La transferencia de ADN entre microorganismos puede ocurrir bsicamente por
cuatro procesos : a) transformacin, b) conjugacin, c) transduccin y d) sexduccin. Mediante estos mecanismos los microorganismos pueden incorporar material gentico o donar material gentico dando lugar a formas recombinantes. Transformacin Podemos definir el proceso de transformacin bacteriana como la capacidad que presenta una bacteria para incorporar un fragmento de ADN que se encuentra en el medio externo. Este mecanismo fue descubierto en el ao 1928 por F, Griffith en Streptococcus pneumoniae (transformacin de cepas rugosas no patgenas a cepas lisas patgenas). Posteriormente Avery, Mac Leod y Mc Carty (1944) demuestran que el principio transformante era el ADN (experiencia que muestra por primera vez que la informacin gentica estaba codificada en las molculas de ADN). En el proceso de transformacin natural el ADN a ser captado debe encontrarse en estado de doble cadena y el nmero de molculas de ADN que puede captar una bacteria es limitado existiendo una cintica de saturacin. El fenmeno de transformacin ocurre en varias etapas, y la bacteria que va a recibir el ADN exgeno debe encontrarse en estado "competente" (estado en el cual la bacteria es capaz de incorporar ADN del medio e integrarlo al cromosoma bacteriano). El estado de competencia depende de varios factores y es diferente para cada especie bacteriana. Los factores que influyen son varios como la densidadcelular del cultivo, temperatura, pH, nutrientes (fuente de carbono o de nitrgeno). Las bacterias pueden llegar al estado de "competencia" cuando se acercan al final de la fase de crecimiento exponencial y entran en la fase estacionaria. En el estado de "competencia" en general se encuentran entre un 10% a 20% de la poblacin bacteriana aunque esto puede variar segn la especie bacteriana. Por ejemplo el Streptococcus pneumoniae el estado competente afecta al 100% de las clulas durante la etapa exponencial mientras que el Bacillus subtilis solo entre el 1 y el 20% se encuentran en estado competente y este se manifiesta en la etapa estacionaria. El primer paso de la transformacin consiste en la unin de la molcula de ADN a la superficie de la clula bacteriana. Por ejemplo el Streptococcus pneumoniae presenta entre 20 y 50 puntos de unin. Una vez que el ADN se une, sufre una serie de cortes en las dos cadenas mediante la accin de endonucleasas. Cuando los fragmentos de ADN entran a la clula, pierden una de las dos cadenas. En el interior de la clula, el ADN forma un complejo con protenas quedando protegido de la ADNasa I. Existe en este momento un estado denominado fase de eclipse cuando el ADN que entr por transformacin (exogenote) si sale de la clula no va apoder ejercer el efecto transformante. Este ADN posteriormente se integra al cromosoma bacteriano en zonas de homologa de secuencias. Conjugacin Lederberg y Tatum en 1946 descubren un proceso por el cual las clulas de E. coli pueden intercambiar material gentico mediante un contacto fsico entre ellas (fig 1). Hoy da este fenmeno tiene gran importancia evolutiva y ecolgica puesto que la transferencia de ADN puede establecerse no solo entre clulas de la misma cepa bacteriana sino entre especies distintas y alejadas evolutivamente. El plsmido F conocido originalmente como factor de fertilidad fue el primero que se descubri que poda pasar de una bacteria donante a una receptora mediante el mecanismo de conjugacin (fig 2). El plsmido F es de tipo conjugativo y tiene la capacidad de interaccionar con el cromosoma bacteriano e integrarse en l (forma denominada "episoma") El contacto fsico se establece mediante la formacin de un "pelo" o "pili" sexual constituido por protenas. Para la formacin del "pili" intervienen no menos de 16 productos gnicos. Dentro de las bacterias donantes se pueden diferenciar tres + tipos 1) las F , que presentan al plsmido F y pueden transferirlo, 2) las Hfr (clulas de alta frecuencia de recombinacin) que contienen al factor F integrado en su propio cromosoma bacteriano, y lo pueden transferir junto con genes bacterianos, y 3) las F' (F-prima) que son clulas Hfr que portan el genoma del factor F pero este tiene la capacidad de excindirse y recircularizarse (forma de plsmido) llevando consigo genes bacterianos. El primer factor F- prima (F') fue aislado por Jacob & Adelberg y llevaba genes del opern Lac . A este fenmeno de transferencia de F' de una bacteria donante a una receptora se le conoce con - el nombre de sexduccin. A las bacterias receptoras se le denomina F , ellas no contienen al plsmido F y lo reciben de las bacterias donantes . Previo al proceso de conjugacin, el Plsmido F se replica y transfiere su informacin a la clula F- convirtindola en F+ sin perder ella misma dicha capacidad.
Fig 1: Observacin al microscpio electrnico del mecanismo de Conjugacin.
Fig 2 : Mapa fsico y funcional del plsmido F (100 Kb). Transduccin Este mecanismo se puede definir como la transferencia de material gentico no vrico de una bacteria a otra por intermedio de un bacterifago. Estos fagos llevan la informacin gentica de la bacteria en el interior de su cpsida (partculas transductoras) (fig 3). Originalmente este fenmeno se describi en Salmonella aunque hoy se conoce en distintas especies bacterianas. Varios fagos presentan capacidad transductora como el P1, T4, Mu y el fago ?. Existen dos tipos de transduccin:, a) la transduccin generalizada en la cual el fago puede portar un fragmento cualquiera del genoma bacteriano, b) la transduccin especializada en la cual el fago lleva informacin de regiones especficas del cromosoma bacteriano (ej el opern gal de E.coli en el fago ? ) pudiendo transducir e infectar.
Fig 3: Esquema general del proceso de transduccin. TRANSPOSONES Se conocen tambin con el nombre de elementos genticos mviles, genes saltarines, casetes, etc. Los primeros genes saltarines los descubri Barbara McClintock en la dcada del 40 cuando estudiaba la gentica del maz y en 1967 se descubren en organismos procariotas (E.coli). Son secuencias de ADN que tienen la capacidad de saltar de un lugar a otro del genoma. Los transposones ms simples se denominan elementos IS (secuencias de insercin) y presentan una regin central de 700 a 1500 bp rodeados de una secuencia invertida de 10 a 30 bp. En la regin central se encuentran los genes encargados de realizar el salto o transposicin. Tambin se encuentran los llamados transposones compuestos que presenta una regin central rodeada por dos elementos IS, estos transposones llevan informacin gentica adicional. En el mecanismo del salto o transposicin intervienen enzimas tales como la transposasa (produce cortes) y la resolvasa (acta en el proceso de recombinacin). En algunos casos el elemento mvil puede replicarse antes de saltar dejando una copia en el lugar original mientras que otras veces puede saltar sin dejar copia e insertarse en otra regin del genoma. Estos elementos genticos mviles los podemos encontrar tanto en el cromosoma bacteriano como en plsmidos y pueden ser transferidos entre bacterias por los mecanismos de conjugacin, transduccin y transformacin. MUTACIN EN MICROORGANISMOS El material gentico de un microorganismo puede alterarse por factores endgenos (origen espontneo) o exgenos (origen inducido). Existen distintos niveles mutacionales, por ejemplo cuando la mutacin tiene un efecto puntual en un gen se denomina mutacin gnica mientras que si esta afecta a diversas partes del genoma, la denominamos mutacin genmica. Si la mutacin afecta la estructura del cromosoma (en bacterias) o de los cromosomas(microorganismos eucariotas; levaduras) las denominamos mutaciones cromosmicas. Al hablar de mutaciones en microorganismos debemos tener en cuenta la variabilidad microbiana existente as como el tamao de sus genomas (Tabla 1). Microorganismo s Tamao del genoma (Mb) Proporcin del genoma codificante de protenas Nmero de protenas por genoma E. coli 4.64 88 4288 H. influenzae 1.83 85 1703 H. pylori 1.70 91 1590 Mycoplasma pneumoniae 0.82 89 677 Saccharomyces cerevisie 12.1 72 5885 Tabla 1: Comparacin de genomas de distintos microorganismos Las mutaciones que afectan al fenotipo del microorganismo nos permiten diferenciarlo en algn carcter en particular respecto del microorganismo con fenotipo "normal" que sirve de referencia (fenotipo silvestre). En ltima instancia los fenmenos mutacionales tienen su efecto a nivel de la molcula de ADN y pueden verse alteradas secuencias o elementos necesarios para la expresin de un gene o de varios genes (promotores, secuencias reguladoras, terminadores, etc.). Por otro lado las mutaciones pueden afectar secuencias moduladoras tales como operadores. Las clulas bacterianas crecen y se dividen d tal forma que en uno o dos das una clula origina millones de ellas, todas genticamente idnticas (clones). Las clulas que derivan de una de ellas se mantienen juntas formando la colonia bacteriana (visible al ojo humano, aproximadamente 10 millones de bacterias). Por lo tanto la colonia constituye la unidad ms importante para la identificacin de clulas mutantes. Uno de los desafos del genetista microbiano consiste en disear estrategias experimentales para el reconocimiento de colonias mutantes; a tales efectos se emplean los procesos de rplica, seleccin y contraseleccin (Fig 4). Actualmente existe tecnologa adecuada y costosa para poder identificar clulas mutantes en forma separada o sea que mediante estos mtodos, la clula pasara a ser la unidad de identificacin de fenotipos mutantes. Una de las tcnicas de anlisis reciente de clulas es la citometra de flujo; que consiste en tratar a una poblacin celular con un agente mutagnico y luego se hace pasar por un tubo capilar iluminado por un rayo de luz que analiza varios parmetros celulares (tamao, transparencia celular, emisin de fluorescencia). Posteriormente mediante un sistema separador es posible obtener clulas aisladas con diferentes caractersticas. La posibilidad de marcar a las clulas con compuestos fluorescentes aumenta las posibilidades de separacin de las mismas en un citmetro de flujo.
Fig 4: Procedimientos para la bsqueda de colonias mutantes. Mediante la rplica se comparan copias idnticas de colonias en dos o ms cajas de Petri con distintos medios de cultivo (por ejemplo: medio completo y medio mnimo para identificar mutantes auxtrofos) o tambin con igual medio de cultivo pero distintas condiciones de temperatura (por ejemplo: cultivos a 30 C y cultivos a 40 C, para identificar microorganismos termosensibles). El sistema de seleccin utiliza el agregado de sustancias que matan a unas clulas mientras que otras no se ven afectadas. El sistema de contraseleccin se utiliza para la identificacin y anlisis de las colonias mutantes ya que se eliminan primero las que crecen y posteriormente se dejan crecer en condiciones ptimas a las colonias supervivientes. Prottrofo: Cepa de microorganismo capaz de crecer en un medio mnimo definido a partir del cual puede sintetizar la totalidad de las molculas biolgicas complejas que requiere. Auxtrofo: Cepa de microorganismo incapaz de sintetizar una molcula orgnica determinada necesaria para su crecimiento. Se produce su crecimiento cuando se suministra en el medio de cultivo el compuesto requerido. Son frecuentes las mutaciones? En general las mutaciones espontneas son poco frecuentes. Para cuantificar las mutaciones se suelen usar dos parmetros a) tasa de mutacin, y b) frecuencia de mutacin. La tasa de mutacin nos mide la tendencia que tiene un gen de sufrir mutaciones, y se expresa como el nmero de mutaciones que ocurren por cada unidad que mida la oportunidad de mutar. Dicha unidad puede ser el tiempo de generacin celular o de divisin celular (tiempo biolgico). Por frecuencia de mutacin se entiende como la frecuencia de aparicin de un mutante en la poblacin final de bacterias.
Ejemplo: Tasa de mutacin ser el cociente entre un evento mutacional (M) en 7 divisiones celulares reales. Mientras que la frecuencia mutacional se calcular como el cociente entre la frecuencia de clulas mutadas en el total final de la poblacin (2/8= 0.25).
Test de AMES Dicho test fue desarrollado por el microbilogo Bruce Ames con la finalidad de poder determinar el poder mutagnico de determinadas sustancias qumicas. Este nos permite en forma rpida evaluar aquellas sustancias qumicas que pueden tener poder carcinognico. En este tipo de anlisis se parte de la premisa de que si una sustancia qumica ocasiona dao en el ADN con un efecto mutagnico, tambin pueden llegar a tener un efecto carcinognico. A pesar de esto existen sustancias que causan cncer en animales de laboratorio y son negativas al mismo. En el test de Ames se emplean diferentes cepas de la bacteria Salmonella typhimurium de las cuales se le conocen los tipos de mutaciones que presentan. Estos mutantes han perdido la capacidad de sintetizar el aminocido histidina (His) por lo tanto se dice que son histidina auxotrficos (His-) pues solo crecen en medios de cultivo a los que se les adiciona dicho aminocido. Las cepas salvajes de Salmonella typhimurium contienen todas las enzimas necesarias para fabricar el aminocido His (cepas prototrficas, His +). Por lo tanto se evaluara la capacidad o habilidad que presentan determinados compuestos qumicos para producir mutaciones revertientes (back mutation) o sea que las cepas mutantes histidina auxotrficas reviertan a cepas salvajes de Salmonella typhimurium (prototrficas) (Fig 5). Los principales tipos de mutaciones observadas son a) de cambio del marco de lectura de genes, que traen como consecuencia una traduccin errnea de los mismos y b) mutaciones puntuales con sustitucin de una base produciendo un cambio en la secuencia aminoacdica de la protena codificada por dicho gen. Las cepas de Salmonella typhimurium que se utilizan en el test han sido seleccionadas basndose en la sensibilidad a sufrir mutaciones. Estas cepas presentan una serie de caractersticas: a) un aumento de la permeabilidad de la pared celular para permitir el ingreso rpido de la sustancia a testar (mutantes rfa), b) mutaciones en el sistema de reparacin de daos en el ADN (mutantes uvrB) ,c) plsmidos R y plsmidos multicopias que agregan errores durante la accin del sistema reparador de daos del ADN. Estas cepas se conocen con el nombre de TA97A, TA98, TA100, TA102 y TA1535. Con el correr de los aos se observ que existan sustancias que si bien no eran mutagnicas pero que al ser metabolizadas en organismos superiores producan metabolitos intermediarios que si tenan capacidad mutagnica y podan ser potenciales carcnogenos. Para solucionar parcialmente este problema; al medio de cultivo empleado en el test de AMES se le adicion una mezcla de enzimas de hgado de rata para simular el metabolismo que sufre la sustancia en un organismo superior. Este sistema que simula al hgado de un mamfero se conoce con el nombre de S-9 y nos permite detectar metabolitos intermediarios posiblemente carcinognicos. Las ventajas del empleo de dicho test son muchas: es rpido (las bacterias crecen y se dividen rpidamente), es muy simple (El tiempo aproximado para obtener un resultado final en este test es de 30 das), tiene bajo costo econmico, es posible testar varias sustancias al mismo tiempo, utilizando las mismas condiciones es repetible el resultado obtenido.
Figura 5: Se observa una versin cualitativa del test de Ames. En la placa de Petri se sembraron cepas de Salmonella typhimurium que requieren His para su crecimiento (auxotrficas, His- ). El disco de papel blanco esta impregnado con una sustancia carcinognica (2-aminofluorine). Dicha sustancia produce un efecto mutagnico en dicha cepa y se observa crecimiento de diversas colonias alrededor del disco (los mutantes His- mutan a cepas prototrficas que crecen en un medio carente de His). Resistencia Microbiana a sustancias antibiticas En los ltimos aos el avance de la industria farmacutica permiti generar nuevos antibiticos artificiales para el tratamiento de enfermedadesinfecciosas. Por otra parte esto genero una adaptabilidad de los microorganismos producto del desarrollo de resistencia. Durante los aos de 1940 al 1950 el uso de las sulfamidas y penicilinas produjo el surgimiento de cepas bacterianas resistentes a esas drogas constituyendo un serio problema. En Inglaterra el uso de penicilina G produjo en los staphylococcus aureus un aumento de la frecuencia de cepas resistentes del 10% al 60%. Existe una fuerte base gentica que permite explicar la resistencia bacteriana a determinadas drogas. Dentro de los mecanismos genticos- moleculares podemos citar: 1) la capacidad de que se generen nuevas mutaciones en genes localizados en el cromosomas bacteriano, 2) introduccin de plsmidos R. Estos pueden pasar de una cepa bacteriana a otra mediante conjugacin. Los plsmidos R presentan una serie de ventajas adaptativas: a) han evolucionado como respuesta a la presin selectiva del ambiente como ser, los distintos antibiticos utilizados por humanos, b) presentan genes de resistencia a mltiples sustancias antibiticas, c) pueden trasladarse entre bacterias de la misma especie o de especies diferentes, d) presentan elementos genticos mviles o transposones, e) al no existir presin selectiva (utilizacin de antibiticos) las clulas bacterianas los van perdiendo como una forma de "economa" f) no interfieren con otros genes bacterianos por lo cual las bacterias se desarrollan normalmente mostrando todo su potencial fenotpico. En el tema de la resistencia, los seres vivos ms abundantes del planeta (las bacterias) nos permiten comprobar la teora "Darwiniana" de la supervivencia de los ms aptos. Como mecanismos bioqumicos implicados en el fenmeno de la resistencia podemos citar : disminucin en la permeabilidad a absorber el antibitico, inactivacin enzimtica de la sustancia antibitica, modificacin del "blanco" o "diana" sobre la que acta el antibitico, sntesis de una enzima de resistencia. La disminucin de la permeabilidad puede estar dada por: modificaciones a nivel de la membrana externa (barrera natural), por la existencia de mecanismos de bomba de expulsin que enva al exterior al antibitico luego de su entrada, alteraciones en el mecanismos, por alteraciones en el mecanismo de transporte del antibitico. En el caso de las tetraciclinas por ejemplo hay bacterias que presentan transposones tipo el Tn10 o el Tn1721 que codifican protenas con la funcin de expulsar al antibitico desde el interior al exterior de la clula. En el caso de los antibiticos beta-lactmicos (penicilina, cefalosporina) los plsmidos R presentan genes que codifican para enzimas beta lactasas (penicilasas, cefalosporinasa) que abren el anillo lactmico y hacen que el antibitico pierda su accin. En el caso de la resistencia generada al cloranfenicol , esta viene dada por una enzima inactivante del mismo, denominada cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT). Uno de los genes que codifica para la CAT forma parte del transposn Tn9 . La presin selectiva contnua va generando nuevos mecanismos de resistencia como la creacin de nuevas enzimas resistentes. RESISTENCIA BACTERIANA Y SU RELACIN CON LA BIOTECNOLOGA La construccin biotecnolgica a gran escala de plantas modificadas genticamente (plantas transgnicas) plantea una serie de problemticas. Una de ellas es la posibilidad de generar resistencia a los antibiticos por parte de las bacterias que habitan el mismo ecosistema. Este fenmeno podra producirse mediante la migracin de genes de resistencia antibitica desde la planta transgnica a las bacterias. Este efecto boomerang (retorno de los genes hacia las bacterias) podra generar bacterias con alta resistencia a los antibiticos, patgenas para el hombre y los animales (Fig 6). El proceso de transgnesis supone la introduccin de un gen extrao, llamado transgn en el genoma de un organismo vivo. Este transgn aportar una ventaja ecolgica, nutricional, farmacutica, o permitir avanzar en las investigaciones sobre regulacin gnica en eucariotas. Para la realizacin de este proceso en los laboratorios de biologa molecular es necesario manipular los genes para obtener la clonacin de los mismos. Esta tcnica exige el uso devectores de clonacin portadores de genes de resistencia a sustancias antibiticas (tabla 2). Nombre del gen Confiere resistencia a: Planta transgnica portadora del gen Bla TEM-1 Penicilina G, ampicilina, amoxycilina Maz aph 3'-2 (NPTII) Kanamicina, neomicina Tomate Aph 3'-3 Amikacina Tomate Aad 9 Estreptomicina, espectinomicina Algodn Tabla 2: genes de resistencia a sustancias antibiticas ms frecuentemente utilizados en los procedimientos de transgnesis en vegetales. Actualmente se ha demostrado que las transferencias de ADN pueden establecerse entre reinos muy alejados como el procariota (bacterias) y el reino vegetal. En este caso estaramos hablando de transferencia entre un organismo eucariota (planta transgnica) y un organismo procariota (bacteria). Dicho proceso se muestra favorecido por el cultivo intensivo de una planta que porta un gen de resistencia a un antibitico provocndose un aumento del nmero de copias de este gen en el ecosistema. En teora este proceso es totalmente viable de ah la preocupacin de las empresas biotecnolgicas destinadas a la produccin de plantas mejoradas por estas tcnicas. La transferencia horizontal de informacin gentica se efecta en tres etapas: a) transferencia del ADN, b) estabilizacin del mismo en un nuevo ser vivo (husped receptor), c) expresin del gen en dicho husped.
Fig 6: Bacterias patgenas (Staphylococcus aureus) que desarrollan una resistencia cada vez mayor a los antibiticos de uso frecuente. Problema preocupante en hospitales de salud humana y salud animal. Cmo puede transferirse un gen de resistencia antibitica desde una planta transgnica a una bacteria? El efecto boomerang del cual hablamos puede producirse por dos mecanismos. El primero de ellos podra ocurrir en el tubo digestivo de animales o seres humanos que ingieren una planta transgnica o un derivado de la misma. Pensemos que en el tubo digestivo encontramos una gran variedad de cepas bacterianas comensales que se encuentran en distintos estados fisiolgicos. Algunas bacterias podran encontrarse en estados de competencia donde por permeabilidad pueden recibir un gen codificador de resistencia antibitica liberado por la planta durante la digestin (ej. gen bla TEM-1 de 858 bp). A su vez el contacto ntimo entre las bacterias podra favorecer el intercambio de este material gentico dentro del tubo digestivo (transferencia horizontal entre distintas especies bacterianas) generndose cepas resistentes. El segundo mecanismo mediante el cual puede generarse el efecto boomerang sera el pasaje de genes desde la planta transgnica en descomposicin (races) hacia bacterias del suelo. Este mecanismo se ve favorecido por la resistencia y estabilidad de la molcula de ADN en los suelos y por la eficacia de las bacterias del suelo para incorporar material hereditario. Cmo puede estabilizarse el o los genes de resistencia incorporados? La estabilizacin de dichas secuencias de ADN puede realizarse por la llamada recombinacin homloga entre secuencias que estn a ambos lados del gen de resistencia y el ADN de la clula bacteriana receptora. Holliday en 1964 propone un modelo de recombinacin mediante el proceso de rotura-reunin donde se constituye un ADN hbrido e intervienen una serie de protenas (RecA, RecBCD, ligasas) (fig 7). En este proceso de estabilizacin, el gen se incorporar al cromosoma bacteriano y se transmitir a la descendencia de manera estable. Otro de los procesos de estabilizacin de material gentico extrao puede darse a travs de elementos genticos mviles (transposones) o plsmidos no integrativos. En estos casos la transmisin puede ser vertical (a la descendencia) u horizontal (entre bacterias). Qu alternativas existen para evitar estos problemas? Si bien los genes de resistencia a sustancias antibiticas son los ms utilizados como marcadores de seleccin en las tcnicas de ingeniera gentica, una de las alternativas viables sera sustituir a dichos marcadores por otros menos problemticos. Actualmente se empez a utilizar un gen de resistencia a un herbicida que sera de mayor utilidad en los procesos de seleccin de plantas transgnicas. Otra solucin sera realizar construcciones separadas o sea el gen marcador y el gen de inters (transgn) e integrarlos en sitios diferentes del genoma para posteriormente realizar cruzamientos entre estas plantas transgnicas y seleccionar aquellas que solo heredan el transgn y no el gen marcador. La tercer alternativa consistira en colocar a ambos lados del gen marcador secuencias especiales que posteriormente con la utilizacin de enzimas de restriccin se podran cortar y eliminarlas junto con el gen marcador.
7.1 El genoma microbiano.
El genoma microbiano comprende la secuencia completa de los genes de un microorganismo. Su conocimiento permite una mejor comprensin de la patogenia, con aplicacionesen la prevencin, en el diagnstico y en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Conocidas la dinmica de los mecanismos de invansin, produccin de toxinas, capacidad de adaptacin aecosistemas adversos y otras mltiples posibilidades de variacin, pueden disearse nuevas vacunas ms especficas, as como establecer combinaciones interespecies, o utilizarse bacterias avirulentas de muyfcil cultivo para producir en forma industrial antgenos de grmenes de crecimiento fastidioso. En el campo de los antibiticos, se abren perpectivas hacia lneas absolutamente distintas, con drogascapaces de bloquear determinados pasos en cadenas metablicas vitales. Ya existen mltiples aplicaciones de la gentica en diagnstico microbiolgico, con tcnicas que indudablemente se irnsimplificando y perfeccionando con el conocimiento de la entera secuencia del genoma bacteriano: hibridacin, reaccin de polimeras en cadena, etc. Por ltimo, el conocimiento del genoma tambin permitir lautilizacin benfica, a escala industrial, de algunos microorganismo en la produccin de hormonas, vitaminas, aminocidos y antibiticos
7.1.1 Organizacin de los genes diferencias entre procariotas y eucariotas.
Clula eucariota: La regulacin gentica de los eucariotas, especialmente en los multicelulares se complica por el proceso de diferenciacin que ocurre en los organismos multicelulares. Cada organismo multicelular comienza como una sola clula llamada cigoto que se divide por mitosis. Las clulas se diferencian en variados tipos funcionales utilizando algunos genes e ignorando otros. Los genes hometicos (Homeobox genes) dirigen la organizacin general del cuerpo y la posicin de los rganos en respuesta a un gradiente de molculas regulatorias.
El momento("timing") en que se expresa un determinado gen parece seguir una secuencia, tal como la produccin de hemoglobina fetal en los glbulos rojos de los mamferos, que cambia a hemoglobina adulta poco antes del nacimiento. Claramente la inactivacin de ciertos genes ocurre en cada adulto y ello esta relacionado con el cancer, la prolongacin de la vida y tanto otros Clula procariota: El sistema gentico de los procariotas en mucho ms sencillo de estudiar que el de los eucariotas y condujo a conclusiones fundamentales proveyendo las actuales herramientas de la "ingeniera gentica".
Los procariotas como Escherischia coli y los virus que los infectan fueron y siguen constituyendo una herramienta fundamental para el estudio de la estructura y transmisin de los genes. Entre las ventajas de trabajar con estos organismos encontramos: Menor tamao y mayor nmero de organismos por rea de cultivo Mayor velocidad de reproduccin: Escherischia coli duplica su poblacin en 20, todos los descendientes son clones de la clula original. Son haploides, por lo que cualquier cambio o mutacin se expresa inmediatamente. 7.1.2 FUNCIONES DE LOS PLSMIDOS
La presencia de plsmidos transmisibles confiere a las bacterias propiedades que complementan su capacidad para colonizar ambientes adversos, favorece el intercambio gentico intracelular, y garantiza la diseminacin horizontal de genes de resistencia a antibiticos, y de otras funciones, entre gneros distintos. Los plsmidos sirven como una importante herramienta en laboratorios de gentica y bioqumica, donde son comnmente usados para multiplicar (hacer muchas copias de) o como genes particulares expresos. Muchos plsmidos estn disponibles comercialmente para dichos usos. El gen a ser replicado se inserta en copias de un plsmido el cual contiene genes que hacen clulas resistentes a un antibitico en particular. En el paso siguiente el plsmido es insertado en la bacteria por medio de un proceso llamado transformacin. Luego, la bacteria es expuesta a un antibitico particular. Solo la bacteria que toma copias del plsmido sobrevive al antibitico debido a que el plsmido lo hace resistente. En particular, los genes protectores son expresados (usados para hacer protena) y la protena expresada evita la accin del antibitico. De esta forma, los antibiticos actan como un filtro que seleccionan nicamente la bacteria modificada. Ahora, estas bacterias pueden ser cultivadas en largas cantidades, cosechadas y el plsmido de inters puede ser aislado. Otro uso importante de los plsmidos es fabricar grandes cantidades de protenas. En este se deja crecer la bacteria que contiene el plsmido que encierra al gen de inters. Solo como la bacteria produce la protena que le confiere si resistencia a los antibiticos, este tambin puede ser usado para producir protenas en grandes cantidades desde el gen insertado. Esta es una forma barata y fcil de producir genes o protenas que este codifica de forma masiva, como por ejemplo insulina, o inclusive antibiticos.
Se los clasifica por su funcin:
1) Plsmidos de fertilidad: los cuales contienen tra-genes, ellos son capaces de conjugarse.
2) Plsmidos de resistencia: los cuales contienen genes que pueden constituir resistencia contra antibiticos o venenos. Histricamente conocidos como Factores R, antes de que se entendiera la naturaleza de los plsmidos.
3) Col-plsmidos: los cuales contienen genes que codifican colinas y protenas que pueden matar a otra bacteria.
4) Plsmidos degradativos: los cuales habilitan la digestin de sustancias inusuales como tolueno o cido saliclico.
5) Plsmidos virulentos: los cuales convierten la bacteria en un patgeno
Otra clasificacin en cuanto la funcin de que los plsmidos sean o no transmisibles de una bacteria a otra por medio de contactos intercelulares, se pueden distinguir:
A. Plsmidos Conjugativos (auto transmisible): Que son aquellos que se transfieren entre cepas por medio de fenmenos de conjugacin. Algunos de estos plsmidos no slo se transfieren entre cepas de la misma especie, sino que son capaces de hacerlo entre especies y gneros muy diversos, recibiendo el muy apropiado nombre de plsmidos promiscuos o de amplio espectro de hospedadores, permitiendo transferencia horizontal de informacin gentica entre grupos bacterianos filogenticamente alejados.
B. Plsmidos No Conjugativos: Carentes de esta propiedad de conjugacin. Dentro de esta categora existe un subgrupo, el de los plsmidos movilizables: son aquel no auto transmisible que pueden ser transferidos por la accin de un plsmido conjugativo coexistente en la misma bacteria.
Los plsmidos no suelen ser indispensables para la viabilidad de la bacteria, y muchos de ellos se pierden en ausencia de una presin selectiva. Una bacteria puede ser curada de su(s) plsmido(s), es decir, se le pueden eliminar, bien de forma espontnea, bien por una serie de tratamientos en el laboratorio (incubando las bacterias a temperaturas cercanas a la mxima o por agentes qumicos como el naranja de acridina, que se insertan entre las bases del ADN). La razn de esta curacin de los plsmidos es que esos tratamientos interfieren con su replicacin sin afectar a la replicacin del cromosoma. Esto hace que en sucesivas divisiones de una bacteria, el plsmido se vaya diluyendo en la poblacin resultante.
Los plsmidos no suelen determinar productos esenciales para el crecimiento (por eso son dispensables), pero en la naturaleza parece que resultan favorecidas las bacterias con algn plsmido, quiz porque acarrean ventajas selectivas en determinados ambientes o en determinadas condiciones. Existe una variedad de fenotipos y funciones determinados por plsmido:
Resistencia a antibiticos (plsmidos R; los estudiaremos en la seccin de Gentica). Resistencia a metales pesados (por ejemplo, resistencia a mercurio). Plsmidos de virulencia: produccin de toxinas, factores de penetracin en tejidos, adherencia a tejidos del hospedador, etc., en ciertas bacterias patgenas. Produccin de bacteriocinas (protenas txicas producidas por bacterias que matan a otras de la misma especie). Produccin de siderforos (quelatos para secuestrar iones Fe3+). Utilizacin de determinados azcares. Utilizacin de hidrocarburos, incluyendo algunos cclicos recalcitrantes (degradacin de tolueno, xileno, alcanfor, etc.) en Pseudomonas. Induccin de tumores en plantas (plsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens). Interacciones simbiticas y fijacin de nitrgeno en ciertos Rhizobium.
Funciones celulares codificadas por plsmidos
A. POR TODOS LOS PLSMIDOS 1. Autorreplicacin
B. POR ALGUNOS PLSMIDOS 1. Autotransferencia. 2. Resistencia a agentes antimicrobianos a) Antibiticos: por ejemplo, estreptomicina, penicilina, kanamicina, neomicina, cloranfenicol, tetraciclina. b) Agentes quimioteraputicos sintticos: por ejemplo, sulfamida y trimetoprima. c) Metales pesados: por ejemplos, Ag, Hg y Cd. 3. Produccin de pigmentos. 4. Produccin de toxinas. 5. Funciones catablicas: por ejemplo, degradacin de lactosa, octano y alcanfor. 6. Sensibilidad y resistencia a los fagos. 7. Produccin de antibiticos 8. Produccin de bacteriocina 9. Induccin de tumores vegetales 10. Produccin de H2S 11. Restriccin y modificacin controlada por el hospedador
MECANISMOS DE INTERCAMBIO GENETICO
Aunque en nuestros conocimientos solo sepamos el intercambio genetico de un mismo organismo, es de interes nuestro, saber que los genes tambien pasan en este caso de estudio en bacterias, de unos a otros con mucha frecuencia, pues los genes pueden introducirse en otras bacterias o incluso en otros organismos.
Rasgos generales de la transferencia gentica en bacterias: a) La transferencia es unidireccional, es decir, tiene una determinada polaridad, existiendo clulas donadoras y clulas receptoras. b) La transferencia del genomio de una clula a otra no suele ser total, sinoparcial. c) Parte del material gentico, una vez introducido en la clula receptora, sufre inmediatamente un fenmeno de recombinacin con el genomio de la receptora. El resto del material de la donadora o no se replica, o se ve destruido. d) Como se puede deducir, tras los procesos de transferencia gentica bacteriana, no surge una diploida total (como es el caso en eucariotas), sino una diploida parcial, que recibe el nombre de merodiploida. Las clulas bacterianas diploides parciales reciben la denominacin de merodiploides o merozigotos. Adems, la merodiploida suele ser transitoria. Este tipo de intercambio gentico unidireccional, con diploida transitoria parcial, se denomina meromixia, para distinguirlo de la reproduccin sexual de eucariotas. El genomio de la clula receptora se suele denominar endogenote. La porcin de genomio de la cl. donadora que se transfiere se llama exogenote.
Los procesos de transferencia gentica en bacterias son de tres grandes tipos, ms una variante adicional de uno de ellos:
TRANSFORMACIN: CAPTACIN Y ASIMILACIN DE ADN LIBRE (DESNUDO), A PARTIR DEL MEDIO, POR PARTE DE UNA CLULA RECEPTORA. SE PUEDE DEFINIR COMO LA VARIACIN HEREDITARIA DE UNA CLULA BACTERIANA SUSCEPTIBLE, ORIGINADA POR LA CAPTACIN DE ADN DESNUDO LIBRE EN EL MEDIO, CON LA POSTERIOR RECOMBINACIN DEL EXOGENOTE CON EL GENOMIO DE LA CLULA EN CUESTIN (ENDOGENOTE). TRAS LA TRANSFORMACIN, LA CLULA QUE HA RECIBIDO EL ADN SE SUELE DENOMINAR TRANSFORMANTE Se presenta cuando un gen se adquiere a travs de un plsmido o si se ha entregado al cromosoma de una clula receptora como parte del fragmento de ADN. Al igual que en bacterias Gram-negativas que en Gram-positivas esta transformacin requiere que el ADN libre sea estable y que las clulas receptoras estn capacitados para incorporarlo pues estas receptoras deben presentar en su superficie protenas especializadas que se une al ADN y lo introduzcan al interior, es decir incorporar ADN extracelular.
CONJUGACIN: transferencia directa de material gentico, promovida por un plsmido, desde una clula donadora a otra receptora, por medio de contactos ntimos entre ambas (puentes de unin) , con intervencin de estructuras superficiales especializadas y de funciones especficas. Una variante de la conjugacin es la SEXDUCCIN: en ella, un trozo definido de material gentico de la donadora es transferido como parte de un plsmido conjugativo.
TRANSDUCCIN: el material gentico es transportado desde la cl. donadora a la receptora por medio de un virus bacteriano (o sea, un bacterifago o simplemente, fago), que acta como vector.