1 Terminologa, microscopia y tcnica histolgica

1.1 Citologa/biologa celular, histologa y anatoma microscpica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1

1.1.1 Citologa/biologa celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 1.1.2 Histologa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 1.1.3 Anatoma microscpica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 1.3.3 Corte y coloracin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 1.3.4 Artefactos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9 1.3.5 Preparados de tejidos vivos . . . . . . . . . . . . . . . . . .9

1.4 Tcnicas especiales de la microscopia electrnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9

1.4.1 Microscopia electrnica de transmisin . . . . . . .9 1.4.2 Microscopia electrnica de barrido . . . . . . . . . .11

1.2 . Microscopia

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2

1.2.1 rdenes de magnitud . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 1.2.2 Microscopia ptica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 1.2.3 Microscopia electrnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3

1.3 Realizacin de preparados

. . . . . . . . . . . . . . . . . . .4

1.5 Interpretacin de los cortes histolgicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11 1.6 Reglas bsicas para el diagnstico
. . . . . . . . . . .12

1.3.1 Fijacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 1.3.2 Inclusin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4

Introduccin El presente libro se ocupa de las clulas (citologa/biologa celular), los tejidos (histologa) y los rganos (anatoma microscpica) de los seres humanos, el plano intermedio de la morfologa, entre la macroscopia y la bioqumica. Las conclusiones se desprenden del razonamiento y de la investigacin con los microscopios ptico y electrnico. En este captulo se describen principalmente los aspectos metdicos importantes para la evaluacin crtica de los preparados microscpicos pticos y electrnicos.

1.1 Citologa/biologa celular, histologa y anatoma microscpica

1.1.1 Citologa/biologa celular
En la actualidad el estudio de la clula a menudo recibe el nombre de biologa celular y se ocupa de la estructura y la funcin. La estructura celular se identifica en detalle sobre todo con la ayuda de la microscopia electrnica moderna. La funcin celular puede determinarse mediante los diferentes mtodos de la biologa celular, entre ellos las tcnicas inmunohistoqumicas y citoqumicas. Los detalles fundamentales de la estructura y la funcin de las clulas se presentan en forma abreviada en el captulo 2, dado que la biologa celular desempea un papel importante en todos los captulos: es una clave fundamental para la compresin de todas las funciones de los tejidos y los rganos. El trmino citologa, que antes era sinnimo de biologa celular, se utiliza cada vez menos en este contexto.

1.1.2 Histologa
En sentido estricto la histologa es el estudio de los tejidos. Los tejidos corresponden a un plano intermedio de organizacin del cuerpo y se prestan particularmente bien para el estudio con el microscopio. Los tejidos son asociaciones de clulas con diferenciacin semejante y sus derivados, las sustancias intercelulares (W. Bargmann, 1957), que pueden clasificarse segn determinados criterios. En la actualidad se distinguen cuatro tejidos bsicos: tejido epitelial, tejido conjuntivo (incluidos los tejidos de sostn), tejido muscular y tejido nervioso. Esta clasificacin se remonta a Albert Klliker (1817-1905). Los conocimientos citobiolgicos y ontognicos modernos permiten otras clasificaciones; as, por ejemplo, los lmites entre las clulas tpicas del tejido conjuntivo (los fibroblastos) y algunas clulas del tejido muscular se desdibujan: los llamados miofibroblastos tienen caractersticas especficas de los fibroblastos por un lado y de las clulas musculares por el otro. Las clulas musculares estriadas pueden ser clulas epiteliales y el tejido nervioso exhibe coincidencias

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especficas con el tejido epitelial. Todos los rganos estn compuestos por variantes especficas de los cuatro tejidos bsicos.

Cuadro 1-1 Ejemplos de rdenes de magnitud de diferentes clulas y componentes celulares vulo diferenciado 250-300 m 20-25 m 15-30 m 8 m 7,6 m 2-5 m 1-1,5 m 1-2 m 10-100 nm 20 nm 10 nm

1.1.3 Anatoma microscpica

La anatoma microscpica tambin se conoce como histologa de los rganos, dado que requiere el conocimiento de la citologa y la histologa y lo aplica a los rganos. Consiste en la comprensin de la funciones de los rganos bajo la consideracin concreta de las circunstancias morfolgicas microscpicas pticas y electrnicas. Claro que la anatoma microscpica tambin tiene un lado prctico diagnstico; provee los conocimientos de la estructura microscpica normal, sana, de los rganos que deben dominarse en sus fundamentos y tambin en su desarrollo y en la extensin de su variabilidad para reconocer y comprender las alteraciones patolgicas.

Clula del epitelio intestinal (altura) Clula epitelial del hgado (segn el estado funcional) Linfocitos Eritrocitos Mitocondrias (longitud) Microvellosidades (intestino delgado) Bacterias Virus Partcula de glucgeno (partcula ) Filamento de queratina

1.2 Microscopia
Los microscopios son los instrumentos ms importantes para la identificacin y la comprensin de los principios generales y las particularidades especiales en lo que se refiere a la estructura de las clulas, los tejidos y los rganos. Los microscopios abren dimensiones a las que no tiene acceso el ojo desnudo. El microscopio ptico se invent en el siglo XVII (Antoni van Leeuwenhoek, 1632-1723) y desde entonces se ha perfeccionado en forma incesante. Permite una magnificacin de hasta 1.000 veces (1.000 ). El microscopio electrnico comenz su desarrollo en la dcada del 30 del siglo XX y trajo consigo un aumento considerable de la resolucin ptica. En la prctica rutinaria permite obtener aumentos de bastante ms que 100.000 veces (100.000 ). Los datos siguientes estn orientados hacia los intereses prcticos del estudiante de medicina.

Los rdenes de magnitud de la microscopia electrnica de rutina oscilan entre varios micrmetros y unos pocos nanmetros (nm, 1 m = 1.000 nm). En el cuadro 1-1 se ofrece un panorama general sobre los rdenes de magnitud de diferentes clulas y componentes celulares.

1.2.2 Microscopia ptica

El microscopio ptico comn sigue siendo el instrumento ms importante para la enseanza de la histologa, para el diagnstico clnico y anatomopatolgico y para la investigacin en la biologa celular. Funciona con una fuente luminosa elctrica cuyos rayos iluminan y atraviesan el preparado desde abajo (microscopia de luz transmitida). Un microscopio ptico en esencia est compuesto por una fuente luminosa incorporada en el pie del microscopio, cuya luz atraviesa el preparado y el sistema de lentes del microscopio, un sistema de lentes condensador, una platina, sobre la cual se coloca el preparado histolgico que se desea examinar, objetivos (en la mayora de los casos 3 o 4, ubicados en un dispositivo que rota para colocarlos uno a la vez, a gusto, en el paso de los rayos) y un ocular. Sistemas de diafragmas aumentan la claridad del preparado. El aumento corriente de los objetivos en los cursos de histologa es de 4, 10, 20 y 40 . La imagen aumentada que producen los objetivos se aumenta todava ms por la accin del ocular. El ocular est en la parte superior del microscopio, por donde se mira. El aumento del ocular en la mayora de los casos es de 10 . El aumento total, con el cual puede observarse un preparado, se obtiene del producto entre el aumento del objetivo y el aumento del ocular, o sea, en el ejemplo anterior, 40 (= 4 10) , 100 (= 10 10) , 200 (= 20 10) y 400 (= 40 10) . En la investigacin se utilizan microscopios especiales. Microscopia de contraste de fase El microscopio de contraste de fase es particularmente til para la

1.2.1 rdenes de magnitud

El lmite de resolucin del ojo desnudo es de alrededor de 0,08 mm, por lo cual puede identificar estructuras de no menos de 100 m de dimetro. El microscopio ptico o microscopio de luz tiene un lmite de resolucin de aproximadamente 0,3 m (en la prctica, un aumento de alrededor de 1.000 veces), con lo cual pueden identificarse bien clulas y bacterias. El lmite de resolucin depende de la longitud de onda de la luz. Los rdenes de magnitud habituales de la microscopia ptica oscilan entre unos pocos milmetros (mm) y algunos micrmetros (m, 1 mm = 1.000 m). El microscopio electrnico tiene un lmite de resolucin de alrededor de 0,3 nm; esto permite el estudio de virus y de la ultraestructura de las clulas y de las aglomeraciones proteicas grandes (filamentos citoplasmticos) o los biopolmeros (p. ej., glucgeno).

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observacin de clulas (de cultivos, protozoarios) vivas (no teidas). Intensifica el contraste de las estructuras celulares que apenas son visibles en el microscopio de luz transmitida corriente. El objeto (el preparado) mismo acta como divisor del rayo luminoso para complementar trayectos de ondas luminosas capaces de interferir. Microscopia de interferencia En la microscopia de interferencia (de Nomarski), el haz luminoso se divide antes de atravesar el preparado por la accin de un dispositivo optomecnico especfico. El microscopio de interferencia tambin es particularmente apto para estudiar clulas vivas pero tambin puede aplicrselo para la observacin de preparados inmunohistoqumicos, en los cuales slo estn teidas clulas aisladas y su entorno carece de tincin. Microscopia de fluorescencia Con la ayuda del microscopio de fluorescencia pueden analizarse estructuras celulares autofluorescentes o estructuras a las que se les unen fluorocromos. De una eficacia particular es la microscopia de epifluorescencia, en la cual los rayos excitadores llegan al objeto desde arriba. La tcnica de la inmunofluorescencia indirecta combina la gran sensibilidad de la microscopia de fluorescencia con la especificidad de los mtodos inmunohistoqumicos. Una desventaja puede ser el rpido desvanecimiento de la imagen fluorescente. Microscopia de polarizacin La luz polarizada (que vibra en un solo plano) se utiliza en el microscopio de polarizacin para detectar y analizar estructuras muy bien ordenadas, por ejemplo, fibrillas colgenas de distribucin paralela o fascculos de filamentos de miosina organizados en forma paralela en las bandas A de la clula muscular esqueltica o cardaca. En la luz polarizada estas estructuras con un grado alto de orden se comportan como birrefringentes (anistropas). Brillan con claridad cuando transcurren diagonalmente entre dos filtros de polarizacin cruzados. Los componentes estructurales con un orden irregular se comportan como monorrefringentes (istropos) y permanecen siempre oscuros en el microscopio de polarizacin. Videomicroscopia La videomicroscopia se realiza con la ayuda de una videocmara de gran resolucin. La imagen visible en una pantalla puede manipularse electrnicamente; por ejemplo, las manifestaciones luminosas (seales) muy dbiles y pequeas pueden intensificarse. El procedimiento recibe el nombre de contraste de interferencia diferencial videopotenciado (VE-Dic = Video-enhanced-differential-interference-contrast). Tambin puede aplicrselo con eficacia a clulas vivas y, por ejemplo, puede rastrearse la migracin de partculas minsculas dentro de la clula. Microscopia lser confocal La microscopia lser confocal es un perfeccionamiento de la microscopia

de epifluorescencia. Un haz lser (la mayora de las veces un lser de criptn-argn) barre el preparado. El anlisis se realiza con la ayuda del procesamiento electrnico de la imagen. La estructura especial del microscopio permite el anlisis de preparados gruesos, los cuales pueden descomponerse pticamente en muchos planos (microtomografa). Las imgenes de los planos individuales pueden armarse tcnicamente en una imagen tridimensional.

1.2.3 Microscopia electrnica

Se distinguen los siguientes tipos de microscopios electrnicos: Microscopio electrnico de transmisin Microscopio electrnico de barrido Microscopio electrnico de barrido de efecto tnel El microscopio electrnico de transmisin permite resoluciones que superan mucho la del microscopio ptico. Esto es posible porque en lugar de usarse la luz visible, con su longitud de onda natural, se utilizan haces de electrones, cuya longitud de onda es mucho menor. En los microscopios ptico y electrnico el trayecto de los rayos en principio es semejante. En lugar de lentes de cristal se usan las llamadas lentes electrnicas (bobinas electromagnticas). La fuente de electrones es un ctodo; el haz electrnico es acelerado por alta tensin y transcurre por un tubo al gran vaco. La imagen se observa mediante una lente de aumento binocular sobre una pantalla fluorescente. Con la ayuda del microscopio electrnico de trasmisin (MET) clsico pueden analizarse cortes de tejido pequeos (1-3 mm2), muy delgados (30-80 nm) (cortes ultrafinos), preparados mediante una tcnica costosa y, en la prctica, como continuacin de la microscopia ptica. El MET tambin permite el anlisis de las rplicas finsimas que se preparan en el mbito de los mtodos de criofractura. Microscopio electrnico de barrido Con el microscopio electrnico de barrido (MEB) se observan superficies naturales (o tambin artificiales) de objetos (epitelios, clulas, fibras extracelulares, sustancias duras, rganos, animales enteros, etc.). Antes de la observacin en el MEB el objeto tiene que deshidratarse y cubrirse con una pelcula delgada de metal noble (sombreado). El MEB funciona sin lentes formadoras de imgenes. Un preparado se explora (barre) en lneas secuenciales con un haz de electrones compacto. Para la formacin de la imagen sirven los electrones retrodispersados (electrones secundarios). El detector es un disquillo de centelleo. Las seales luminosas de este disquillo son intensificadas por un fotomultiplicador y retroconvertidas en seales elctricas. La imagen del MEB, que de nuevo se ve en una pantalla fluorescente, aparece sucedneamente a travs de un barredor de lneas.

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Microscopio electrnico de barrido de efecto tnel El microscopio electrnico de barrido de efecto tnel permite el anlisis de superficies con una resolucin atmica. Aqu slo pueden examinarse superficies de barrido minsculas (de alrededor de 1m2).

1.3.2 Inclusin
La preparacin de cortes finos (de alrededor de 5-8 m en los preparados de rutina para la microscopia ptica) de fragmentos de rganos fijados se realiza con la ayuda de instrumentos especiales (micrtomos). Las muestras de tejido fijadas se colocan en un disolvente adecuado para poder incluirlas en parafina lquida y luego cortarlas, una vez que la parafina se solidifica. Como disolvente se usa una serie gradual de alcoholes de concentracin creciente que no slo conduce a la extraccin completa del agua y as a un endurecimiento adicional del objeto sino que al mismo tiempo tambin disuelve la mayor parte de los lpidos de las clulas y los tejidos. En esta fase de la realizacin del preparado hay amplias posibilidades de que aparezcan artefactos, como retracciones y desgarros del tejido. Como medio de inclusin en la microscopia ptica habitualmente se utiliza la parafina o mejor el Paraplast. Se logran preparados histolgicos buenos en particular cuando para la inclusin se utiliza una resina sinttica (p. ej., metacrilato). En el texto que sigue y en los epgrafes de las figuras los preparados incluidos en esta forma se identifican con la palabra plstico. Los cortes de material incluido en plstico tienen un espesor de slo 1-2 m y muestran las estructuras celulares e hsticas ms claramente que los cortes de material incluido en parafina, en los cuales muchas estructuras aparecen superpuestas. En la criomicroscopia tambin se logra el endurecimiento de la muestra de tejido mediante la colocacin de los fragmentos de rganos frescos en nitrgeno lquido y el corte posterior en un micrtomo de congelacin especial, pero se evita la extraccin del agua (deshidratacin) con el peligro de la retraccin del tejido y los solventes que disuelven los lpidos. As, muchos componentes moleculares de los tejidos se mantienen en su configuracin natural y luego pueden demostrarse con mtodos histoqumicos, por ejemplo, las enzimas de la cadena respiratoria. La preparacin de cortes por congelacin puede realizarse con mucha rapidez, de modo que es posible, por ejemplo, efectuar un diagnstico histolgico intraoperatorio.

1.3 Realizacin de preparados

Los mtodos reseados a continuacin se utilizan para realizar los preparados histolgicos habituales en la prctica de la anatoma, la anatomopatologa y la investigacin clnica as como en los cursos de histologa. Una mirada a estas tcnicas tambin debera fomentar el conocimiento y la crtica de los mtodos. Los pasos metodolgicos descritos aqu son consecutivos (fig. 1-1): Fijacin Inclusin Realizacin de los cortes Coloracin.

1.3.1 Fijacin
La fijacin tiene por objetivo: Mantener en la medida de lo posible el tejido en su estado natural y evitar su desintegracin o su autlisis. Endurecer el material y as conseguir una mejor capacidad de corte. Eliminar las bacterias u otros agentes etiolgicos de enfermedades que existan en la muestra para el examen. Muchos medios de fijacin, por ejemplo, la solucin de formaldehdo neutra al 5%, el cido pcrico, el sublimado corrosivo y el alcohol, son precipitantes de las protenas y formadores de redes proteicas. Mediante la alteracin de la estructura de las protenas y otras acciones de los medios de fijacin el estado celular inicial se modifica y se produce una transformacin ms o menos obvia de la estructura natural de la clula viva. El resultado es una llamada imagen de equivalencias de caractersticas constantes, con la cual puede trabajarse con confianza, segn lo demuestra la experiencia de dcadas. Sin embargo, no debe olvidarse nunca que se examinan clulas muertas y con modificaciones qumicas y que es imprescindible reunir intelectualmente los resultados de muchos mtodos diferentes para obtener una imagen de la clula viva y su dinmica. Con frecuencia las muestras de tejido sencillamente se sumergen en las soluciones fijadoras (fijacin por inmersin). Un resultado mejor se consigue con la ayuda de la fijacin por perfusin, mediante la cual el rgano que debe fijarse se infiltra con el medio de fijacin a travs de su propio sistema vascular y as se fija.

1.3.3 Cortes y coloracin

Las muestras cortadas a un espesor de unos 5-8 m con la ayuda de un micrtomo (fig. 1-1) y adheridas con firmeza a portaobjetos deben colorearse para lograr un contraste mejor de los componentes celulares e hsticos individuales. Sin embargo, como las soluciones colorantes habituales son en su mayora soluciones acuosas el corte tiene que desparafinarse y rehidratarse en pasos intermedios adicionales. Luego de este tratamiento previo los diversos elementos celulares e hsticos captan los colorantes de las soluciones con afinidad variable, en lo cual las fuerzas electrostticas entre los

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Obtencin de tejido fresco Montaje del corte coloreado en un medio de montaje bajo un cubreobjetos (preparado durable) Serie alcohlica de concentracin creciente

Fragmento del tejido obtenido Cortes del fragmento aptos para la fijacin Fijacin, p. ej., en formaldehdo

Coloracin de los cortes

Serie alcohlica de concentracin decreciente

Deshidratacin en serie alcohlica de concentracin creciente Inclusin, p. ej., en parafina o Paraplast Bloque de parafina listo

Eliminacin de la parafina con xileno Colocacin y secado del corte sobre un portaobjetos

Corte en micrtomo con cuchilla de acero

Fig. 1-1 Realizacin de preparados. Representacin de los pasos consecutivos que se requieren para obtener, a partir de una muestra de tejido fresco, un corte histolgico coloreado apto para el examen microscpico ptico. (De [1])

colorantes y los componentes celulares e hsticos con frecuencia cumplen un papel decisivo. Los componentes con cargas elctricas negativas (componentes aninicos), como el DNA, captan colorantes bsicos (catinicos), por ejemplo la hematoxilina, y se llaman basfilos. Son basfilos, por ejemplo, el ncleo celular y las granulaciones de Nissl. Los componentes celulares e hsticos con cargas elctricas positivas, o sea los componentes catinicos, captan los colorantes cidos (aninicos) y se denominan acidfilos o eosinfilos, porque el colorante cido de uso ms frecuente se llama eosina. Los colorantes cidos tien, por ejemplo, los eritrocitos y el colgeno. Adems de unas pocas coloraciones de rutina hay una gran cantidad de coloraciones especiales.

Coloracin de rutina La coloracin de rutina tpica es la tincin con hematoxilina y eosina (H-E) (fig. 1-2). La hematoxilina tie de azul violeta los ncleos y las partes del citoplasma con una abundancia de retculo endoplasmtico rugoso. La eosina tie de rojo otras partes del citoplasma as como muchos componentes extracelulares fibrosos. El color azul violeta se debe a la existencia de regiones con carga negativa en el preparado (cidos nucleicos [DNA, RNA], algunas mucinas y proteoglucanos extracelulares). Otras coloraciones de rutina (cuadro 1-2) son la tincin con azn, la tricrmica de Masson (fig. 1-3) y la tricrmica de Goldner (fig. 1-4), las cuales permiten identificar particularmente bien la distribucin del colgeno.

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Las tinciones para elastina tornan visible la elastina de las fibras elsticas (fig. 1-5). Mtodos histoqumicos Entre las tinciones especiales los mtodos histoqumicos ocupan una posicin prioritaria; en el cuadro 1-2 se resean las tinciones de uso frecuente. Con la ayuda de la histoqumica de sustrato y enzima puede demostrarse una gran cantidad de las ms variadas sustancias qumicas definidas, como muchas enzimas, glucgeno, cidos ribonucleico y desoxirribonucleico, protenas, proteoglucanos, lpidos, etc., en el sitio de su ubicacin natural en clulas y tejidos, con lo cual se obtiene una buena idea de los acontecimientos celulares dinmicos (fig. 1-6). En el pasado reciente la inmunohistoqumica ha experimentado un desarrollo especial. Con la ayuda de esta tcnica pueden demostrarse enlaces qumicos especficos, sobre todo de pptidos y protenas, por medio de una reaccin antgeno-anticuerpo (fig. 1-7). Hay varias tcnicas individuales, pero lo fundamental es que el corte de tejido en cual se desea demostrar un componente qumico determinado (un antgeno) siempre se incuba con una solucin que contiene un

anticuerpo especfico contra el antgeno buscado. El anticuerpo se une a los sitios de las clulas o del espacio extracelular en los cuales est el antgeno y as lo demuestra in situ. La visualizacin de la reaccin se consigue de modos diferentes; por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con una sustancia fluorescente o puede demostrarse, en un segundo paso, en una reaccin con otro anticuerpo marcado con una enzima (a menudo peroxidasa). La determinacin de la enzima se realiza entonces con mtodos enzimohistoqumicos clsicos. En la autorradiografa precursores radiactivos del DNA (3H-timidina) o del RNA (3H-uridina) se inyectan en forma intravenosa en animales de experimentacin. Estos precursores se incorporan en los ncleos (DNA) o en el nuclolo o los ribosomas (RNA). Los cortes de tejido se cubren con una emulsin fotogrfica cuyos cristales con contenido de plata se ennegrecen por la radiactividad y marcan los sitios de incorporacin del precursor en cuestin. En el caso de la marcacin de DNA se exponen los ncleos en la fase S. Con este mtodo tambin puede determinarse la velocidad del recambio celular.

Fig. 1-2 Tincin con hematoxilina y eosina (H-E). Ncleos celulares en azul oscuro o violeta; citoplasma y sustancia intercelular en rojo. Glndulas cutneas de un antlope (Aepyceros melampus): 1 glndulas odorferas (apocrinas); 2 glndulas sebceas (holocrinas); 3 tejido conjuntivo. 250 .

Fig. 1-3 Tincin tricrmica de Masson. Semejante a la coloracin con azn (azocarmn + azul de anilina). Fibras colgenas del tejido conjuntivo (1) en azul oscuro; componentes celulares en diversos tonos de rojo. Glndulas cutneas de una antlope (Aepyceros melampus): 2 glndulas odorferas (apocrinas); 3 glndulas sebceas (holocrinas). 250 .

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Cuadro 1-2 Tinciones histolgicas. (De [1]) Tincin Ncleos Citoplasma Fibras colgenas Fibras elsticas

H-E (hematoxilina-eosina)

Azul violeta

Rojo; regiones con abundancia de ribosomas y RER azul violeta Rosa plido a azul tenue

Rojo

Sin tincin o rosa

Azn (azocarmn/azul de anilina/naranja G)

Rojo brillante

Azul

Sin tincin (slo si estn presentes en grandes cantidades, como en las membranas elsticas o los ligamentos elsticos: rojo a azul rojizo)

Para elastina (resorcina-fucsina u orcena)

Negro violeta (resorcinafucsina); rojo pardo (orcena)

van Gieson (hematoxilina frrica/cido pcrico/fucsina cida)

Azul negro

Amarillo a pardusco claro

Rojo

Sin tincin especial (slo si estn presentes en aglomeraciones gruesas, como en las membranas elsticas o los ligamentos elsticos: amarillo) A menudo sin tincin especial (en parte, verdoso a rojo claro)

Tricrmica de Goldner (hematoxilina frrica/azofloxina/verde luz)

Pardo negro

Rojo ladrillo

Verde

Heterocromatina y EH nuclolo azul negro (hematoxilina frrica) de Heidenhain (particularmente apta para la identificacin de algunas estructuras celulares as como de las estriaciones transversales musculares) Tinciones histoqumicas Reaccin del PAS

Algunos componentes, p. ej., centrolos, cinocilios y haces de filamentos intermedios, aparecen de color negro profundo

Sin tincin especial o gris amarillento

Gris tenue

Tincin rojo violeta. El cido perydico forma grupos aldehdo en el glucgeno y en los componentes sacridos de las glucoprotenas. El reactivo de Schiff los tie de rojo violeta. Tincin azul. Diversos componentes con carga elctrica negativa (polianiones), p. ej., moco sulfatado, glucosaminoglucanos, hialuronano. Segn el colorante, p. ej., naranja-rojo o pardo. Lpidos, p. ej., triacilgliceroles o lpidos de las vainas de mielina.

Azul alciano Tinciones para lpidos (p.ej., Sudn III; Sudn negro; aceite rojo O) Tincin de Feulgen para DNA

Tincin prpura. El HCl forma grupos aldehdo en la desoxirribosa, la pentosa del DNA. Los grupos aldehdo reaccionan con el reactivo de Schiff, el cual tie selectivamente de prpura la cromatina que contiene DNA. Tincin azul. El azul de toluidina, un colorante bsico, se une selectivamente a los grupos fosfato de carga negativa del DNA y del RNA. En consecuencia, se tien la cromatina (DNA), el nuclolo y los ribosomas (RNA).

Azul de toluidina (basofilia selectiva)

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2 2
3

4 1
3 1

Fig. 1-4 Tincin de Goldner, coloracin tricrmica de uso corriente que tie las fibras colgenas del tejido conjuntivo (1) de verde turquesa y las porciones celulares de rojo violeta a rojo pardo. Duodeno de un gato: 2 mucosa; 3 glndulas de Brunner en la submucosa. 200 .

Fig. 1-5 Tincin para elastina (resorcina-fucsina), deteccin selectiva de membranas y fibras elsticas (). Arteria muscular humana: 1 luz vascular; 2 membrana elstica interna, compuesta por una lmina elstica gruesa de trayecto ondulado; 3 tnica media; 4 tnica adventicia. 400 .

Fig. 1-6 Tincin con PAS (cido perydico-reactivo de Schiff), identificacin de moco y glucoprotenas neutras, as como glucgeno. Aqu el moco de las clulas mucosas de la glndula submandibular (humana) est teido de prpura intenso; otras estructuras poseedoras de glucoprotenas, entre ellas las membranas basales, aparecen ms tenues. Coloracin de contraste de los ncleos celulares con hemalumbre (tono semejante al de la hematoxilina). 200 .

Fig. 1-7 Determinacin inmunohistoqumica de la citoqueratina 19 (CK19), un componente del citoesqueleto, en un bronquio pequeo humano. Slo una parte de las clulas epiteliales exhibe una reaccin positiva (coloracin parda); en su mayora se trata de clulas basales o clulas en crecimiento. 250 .

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En la hibridacin in situ pueden localizarse cidos nucleicos en el corte histolgico mediante sondas complementarias (oligonucletidos de DNA o RNA marcados radiactivamente o no radiactivamente). Con la hibridacin in situ pueden demostrarse en el corte secuencias de DNA o RNA especficas. El mtodo tambin puede aplicarse en cromosomas, en extendidos celulares o en preparados de cuerpo entero de animales pequeos.

1.3.4 Artefactos
Por razones diversas (p. ej., mala fijacin, soluciones colorantes viejas, mellas en la cuchilla del micrtomo) pueden aparecer alteraciones en los preparados histolgicos (figs. 1-8 y 1-9) que son de causa puramente tcnica y reciben el nombre de artefactos. El conocimiento de estos artefactos es muy importante en el examen de un preparado.
Fig. 1-9 Defecto de corte. Pequeos desgarros del tejido (vlvula artica humana) producidos por una mella en la cuchilla del micrtomo. Resorcina-fucsina; 100 . (De [1])

1.3.5 Preparados de tejidos ivos

Con el microscopio tambin pueden estudiarse clulas y tejidos vivos, lo que lamentablemente por

* *

falta de tiempo casi nunca es posible en los cursos de histologa. En la investigacin la microscopia de clulas vivas, por ejemplo en cultivos celulares, ha experimentado una gran expansin, sobre todo porque se desarrollaron procedimientos microscpicos especiales, como la microscopia de contraste de fase y la microscopia de interferencia, que intensifican el contraste de las estructuras celulares vivas (fig. 1-10). En el microscopio de luz transmitida corriente este contraste es muy dbil pero con el uso de sustancias coloreadas o marcadas con colorantes fluorescentes es posible, entre otras cosas, seguir la dinmica de los procesos de endocitosis o la reestructuracin de las prolongaciones celulares. Las variantes de la microscopia vital son, por ejemplo, la aplicacin de la luz ultravioleta, la microscopia de polarizacin y la microscopia de campo oscuro.

1.4 Tcnicas especiales de la microscopia electrnica

1.4.1 Microscopia electrnica de transmisin

Fig. 1-8 Hendidura por retraccin (*) entre la base del epitelio y el zcalo de tejido conjuntivo de las vellosidades intestinales, el denominado espacio de Grnhagen (yeyuno, humano). Azn; 270 .

En la microscopia electrnica de transmisin se necesitan procedimientos de fijacin particularmente cuidadosos para obtener una imagen lo ms fiel posible al original de la estructura de las clulas vivas. El tejido debe colocarse rpidamente en la solucin fijadora, en lo posible de inmediato o al menos a los pocos minutos de la extraccin o la muerte. Si se trabaja con animales de experimentacin, lo ptimo es la fijacin por perfusin del animal anestesiado. La solucin fijadora es el glutaraldehdo amortiguado y a la fijacin le sigue una posfijacin con tetrxido de osmio. El metal pesado osmio se une a los lpidos y aumenta, por ejemplo, el contraste de las membranas biolgicas. La inclusin se realiza en resinas sintti-

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Terminologa, microscopia y tcnica histolgica

Fig. 1-10 Fibroblastos vivos en un cultivo celular, microscopia de contraste de fase. Adems del ncleo, algunos orgnulos granulares y el lmite celular general, los detalles de la estructura de estas clulas apenas pueden distinguirse. 450 .

cas como Araldita o Epon. Con ultramicrtomos se realizan cortes de 30 a 80 nm de espesor. Estos cortes son tan finos que las estructuras celulares que contienen deben contrastarse (teirse) (fig. 1-11) con acetato de uranilo, citrato de plomo y en ciertos casos cido fosfotngstico. En la investigacin experimental pueden utilizarse sustancias acopladas a metales (oro, hierro, cobre). Los metales en los preparados para la microscopia electrnica de transmisin tienen un gran contraste y, en consecuencia, se identifican bien. As, por ejemplo, en una serie de investigacin temporal se puede seguir el trayecto de un componente invisible en s mismo, como una glucoprotena, desde su captacin en la clula hasta su degradacin. Adems, pueden localizarse componentes moleculares definidos en forma precisa con la ayuda de mtodos diversos, por ejemplo proteoglucanos o glucosaminoglucanos.

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Fig. 1-11 Ultraestructura celular en el microscopio electrnico de transmisin. Clula epitelial del hgado de la rata con un ncleo grande (1) y los orgnulos tpicos. 2 retculo endoplasmtico rugoso; 3 retculo endoplasmtico liso; 4 aparato de Golgi; 5 mitocondrias; 6 lisosomas. Estas clulas contienen mucho glucgeno (7) en forma de inclusiones. En la superficie que forma los canalculos biliares (8) la clula exhibe microvellosidades. Nuclolo. 12.000 .

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En la inmunoelectromicroscopia es posible demostrar in situ en el microscopio electrnico de transmisin sustancias marcadas con oro. En un procedimiento especial, la generacin de contraste negativo, pueden ponerse sobre una pelcula transparente finsima partculas celulares, bacterias o virus. Los objetos se rodean de precipitados de metales pesados, con lo cual aparecen claros en un entorno oscuro. En el mtodo de la criofractura las superficies liberadas de pequeas muestras hsticas congeladas a muy baja temperatura se cubren con una pelcula metlica finsima. La rplica obtenida de ese modo se observa con el microscopio electrnico de transmisin (vanse pp. 20, 32, 34 y 38). Las membranas celulares se parten a lo largo de su centro hidrfobo, de modo que las caras interiores de las hojuelas externa e interna de la membrana quedan libres y pueden analizarse.

siempre hay que tener en cuenta una serie de verdades simples: El corte histolgico provee slo una instantnea, producto del proceso de fijacin, de un todo vivo en cambio continuo. La gran mayora de los cortes representan slo una rodaja finsima de una parte casi siempre pequea de un rgano tal vez muy grande, por ejemplo, el hgado. La no homogeneidad en la distribucin de ciertas estructuras puede hacer a que no siempre se las encuentre en cada corte. El corte histolgico genera una imagen bidimensional plana de las clulas y los tejidos siempre tridimensionales, de cuyo volumen es posible darse una idea slo con la implementacin de tcnicas determinadas (p. ej., el uso de cortes gruesos), en este caso mediante el denominado transenfoque de los cortes. No obstante, las conclusiones inmediatas sobre la forma real de los elementos estructurales de las clulas y los tejidos o de formaciones organizadas superiores en el corte individual slo son posibles en casos excepcionales y slo puede extrarselas con precaucin. Algunos ejemplos simples aclaran esto (fig. 1-13). Para facilitar la comprensin se representan los cortes en los planos diferentes de objetos bien conocidos. Por ejemplo, si un huevo cocido (duro) se corta en sentido transversal en la regin de uno de sus dos polos o se le practica un corte longitudinal muy perifrico en ninguno de esos cortes estar contenida la yema central, lo cual no niega su existencia. Asimismo, los cortes longitudinales o transversales de un tubo recto o curvo dan como resultado imge-

1.4.2 Microscopia electrnica de barrido

La microscopia electrnica de barrido tiene su fundamento en principios propios y permite el anlisis de superficies celulares y epiteliales genuinas (fig. 1-12).

1.5 Interpretacin de los cortes histolgicos

Para poder realizar una evaluacin ms crtica del mensaje y las conclusiones de los cortes histolgicos

Fig. 1-12 Microfotografa electrnica de barrido de polen de avellano. 1.700 .

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Fig. 1-13 Interpretacin de las imgenes de los cortes. Los cortes transversal y longitudinal de un tubo curvo (a) o recto (b), de un huevo de gallina (c) o de una naranja (d) pueden permitir tomados por s solos la deduccin tanto de la forma espacial como de la composicin de cada una de las imgenes en cuestin. (De [6])

nes muy diferentes segn dnde y cmo se incida el tubo. Cabe esperar imgenes de corte muy similares cuando se trata de tubos biolgicos, por ejemplo, los vasos sanguneos o los tbulos renales. Incluso una naranja, que en forma aproximada es comparable con las porciones secretoras (cinos) de las glndulas, al igual que estas da imgenes diferentes segn la orientacin del corte. Las siluetas circulares, exactamente igual en la dimensin microscpica ptica que en la electrnica, pueden derivar, por ejemplo, de cortes transversales de cilindros, esferas, elipsoides o conos. Si todas las siluetas de un preparado son del mismo tamao, esto hablara antes que nada de la existencia de cilindros paralelos del mismo dimetro, dado que es improbable que las otras formaciones posibles, por ejemplo esferas o conos, se hayan seccionado en el mismo sitio de su contorno. Desde hace mucho que la aparicin de dos cortes nucleares en una clula no es una demostracin de binuclearidad sino que casi siempre tiene su origen en un ncleo contorneado que el corte interesa dos veces.

diferencial hay que tener en cuenta algunas reglas bsicas: El preparado siempre tiene que observarse primero a simple vista, dado que ciertos rganos ya pueden diagnosticarse con un alto grado de probabilidad por la orientacin tpica del corte, por ejemplo un corte sagital de la hipfisis, un corte transversal de la suprarrenal o un corte longitudinal del intestino delgado. A continuacin el preparado se mira con el objetivo ms dbil del microscopio. Se buscan principios organizativos concretos: hay una zona interna y una zona externa (correspondientes a mdula y corteza)? Se encuentra una superficie natural (cubierta por epitelio) o una cpsula? Hay regiones con propiedades tintoriales completamente diferentes? Aparece alguna luz? Hay elevaciones regulares de la superficie, por ejemplo, pliegues? Se realiza el examen minucioso de todo el corte con el objetivo ms dbil, es decir que tienen que haberse visto todos sus bordes libres pues slo entonces puede resolverse con seguridad una de las cuestiones ms importantes para el diagnstico diferencial, a saber: hay algn epitelio en algn sitio del preparado? En caso afirmativo, primero se diagnostica con precisin el epitelio, dado que de all ya surge una direccin determinada en la meta del diagnstico diferencial.

1.6 Reglas bsicas para el diagnstico

Para identificar con seguridad un preparado histolgico desconocido y poder realizar su diagnstico

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Esto se aclara con un ejemplo: si se encuentra un epitelio simple cilndrico tericamente habra que pensar en un corte de una parte del tubo digestivo o de la trompa uterina o del tero. Para corroborar el primero de estos dos diagnsticos presuntivos se busca la organizacin en capas tpica del tubo digestivo y con la identificacin de esta puede establecerse con seguridad que el preparado es del tubo gastrointestinal. En cambio, si falta esta estructura estratificada tpica es cierto el segundo de los dos diagnsticos presuntivos. Para confirmarlo, en el epitelio se buscan los posibles cinocilios caractersticos de la trompa uterina y de la mucosa del tero en determinadas fases del ciclo. As se relaciona el resto de los elementos estructurales del corte, por ejemplo, pliegues muy ramificados (trompa uterina) y la invaginacin del epitelio para formar tbulos glandulares (mucosa uterina). Si no hay cinocilios ni glndulas tubulares pero en la superficie aparecen pliegues delgados cubiertos de epitelio simple cilndrico debe considerarse el diagnstico diferencial de vescula biliar. El diagnstico de un preparado histolgico a menudo puede realizarse con el aumento menor y como mucho con un aumento mediano. Un ejemplo tambin lo aclara: en el diagnstico diferencial de las glndulas serosas debe incluirse en las consideraciones el pncreas. Sin embargo, como los islotes de Langerhans, otras veces tan confiables como criterio diagnstico diferencial, son poco frecuentes en la regin de la cabeza y en el proceso unciforme del pncreas y en algunos cortes faltan por completo, hay que pensar en la existencia abundante en los seres humanos de las denominadas clulas centroacinosas como buena caracterstica diferencial frente a todo el

resto de las glndulas serosas. No obstante, en la mayora de los casos la identificacin de estas clulas como tales (para lo que se necesita una resolucin relativamente alta y tambin algo de experiencia) les resulta ms difcil a los principiantes que distinguir un criterio diagnstico diferencial simple, a saber, la ausencia total de conductos estriados en el pncreas. Sin embargo, con el uso de aumentos grandes, a causa de que el sector examinado es demasiado pequeo, esto con frecuencia pasa inadvertido y puede realizarse un diagnstico incorrecto del preparado.

Reglas bsicas para el diagnstico de un preparado histolgico: Primero mrese el preparado a simple vista y determnese si es de un rgano macizo o hueco y si los bordes del corte son artificiales (rectos) o corresponden a superficie naturales. Luego mrese en el microscopio con el aumento menor y determnese si hay una organizacin definida, por ejemplo, en corteza/mdula, en lobulillos o configuraciones luminales determinadas y qu epitelios se encuentran en las superficies naturales. Examnese minuciosamente todo el corte con los aumentos menor y mediano. Procdase a un diagnstico hstico especfico cuidadoso y a la identificacin de los cortes tangenciales y de los artefactos. Slo utilcese gran aumento para los detalles celulares, por ejemplo, para la diferenciacin entre cinocilios y borde en cepillo.

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