MANUAL PARA TOMA Y REMISIN DE MUESTRAS AL LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA PARA LAS ENCEFALOPATAS ESPONGIFORMES TRANSMISIBLES (EETs).

LCV ALGETE

REV. ABRIL 2013

El presente Manual es un documento de trabajo para los Servicios Veterinarios Oficiales de las Comunidades Autnomas. El objetivo de este documento es procurar la Coordinacin entre los diferentes agentes implicados en la vigilancia y diagnstico de las EETs, estableciendo unos criterios uniformes para la toma de muestras y su posterior remisin al Laboratorio Nacional de Referencia (Laboratorio Central de Veterinaria de Algete).

LABORATORIO CENTRAL DE VETERINARIA (LCV) DE ALGETE

CCAA: MADRID Provincia: MADRID Municipio: Algete Direccin: Crta. M106 pKm. 1,4 D.P.: 28110 Telfono: 91 629 03 00 Fax: 91 347 37 78 Directora: Montserrat Agero Garca

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I. VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA DE LAS EETs

1.- VIGILANCIA EN GANADO BOVINO (EEB).

A.- VIGILANCIA ACTIVA. La vigilancia activa recogida en el Programa Nacional de 2013, se adapta a los cambios normativos tanto comunitarios como nacionales relativos a las modificaciones de las edades de los animales objeto de muestreo obligatorio. El programa de seguimiento activo, va encaminado a la bsqueda efectiva de la enfermedad, mediante el control de determinadas poblaciones de animales de consumo y animales de riesgo, no comunicados como sospechosos de una infeccin por una EET. Adems, el objetivo de la vigilancia activa es determinar la evolucin y la prevalencia de la EEB. En el ao 2013 se realizar un seguimiento de las subpoblaciones de animales que se describen a continuacin mediante la realizacin de pruebas de diagnstico rpido en los laboratorios autorizados por las CCAA. A.1. Animales sacrificados para consumo humano: Se realizarn pruebas de EEB a: A.1.1.- Todos los animales nacidos en pases incluidos en el Anexo de la Decisin 2011/358/UE y modificaciones por la que se autoriza a determinados Estados Miembros a revisar su programa anual de seguimiento de la EEB, de los siguientes grupos de edad: a) Mayores de setenta y dos (72) meses siempre que se trate de: 1.- Animales sacrificados de manera normal para el consumo humano, 2.- Animales sacrificados en el marco de la ejecucin del Real Decreto 2611/1996, de 20 de diciembre, por el que se regulan los programas nacionales de erradicacin de 4

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enfermedades de los animales, siempre que en este ltimo caso no presenten signos clnicos de la enfermedad. b) Mayores de treinta y seis (36) meses de edad si se trata de animales que sean sometidos a un sacrificio de urgencia, o aquellos que muestren alguna sintomatologa clnica de alguna enfermedad en la inspeccin ante-mortem, o sean sospechosos de padecer una enfermedad o hallarse en un estado de salud que pueda perjudicar a la salud de las personas salvo los previstos en el prrafo a).2 anterior. A.1.2.- Todos los animales nacidos en pases no incluidos en el Anexo de la Decisin 2011/358/UE y modificaciones y por lo tanto son pases no autorizados a revisar su programa anual de seguimiento de la EEB, de los siguientes grupos de edad: a) Mayores de treinta meses (30) de edad siempre que se trate de: 1.- Animales sacrificados de manera normal para el consumo humano, o 2.- Animales sacrificados en el marco de la ejecucin del Real Decreto 2611/1996, de 20 de diciembre, por el que se regulan los programas nacionales de erradicacin de enfermedades de los animales, siempre que en este ltimo caso no presenten signos clnicos de la enfermedad.

b) Mayores de veinticuatro (24) meses de edad si se trata de animales que sean sometidos a un sacrificio de urgencia, o aquellos que muestren alguna sintomatologa clnica de alguna enfermedad en la inspeccin ante-mortem, o sean sospechosos de padecer una enfermedad o hallarse en un estado de salud que pueda perjudicar a la salud de las personas salvo los previstos en el prrafo a).2 anterior. Este muestreo es el vigente en la fecha de elaboracin del programa (abril 2012). Podr sufrir modificaciones para adaptarse a los nuevos dictmenes cientficos de EFSA y a los cambios en la normativa europea y nacional. Se entiende como sacrificio especial de urgencia, a todo sacrificio ordenado por un veterinario a raz de un accidente o de trastornos fisiolgicos y funcionales graves del animal. El sacrificio especial de urgencia podr tener lugar fuera del matadero
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cuando el veterinario considere que el transporte del animal resulta imposible o supondra sufrimientos intiles para el animal. Se entiende como animales que muestren signos clnicos de alguna patologa detectada en la inspeccin ante mortem, aquellos animales que, tras sufrir la inspeccin ante mortem, presenten sntomas, estn afectados o sean sospechosos de alguna enfermedad transmisible al hombre o a los animales (excluyendo las EETs, en cuyo caso se consideraran sospechosos de EETs), as como los animales con sntomas de una enfermedad o perturbacin de su estado general que pueda motivar que sus carnes sean inadecuadas para el consumo humano. La consideracin que tengan estos animales de aptos para consumo humano ser determinada por los servicios veterinarios del matadero, en base a la normativa en vigor. Se exceptuaran de esta consideracin, los animales sin sntomas clnicos de la enfermedad, sacrificados en el marco de una campaa de erradicacin de enfermedades de las establecidas en el Real Decreto 2611/1996, que sern considerados en el epgrafe que corresponde en funcin del destino final de esas canales. A.2. Animales muertos y no sacrificados para consumo humano mayores de cuarenta y ocho (48) meses: Se realizarn pruebas de la EEB a todos los animales bovinos mayores de cuarenta y ocho meses de edad que hayan muerto o hayan sido sacrificados, pero que no fueron sacrificados en el marco de una epidemia, como es el caso de la fiebre aftosa. No obstante, si se trata de animales nacidos en pases no recogidos en el anexo de la Decisin 2011/358/UE y modificaciones, se realizarn pruebas de la EEB a todos los animales bovinos mayores de veinticuatro meses. Se incluyen especficamente las siguientes subpoblaciones: - Animales bovinos muertos en explotacin o durante el transporte. - Animales bovinos que hayan sido sacrificados, pero no para consumo humano ni en el marco de una epidemia, bien en explotacin o, excepcionalmente, en matadero hasta que se disponga de establecimientos o instalaciones especficas, incluidos animales de campaas de erradicacin de enfermedades de las establecidas en el
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Real Decreto 2611/1996, desvieje o similares no destinados a consumo humano. NOTA: Todo animal que, habiendo mostrado sntomas compatibles con la EEB, muera o se sacrifique en la explotacin, ser clasificado dentro de la subpoblacin de animal sospechoso, y por lo tanto se tratar como se describe en el apartado B a continuacin. Los animales bovinos sacrificados como aplicacin de las medidas de erradicacin de un foco de EEB, y pertenecientes a la poblacin de riesgo (descendientes y cohorte de edad) se muestrearn todos en base a la investigacin epidemiolgica que se realice en ese foco. En caso de que el resultado de las pruebas rpidas realizadas fuera positivo o dudoso, se remitir la muestra para su anlisis mediante pruebas de confirmacin al Laboratorio Nacional de Referencia para las EET (LCV Algete). B.- VIGILANCIA PASIVA. La vigilancia pasiva de la enfermedad consiste, bsicamente, en la deteccin de animales positivos debido a la comunicacin por parte de veterinarios o ganaderos/responsables de los animales o de la aparicin de animales con sintomatologa clnica compatible con EETs. Todos los animales sospechosos por sintomatologa (definidos en el apartado 4.6. B del Programa Nacional de Vigilancia para la EEB) se sometern a control, independientemente de su edad, mediante pruebas de confirmacin en el Laboratorio Nacional de Referencia para las EET (LCV Algete). Se sometern a control mediante establecidas en el Manual OIE: pruebas de confirmacin,

B.1.- Todos los animales sospechosos por sintomatologa (todo animal vivo, sacrificado o muerto que presente o haya presentado anomalas neurolgicas o de comportamiento o trastorno del SNC, con respecto a los cuales no se pueda establecer otro diagnstico a tenor de un examen clnico, de la respuesta a un tratamiento, de un examen post mortem o tras un anlisis de laboratorio ante o post mortem).

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B.2.- Todos los animales de los grupos A1 y A2 antes especificados, cuya muestra haya resultado positiva o dudosa a test rpidos en los laboratorios autorizados. En todo momento, los animales descritos como sospechosos de padecer una EET (apartados B1 y B2) se sometern a control mediante mtodos y protocolos de confirmacin, establecidos en el Manual OIE. Cuando el resultado del examen histopatolgico sea dudoso o negativo, o cuando el material se haya autolisado, los tejidos se sometern a examen segn uno de los otros mtodos de diagnstico establecidos en el citado Manual (inmunocitoqumica, inmunotransferencia, demostracin de las fibrillas caractersticas mediante microscopa electrnica o una combinacin de tests rpidos) definidos en el punto C.2,, descrito a continuacin. Estas muestras han de remitirse al Laboratorio Nacional de Referencia de EETs.

C. PRUEBAS A REALIZAR EN LA ESPECIE BOVINA.

C.1. PRUEBAS DE DIAGNSTICO RPIDO. Las autorizadas para la especie bovina en el punto 4 del Captulo C del Anexo X del Reglamento 999/2001. prueba de inmunotransferencia basada en un procedimiento de Western blot para la deteccin del fragmento PrPRes resistente a la proteinasa K (Prionics-Check Western test), prueba ELISA de quimioluminiscencia con un procedimiento de extraccin y una tcnica ELISA donde se utilice un reactivo quimioluminiscente intensificado (Enfer test y Enfer TSE Kit version 2.0, preparacin de la muestra automatizada), inmunoanlisis basado en una microplaca para la deteccin de PrPSc (Enfer TSE version 3), inmunoanlisis de doble anticuerpo (mtodo sndwich) para la deteccin de la PrPRes (protocolo de ensayo corto), efectuado tras una fase de desnaturalizacin y otra de concentracin (Bio-Rad TeSeE SAP Rapid test),

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inmunoanlisis basado en una microplaca (ELISA) para la deteccin de PrPRes resistente a la proteinasa K con anticuerpos monoclonales (Prionics-Check LIA test), inmunoanlisis en el que utilice un polmero qumico para la captura selectiva de PrPSc y un anticuerpo de deteccin monoclonal dirigido contra regiones conservadas de la molcula PrP (IDEXX HerdChek BSE Antigen Test Kit, EIA e IDEXX HerdChek BSE-Scrapie Antigen Test Kit, EIA), inmunoanlisis de flujo lateral que utilice dos anticuerpos monoclonales diferentes para la deteccin de fracciones de PrP resistentes a la proteinasa K (Prionics Check PrioSTRIP), inmunoanlisis de doble anticuerpo que utilice dos anticuerpos monoclonales diferentes dirigidos contra dos epitopos presentes en la PrPSc bovina en estado muy desplegado (Roboscreen Beta Prion BSE EIA Test Kit), prueba ELISA de doble anticuerpo (mtodo sndwich) para la deteccin de PrPSc resistente a la proteinasa K (Roche Applied Science PrionScreen).

C.2. PRUEBAS DE CONFIRMACIN.

Se sometern inmediatamente a mtodos y protocolos de confirmacin todos los animales de los grupos A1 y A2 de vigilancia activa cuyo resultado haya sido dudoso o positivo as como todos los animales sospechosos por sintomatologa definidos en el apartado 4.6_B, siendo los mtodos de confirmacin los descritos en la ltima edicin del Manual OIE y en el reglamento de la Unin Europea 162/2009: mtodo inmunohistoqumico, inmunotransferencia SAF o una alternativa autorizada por la OIE, observacin de las fibrillas caractersticas por microscopa electrnica, examen histopatolgico o combinacin de pruebas de diagnstico rpido. Cuando el resultado del examen histopatolgico sea dudoso o negativo, o cuando el material se haya autolisado, los tejidos se sometern a examen segn uno de los otros mtodos de diagnstico establecidos en el citado Manual.

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Las muestras para confirmacin se remitirn al LNR para las EETs (LCV Algete). Si el resultado es negativo, el animal ser considerado negativo. En el LNR de Algete se realizarn simultneamente las pruebas de confirmacin que se consideren necesarias entre las que pueden encontrarse: Histopatologa, Inmunohistoqumica, Inmunotransferencia SAF o una alternativa autorizada por la OIE o combinacin de tests rpidos. Cuando el resultado de uno de dichos anlisis en el LNR para las EETs (LCV Algete) sea positivo, se considerar a los animales examinados como positivos a EEB. En el caso de animales positivos a EEB, ser necesario discriminar la cepa de EEB que les afecta, clasificndolos en: EEB tipo Clsico, EEB tipo Low (L) o EEB tipo High (H). Esta discriminacin ser realizada en el LNR para las EETs (LCV Algete) mediante las pruebas moleculares que sean necesarias. Confirmacin de casos sospechosos por tests rpidos. Los tests rpidos de diagnsticos podrn emplearse para un cribado en supuestos casos sospechosos, en caso de ser el resultado positivo o dudoso, y para su subsiguiente confirmacin, se seguirn las siguientes pautas dictadas por el Laboratorio de Referencia Comunitario (LR-UE): La confirmacin se realizar en el Laboratorio Nacional de Referencia para EETs. El segundo test rpido usado debe de incluir tejido de bovino positivo y negativo como control. El segundo test rpido usado debe de ser diferente (dos resultados por el mismo test, son insuficientes para la confirmacin del caso) Si el primer test usado ha sido uno basado en inmunotransferencia, el resultado debe ser documentado y presentado al LCV.

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Uno de los dos test rpidos realizados debe de estar basado en inmunotransferencia. Cuando los resultados de los test rpidos realizados no sean concordantes, la muestra debe ser sometida a uno de los mtodos de confirmacin anteriormente descritos. En caso de realizarse un examen histopatolgico y el resultado es negativo o no concluyente o cuando el material se haya autolisado, los tejidos sern analizados por alguno de los otros mtodos de confirmacin.

Todo animal ser considerado como caso positivo si el resultado de los test rpidos ha resultado positivo o no concluyente, y al menos uno de los mtodos confirmatorios es positivo.

En el Cuadro 1. se presenta el esquema del flujo de muestras hasta el LNR EET.

VIGILANCIA ACTIVA

VIGILANCIA PASIVA
(SOSPECHAS CLNICAS)

LABORATORIO AUTONOMICO PARA PRUEBAS RPIDAS

NEGATIVO

POSITIVO O DUDOSO

LNR EET
(LCV ALGETE)

Cuadro 1. Esquema del flujo de muestras hasta el LNR.

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En el Cuadro 2 se presenta el diagrama de anlisis que se realizan en el LNR de EETs de Algete para la especie Bovina.

Diagrama de Anlisis en Bovino

Toma de muestra

Laboratorio Autorizado
Anlisis por pruebas rpidas Negativo Positivo / Dudoso

Centro Nacional de Referencia de EETs

Anlisis por pruebas rpidas Positivo / Sospechoso / Dudoso Negativo

Centro Nacional de Referencia de EETs

Rechazada

TCNICAS DE CONFIRMACIN

Western Blot Confirmatorio

Combinacin Test Rpidos*

Inmunohistoqumica

Histologa

Negativo

Positivo / EEB Negativo Clsico

Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo / EEB No No Clsico Concluyente Concluyente No Apta

TCNICAS DE DISCRIMINACIN
Western Blot con varios Acs Tratamiento PK

* Eleccin habitual
EEB Clsica EEB Tipo Low EEB Tipo High

Cuadro 2. Diagrama de flujo de anlisis realizados en el LNR de EETs para la especie bovina.

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2.- VIGILANCIA EN GANADO OVINO / CAPRINO (Tembladera).

A.- VIGILANCIA ACTIVA. Se realizar un seguimiento de las subpoblaciones de animales que se describen a continuacin mediante la realizacin de pruebas de diagnstico rpido en los laboratorios autorizados por las CCAA en una muestra de animales que se determinar para cada CCAA en virtud de los requisitos establecidos en los Programas anuales de Vigilancia y Control de EET. A.1 Animales sacrificados para consumo humano, mayores de 18 meses o en cuya enca hayan hecho erupcin 2 incisivos definitivos. A.2 Animales no sacrificados para consumo humano, mayores de 18 meses o en cuya enca hayan hecho erupcin 2 incisivos definitivos: 2.1. 2.2. Animales muertos en explotacin. Animales que hayan sido sacrificados, pero no para consumo humano ni en el marco de una campaa de erradicacin de enfermedades de las establecidas en el Real Decreto 2611/1996. Animales ovinos/caprinos de sacrificio de erradicacin pertenecientes a la poblacin de riesgo (descendientes y cohorte de edad).

2.3.

La muestra ser representativa para cada regin y temporada. La seleccin de la muestra estar destinada a evitar una representacin excesiva de cualquier grupo por lo que se refiere al origen, la especie, la edad, la raza, el tipo de produccin o cualquier otra caracterstica. La edad del animal se estimar en funcin de la dentadura, signos evidentes de madurez u otra informacin fiable. Se evitar, siempre que sea posible, realizar un muestreo mltiple en el mismo rebao.

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NOTA: Todo animal que, habiendo mostrado sntomas compatibles con la EET, muera o se sacrifique en la explotacin, o sea detectado en matadero ser clasificado dentro de la subpoblacin de animal sospechoso, y por lo tanto se tratar como se describe en el apartado B a continuacin.

En caso de que el resultado de las pruebas rpidas realizadas fuera positivo o dudoso, se remitir muestra para anlisis mediante pruebas de confirmacin al Laboratorio Nacional de Referencia para las EET (LCV Algete). B.- VIGILANCIA PASIVA. La vigilancia pasiva de la enfermedad consiste, bsicamente, en la deteccin de animales positivos mediante la comunicacin por parte de veterinarios o ganaderos/responsables de los animales o de la aparicin de animales con sintomatologa clnica compatible con EETs. Todos los animales sospechosos por sintomatologa (todo animal vivo, sacrificado o muerto que presente o haya presentado anomalas neurolgicas o de comportamiento o trastorno del SNC, con respecto a los cuales no se pueda establecer otro diagnstico a tenor de un examen clnico, de la respuesta a un tratamiento, de un examen post mortem o tras un anlisis de laboratorio ante o post mortem) se sometern a control mediante pruebas de confirmacin en el Laboratorio Nacional de Referencia para las EET (LCV Algete). En el apartado II de este manual para la vigilancia epidemiolgica de EET, se describe con detalle el procedimiento de toma, remisin y anlisis laboratorial de las muestras de ovinos y caprinos sospechosos a EET (paginas 20). Para conocer con ms detalle cmo detectar a los ovinos y caprinos que manifiestan un comportamiento o signos clnicos compatibles con encefalopata espongiforme transmisible se recomienda visitar la pgina de internet del laboratorio comunitario de referencia: http://www.defra.gov.uk/corporate/vla/science/science-tse-rltrainref.htm. La sintomatologa es a menudo poco perceptible y quienes mejor pueden identificarla son las personas que se ocupan de los animales a diario. Conviene advertir que hay casos de animales que manifiestan
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slo algunos de estos signos, los cuales pueden tambin variar en intensidad. El porcentaje de casos sospechosos variar segn las situaciones epidemiolgicas y, por tanto, no se puede predecir de manera fiable. No obstante, esta subpoblacin demuestra tener una prevalencia elevada. La identificacin, declaracin y clasificacin precisa de estos animales depender del programa permanente de concienciacin de los ganaderos y veterinarios. Este programa y la calidad de los sistemas de investigacin y anlisis en laboratorio que empleen los Servicios Veterinarios son esenciales para la credibilidad del sistema de vigilancia. C. PRUEBAS A REALIZAR EN LAS ESPECIES OVINA Y CAPRINA PRUEBAS DE DIAGNSTICO RPIDO

C.1.- PRUEBAS DE DIAGNSTICO RPIDO

Las autorizadas para las especies ovina y caprina en el punto 4 del Captulo C del Anexo X del Reglamento 999/2001. inmunoanlisis de doble anticuerpo (mtodo sndwich) para la deteccin de PrPRes (protocolo de ensayo corto), efectuado tras una fase de desnaturalizacin y otra de concentracin (Bio-Rad TeSeE SAP rapid test), inmunoanlisis de doble anticuerpo (mtodo sndwich) para la deteccin de PrPRes con el TeSeE Sheep/Goat Detection kit, efectuado tras una fase de desnaturalizacin y otra de concentracin con el TeSeE Sheep/Goat Purification kit (Bio-Rad TeSeE Sheep/Goat rapid test), inmunoanlisis en el que se utilice un polmero qumico para la captura selectiva de PrPSc y un anticuerpo de deteccin monoclonal dirigido contra regiones conservadas de la molcula PrP (IDEXX HerdChek BSE-Scrapie Antigen Test Kit, EIA), inmunoanlisis de flujo lateral que utilice dos anticuerpos monoclonales diferentes para la deteccin de fracciones de PrP resistentes a la proteinasa K (Prionics Check PrioSTRIP SR (protocolo de lectura visual)).
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C.2.- PRUEBAS DE CONFIRMACIN Las muestras procedentes de Vigilancia Pasiva (sospechas clnicas) se sometern a control mediante mtodos de confirmacin descritos en la ltima edicin del Manual OIE y en el Reglamento 162/2009: mtodo inmunohistoqumico, inmunotransferencia SAF o una alternativa autorizada por la OIE, observacin de las fibrillas caractersticas por microscopa electrnica o examen histopatolgico. Si el examen histopatolgico es dudoso o negativo, los tejidos sern sometidos a otro examen ulterior por uno de los otros mtodos y protocolos de confirmacin. En el caso de las muestras procedentes de la Vigilancia activa, cuando el resultado de la prueba rpida utilizada para el anlisis de las muestras fuera positivo o dudoso, se remitir muestra para anlisis mediante pruebas de confirmacin en los laboratorios autorizados de las CCAA para realizar dichas pruebas o, en su defecto, en el Laboratorio Nacional de Referencia para las EETs (LCV Algete). En estas circunstancias, la muestra se someter a examen mediante uno de los mtodos de confirmacin descritos en la ltima edicin del Manual OIE y en el Reglamento 162/2009: mtodo inmunohistoqumico, inmunotransferencia SAF o una alternativa autorizada por la OIE, observacin de las fibrillas caractersticas por microscopa electrnica, examen histopatolgico. Si con tal fin, se usa un examen histopatolgico que resulta dudoso o negativo, los tejidos sern sometidos a otro examen ulterior por otro de los mtodos y protocolos de confirmacin. En el LNR se realizarn simultneamente las nuevas confirmacin necesarias pruebas de

Para los casos de muestras que necesitan confirmacin y que proceden tanto de vigilancia activa como vigilancia pasiva, si el resultado de la prueba de confirmacin es negativo (a excepcin del anlisis histopatolgico), el animal ser considerado negativo. En el supuesto de que un resultado de uno de los exmenes de confirmacin mencionados sea positivo, los animales se considerarn casos positivos 16

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de EET y se proceder a la realizacin de las pruebas discriminatorias autorizadas por la Unin Europea en el Reglamento 999/2001. Si una CCAA dispusiera de laboratorio autorizado para realizar pruebas de confirmacin y se obtuviera un resultado dudoso o positivo a las mismas, la muestra se remitir al LNR para las EETs (LCV Algete). En el Cuadro 3. se presenta diagrama de los anlisis realizados en el LNR para las especies de ovino y caprino.

Diagrama de Anlisis en Ovino / Caprino

Toma de muestra

Laboratorio Autorizado
Anlisis por pruebas rpidas Negativo Positivo / Dudoso

Centro Nacional de Referencia de EETs

Anlisis por pruebas rpidas Positivo / Sospechoso / Dudoso Negativo

Centro Nacional de Referencia de EETs

Rechazada

TCNICAS DE CONFIRMACIN

Western Blot Confirmatorio

Inmunohistoqumica*

Histologa

Negativo

Negativo Positivo Positivo / No Scrapie atpico Concluyente

Negativo Positivo

No Concluyente

No Apta

TCNICAS DE DISCRIMINACIN
VLA
* Eleccin habitual

CEA Scrapie clsico Scrapie atpico EEB

EEB

Cuadro 3. Diagrama de flujo de anlisis realizados en el LNR para las especies ovina/caprina

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II. TOMA DE MUESTRAS

La toma de muestras se realizar por personal formado especficamente para ello. Las muestras se remitirn al laboratorio a la mayor brevedad, a ser posible dentro de las 48 horas posteriores a la toma de muestras, y mediante un sistema que garantice la llegada de la muestra en adecuadas condiciones de conservacin. Las muestras deben remitirse en envases individuales hermticos e irrompibles, perfectamente identificados y acompaadas de la hoja/s de toma de muestras correspondientes debidamente cumplimentadas. 1. VIGILANCIA PASIVA

La toma de muestras consistir en la extraccin del encfalo completo y de no ser posible, siempre el tronco enceflico completo va foramen magnum, incluyendo cerebelo de acuerdo con el esquema de la Figura 1.

Fig. 1

Una vez realizada la extraccin del tronco del encfalo, debe enviarse en fresco (4 C) al LNR para la realizacin de las tcnicas de confirmacin, descritas en la ltima edicin del Manual OIE: combinacin de test rpidos, western-blot de confirmacin, histologa e inmunohistoqumica; as como tcnicas discriminatorias de cepas tanto de EEB como de Scrapie.

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2. VIGILANCIA ACTIVA

La TOMA DE MUESTRA consistir en:

1. Extraccin del tronco enceflico incluyendo el cerebelo, va foramen magnum. 2. Realizar una seccin longitudinal del mismo siguiendo la lnea media, segn el esquema de la Figura 2, obteniendo 2 secciones simtricas: a. Seccin B1: Muestra en fresco para el diagnstico mediante los tests rpidos en el laboratorio autorizado de cada Comunidad Autnoma. b. Seccin B2: Muestra en fresco para enviar al LNR para la realizacin de las tcnicas de confirmacin descritas en la ltima edicin del Manual OIE: combinacin de test rpidos, western-blot de confirmacin, histologa e inmunohistoqumica; as como tcnicas discriminatorias de cepas tanto de EEB como de Scrapie.

B1

B2

Fig. 2

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SECRETARA DE AGRICULTURA Y ALIMENTACION DIRECCIN GENERAL DE SANIDAD DE LA PRODUCCION AGRARIA

REMISIN de muestras: Seccin B1: Muestra en fresco para el diagnstico mediante los tests rpidos en el laboratorio autorizado de cada Comunidad Autnoma. Enviar al LNR el resto de muestra de esta seccin siempre que sea posible. Seccin B2: Muestra en fresco (4 C) para la confirmacin y/o para discriminacin de cepas de EETs. Enviar al LNR para la confirmacin mediante los mtodos descritos en la ltima edicin del Manual OIE as como la discriminacin de cepas tanto de EEB como de Scrapie. Cerebelo: en todos los casos. Enviar al LNR para la discriminacin de cepas.

SIEMPRE QUE SE ENVIEN MUESTRAS AL LCV DE ALGETE, TANTO EN EL CASO DE LA VIGILANCIA PASIVA COMO EN EL DE LA ACTIVA ES MUY IMPORTANTE RECORDAR QUE:

De acuerdo con las indicaciones del Laboratorio Comunitario de Referencia (AHVLA Weybridge), para poder realizar las diferentes pruebas confirmatorias y/o discriminatorias, la cantidad mnima requerida para la confirmacin por tcnicas de la OIE, ser de 6 gramos. En el caso de ovinos donde la cantidad de muestra tomada es menor, la cantidad debe aproximarse lo ms posible a la requerida.

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DOCUMENTACIN DE ACOMPAAMIENTO DE LAS MUESTRAS.

Las muestras irn acompaadas, como mnimo, de la documentacin que a continuacin se seala. Cuando la muestra sea enviada de un laboratorio a otro, para confirmacin de resultados, se adjuntara tambin copia completa de la documentacin de la misma:

Todas las muestras irn acompaados por la documentacin establecida como Modelo 1 o 2 (segn especie). Adems, para los animales sospechosos se adjuntar la encuesta segn el Modelo 3, que recoge los sntomas detectados. Cuando las muestras sean enviadas desde un laboratorio autorizado de la CCAA al LNR Laboratorio Nacional de Referencia, se adjuntar la documentacin establecida como Modelo 4.

Todos estos modelos estn disponibles en los programas nacionales de vigilancia, control y erradicacin de la Encefalopatas Espongiformes Transmisibles en la direccin web: http://rasve.magrama.es/Publica/Programas/Normativa.asp

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