies que se dirigen /acia el ctodo sern detectadas.
'(TO$OS $E $ETECCI)N
"n la deteccin +H>His se mide la intensidad de la lu que pasa a travs del capilar en una peque!a ona en la que se /a
eliminado el revestimiento opaco. .a deteccin por fluorescencia resulta ms sensible si se emplea una fuente lser muy
intensa, asociada a menudo a un procedimiento de preformacin de derivados de los analitos portadores de un fluorforo.
ELECTROFOR(TICAS CAPILARES
Electroforesis capilar en zona o en disolucin libre (CZE)
procedimiento de electroforesis ms /abitual, en el cual el capilar es recorrido
electrolito a travs de un medio buffer que puede ser cido 3fosfato o citrato4,
3borato4, o anftero 3carcter cido y bsico4. "l flujo electroosmtico crece con
medio electrofortico.
Electroforesis capilar electrocintica micelar (MEKC)
"n esta variante del procedimiento anterior se a!ade a la fase mvil un compuesto catinico o aninico para formar micelas
cargadas. "stas peque!'simas gotitas inmiscibles con la disolucin retienen a los compuestos neutros de un modo ms o
menos efica, por afinidad /idrfila>/idrfoba. 0e puede utiliar este tipo de electroforesis para molculas que tienen tendencia
a migrar sin separacin, como es el caso de algunos enantiomeros.
Electroforesis capilar en gel (CGE)
"sta es la transposicin de la electroforesis en egel de poliacrilamida o de agarosa. "l capilar est relleno con un electrolito que
contiene al gel. 0e produce un efecto de filtracin que ralentia a las grandes molculas y que minimia los fenmenos de
conveccin o de difusin. .os oligonucletidos, poco frgiles, se pueden separar de este modo.
Isoelectroenfoque capilar (CIE)
"sta tcnica, tambin conocida como electroforesis en soporte, consiste en crear un gradiente de p1 lineal en un capilar con
pared tratada que contiene un anftero. 2ada compuesto migra y se enfoca al p1 que tenga igual valor que su punto
isoelctrico 3al p@ su carga neta es nula4. 0eguidamente, bajo el efecto de una presin /idrosttica y manteniendo el campo
elctrico, se desplaan las especies separadas /acia el detector. .as altas eficiencias obtenidas con este procedimiento
permiten separar pptidos con p@ que apenas difieren entre s' A.AB unidades de p1.
"l resultado de una electroforesis depende de numerosos factores y es necesario conocerlos para lograr la m-ima resolucin.
CA'PO EL(CTRICO
"s un gradiente de potencial que posibilita que /aya electroforesis. ( su ve, depende de
diferentes parmetros8
,iferencia de potencial 3H4. 0e mide en voltios y es lo que define el campo elctrico.
2uanto mayor sea, mayor ser la velocidad de migracin. .as electroforesis se consideran
de bajo voltaje si se realian entre #A>=AA voltios 3la mayor'a4 y de alto voltaje si se
realian entre =AA>#A.AAA voltios.
@ntensidad 3@4. 0e mide en amperios y cuantifica el flujo de carga elctrica. "st
relacionada con la diferencia de potencial por la .ey de I/m8
y para una diferencia de potencial dada, su valor
3normalmente entre =>=Am(4 viene determinado por la resistencia del
soporte, por lo que, en ltima instancia, da cuenta de la distancia recorrida por las molculas.
;esistencia 3;4. 0e mide en o/mios y cuanto mayor sea la resistencia del soporte,
menor ser la movilidad electrofortica 3ya que la intensidad /a de ser menor para que se
cumpla la .ey de I/m4. ,epende de la naturalea del soporte, sus dimensiones
3anc/ura, longitud y seccin4 y de la concentracin del tampn de electroforesis.
)emperatura. 7or el efecto Joule, el paso de una corriente elctrica produce calor, y este efecto ser tanto mayor cuanto
mayor sea la diferencia de potencial y la resistencia del sistema. ,ebe controlarse de forma estricta, puesto que puede
afectar a la muestra 3desnaturalindola4, al soporte e incluso al equipo electrofortico. )odo esto justifica, por s' solo, la
necesidad de un sistema de refrigeracin en las cubetas de electroforesis.
.a movilidad electrofortica de una molcula es tanto mayor cuanto mayor sea su carga y disminuye
segn aumenta su tama!o, ya que mayor es la friccin de la molcula con el medio y menor es su
carga por unidad de superficie. 7or esta ran, las molculas globulares se mueven con mayor
facilidad que las elongadas, ya que la esfera presenta la m'nima superficie a igualdad de volumen.
(s', molculas del mismo tama!o y carga, pero de diferente forma, pueden tener una movilidad electrofortica diferente y ser,
por tanto, separables mediante una electroforesis.
,urante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por accin del campo elctrico, lo cual genera protones en la
pro-imidad del nodo e iones /idro-ilo en el ctodo. "l tampn es, por esta ran, esencial durante la electroforesis para evitar
que el nodo se acidifique y el ctodo se /aga ms bsico, pero no debe afectar a las molculas a separar.
fuera inica condiciona la movilidad electrofortica de las substancias a
que influye en su esfera de solvatacin y en la conductividad de todo el
sistema, por lo tanto, es necesaria una fuera inica suficiente para mantener el p1 y
conductividad durante todo el proceso, pero no muy elevada, ya que
interferir en el sistema.
<ormalmente, se emplean tampones con fueras inicas moderadas
A.#AM4, siendo el p1 la caracter'stica que debe ser ms controlada,
determina la carga de la muestra.
se!alar tambin que atendiendo a la distribucin del tampn, los
sistemas se clasifican en continuos cuando se emplea un nico tampn en el
discontinuos cuando se emplean, al menos, dos tampones de p1 y
composicin diferentes.
.a simple presencia del soporte en una electroforesis /ace que se presenten una serie de fenmenos de elevada
trascendencia para el resultado del proceso8
(dsorcin. "s una retencin inespec'fica de las molculas de la muestra sobre el
soporte, por lo que afecta negativamente a la resolucin, ensanc/ando las bandas
de migracin.
"lectroendsmosis 3""I4. "s un fenmeno que se da en algunos soportes
3sobre todo en los no restrictivos de tipo @4, en los que aparecen cargas negativas,
debidas a grupos carbo-ilo o sulfato, al estar en contacto con una disolucin
inica.
(l aplicar el campo elctrico, los iones y las molculas se desplaan segn su
carga, pero en su migracin se encuentran con un flujo de cationes
desplandose sobre la superficie del soporte y otro de aniones /acindolo
por el centro de los poros. "ste flujo orientado se llama flujo
electroendosmtico. "l ""I va en contra de la resolucin de una
electroforesis, ya que las bandas de la muestra se ensanc/an y se distorsionan5
sin embargo, la ""I contribuir a una mejor resolucin en las
inmunoelectroforesis y en la electroforesis
)amiado molecular. "s un efecto debido al mayor o menor reticulado
de los soportes5 cuanto ms tupida sea la red de fibras, menores sern los poros. "l movimiento de las molculas a
travs del soporte es ms o menos fcil en funcin de su tama!o respecto al de los poros5 aquellas molculas cuyo
tama!o se apro-ime al del poro, ver impedido su avance respecto a aquellas cuyo tama!o sea muy inferior. 7or esta
ran, el soporte acta como un cedao que separa o tamia las molculas en funcin de su tama!o.