ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA DESLIGNIFICACIN E HIDRLISIS ENZIMTICA EN LA OBTENCIN DE ALCOHOL A PARTIR DE CSCARAS DE NARANJA Espinoza, N.(1); Garca, D.

(1); Guevara, V.(1); Monteali, A.(1) (1) Estudiantes de la Facultad de Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional Agraria La Molina RESUMEN Esta investigacin se fundamenta en las crecientes industrias que usan cereales y materias primas de consumo directo para la obtencin de alcohol, ya que esto genera una amenaza para la seguridad alimentaria. Por ello, se ve la necesidad de indagar en nuevas fuentes utilizables en dicho proceso, como residuos de diversas industrias, por ejemplo, la hortofrutcula, la cual tras cada fin de produccin desecha grandes cantidades de cscaras, ricas en fuentes de glucosa (sustrato para la fermentacin). Debido a la amplia presencia de lignina en la estructura de las cscaras de naranja y material celulsico, se limita la disponibilidad de molculas de glucosa durante la fermentacin, ya que no son compuestos fciles de atacar por las levaduras (Saccharomyces cereviciae). En esta investigacin se evaluaron cuatro tratamientos (T1, T2, T3 y T4) y los factores evaluados fueron una operacin de deslignificacin y una de hidrlisis enzimtica (usando celulasas), comparadas con un blanco (T4), con el fin de determinar su efecto en la eficiencia de la fermentacin. INTRODUCCIN Las tcnicas actuales de produccin de etanol a partir de cereales y caa de azcar presentan el problema de la seguridad alimentaria. Por otro lado, segn Uyazn y Gil (2003), en el mundo se producen aproximadamente 1600 millones de toneladas por ao de residuos slidos, los cuales generan graves problemas, no slo por el deterioro progresivo del medio ambiente, sino tambin desde el punto de vista econmico puesto que los costos de recoleccin, transporte y disposicin final son cada vez mayores. Al alcohol producido a partir de cscaras de frutos normalmente se le denomina bioetanol. Se est impulsando el estudio de la produccin de bioetanol de tercera generacin, el cual es producido a partir de biomasa lignocelulsica residual, compuesta de acuerdo con Olsson y Hahn-Hiigerdl (1996) por dos polmeros de carbohidratos, la celulosa (35- 50%) y la hemicelulosa (1525%), y un polmero fenlico, la lignina (2025%). El bioetanol de tercera generacin se puede obtener a partir de jarabes glucosados producidos en la hidrlisis de residuos lignocelulsicos. Una de las principales fuentes de la cual se puede obtener jarabe glucosado son las cscaras de frutas que en su gran mayora son consideradas biomasas desvalorizadas. Segn Rincn et. al. (2005), las cscaras de naranja representan aproximadamente del 45 al 60% del peso de la fruta. El alcohol obtenido por fermentacin de estas materias primas que contienen hidratos de carbono, se adapta particularmente bien para sustituir a la gasolina en los motores de encendido por chispa.

El tema del etanol lignocelulsico ha sido investigado ampliamente a nivel internacional. En Japn, Sugimoto et. al. (2008) han desarrollado un proceso para el pre-tratamiento de la biomasa lignocelulsica con ozono para el rompimiento de las molculas de lignocelulosa, con buenos resultados. Por otro lado, Alvear et. al. (2009) muestra que adems existen otros mtodos como tratamientos alcalinos fuertes, que se logran sumergiendo las cscaras molidas en una solucin de NaOH 0.1N luego precipitando la lignina con sulfato de calcio. Adems, no solo la lignina representa un problema durante el acondicionamiento de la materia prima para la fermentacin, sino tambin la disponibilidad de los azcares fermentecibles, ya que la glucosa se encuentra formando parte de las cadenas de celulosa, las cuales predominan en las cscaras. Por ello, se viene investigando en el uso de hidrlisis cidas, alcalinas o enzimticas para la obtencin de dichos azcares, siendo esta ltima va la que probablemente sera la ms eficiente. El objetivo de la presente investigacin fue probar si estos dos factores mencionados (lignina y disponibilidad de azcares) afectan en el rendimiento de la produccin de alcohol; adems de ver si su efecto es debido a la interaccin de ambos o individualmente. MATERIALES Y MTODOS La materia prima necesit pasar por una etapa de lavado, secado y molienda antes de disponerla en los cuatro tratamientos. El secado se realiz en un secador de bandejas a 60C. Se aplic una operacin de deslignificacin y otra de hidrlisis enzimtica. La primera con NaOH 0.1N y precipitacin con sulfato de calcio y, la segunda, con enzimas celulasas a

50C en bao mara por 12-24 horas, en un 2% con respecto a la cantidad de cscara usada. Los tratamientos se codificaron de la siguiente manera: T1, T2, T3 y T4. El flujo de operaciones seguido experimentalmente es el que se muestra en la Figura 1, a continuacin:

Figura 1. Flujo de operaciones para la obtencin de alcohol a partir de cscaras de naranja Adems, para los tratamientos T1 y T3 se midieron los azcares reductores por el mtodo de Fehling, antes de la hidrlisis, despus de la hidrlisis y al final de la fermentacin. Para T2 y T4 solo se midieron antes y despus de la fermentacin. Durante la fermentacin se control la temperatura, Brix y densidad del mosto. Al

final de la fermentacin se determinaron los grados alcohlicos por destilacin del mosto. RESULTADOS Y DISCUSIN Control de las variables que afectan la fermentacin En las Figuras 1 y 2 se muestra la variacin de los parmetros fsicos controlados durante el proceso de fermentacin. Respecto a la densidad se observa que hubo un descenso similar con los tratamientos T2 y T3 (con deslignificacin y sin esta; ambos hidrolizados enzimticamente). Segn Antoni et al., (2007), todos los procesos de fermentacin microbiana requieren de una fuente de energa para alimentar a los microorganismos, generalmente se suministra en forma de azcares. En la tabla 2 se muestra que T2 muestra mayor contenido de azcares en comparacin con las otras muestras debido a que el tratamiento alcalino seguido de una hidrlisis enzimtica aumenta el contenido de azcares fermentecibles.

Kovalev et al. (2012), menciona que los materiales celulsicos pueden ser usados para la produccin de bioetanol previo tratamiento para producir azcares fermentecibles. En las pruebas se comprueba lo expuesto por el autor ya que los tratamientos T1 y T2 en los que se realizaron un tratamiento alcalino poseen mayor contenido de azcares en comparacin con las muestras T3 y T4. La mejora ms importante que ha tenido la hidrolisis enzimtica es la introduccin de la sacarificacin y fermentacin simultnea. Este bioproceso consiste en tres pasos en uno, que son: produccin de celulasas, hidrolisis enzimtica de la lignocelulosa y la conversin del hidrolizado en etanol (Guarnizo et al., 2009). Los resultados obtenidos en el laboratorio conforman la accin de las celulasas en la produccin de alcohol, esto nos levara a la prediccin de que la fermentacin de las muestras T2 y T3 las cuales se les agrego celulasas tendrn un proceso de fermentacin con mayor eficiencia que para las muestras T1 y T4 que no llevaron celulasas.

Figura 1: Variacin de la densidad durante la fermentacin

1.035 Densidad (g/ml) 1.03 1.025 1.02 1.015 1.01 1.005 0 2 4 6 8 Tiempo de fermentacin (das) T1 T2 T3 T4 Brix

Figura 2: Variacin de los Brix durante la fermentacin

9 8 7 6 5 4 0 2 4 6 8 Tiempo de fermentacin (das) T1 T2 T3 T4

Eficiencia de la hidrlisis enzimtica Cuadro 1. Eficiencia de la hidrlisis con celulasas. Tratamiento AR T2 1.05 g/L T3 1.05 g/L AR 2 11 g/L 14 g/L %EH 44.2 57.5

En el cuadro 1 se muestran los resultados de la eficiencia de la hidrlisis. Los azcares reductores antes de la hidrlisis para todas las muestras fue de 1.05 g/L. Se encontr una mejor eficiencia hidroltica cuando la muestra no fue deslignificada que cuando se realiz este proceso. Los resultados obtenidos fueron ms bajos que los reportados por Boluda-Aguilar et al. (2010 y 2013) que para la hidrlisis enzimtica de desechos de limn y mandarina, obtuvo una concentracin de azcares reductores final de entre 19 y 23 g/L. Los azcares reductores se incrementaron an ms cuando se realiza un tratamiento con vapor a alta presin. El rendimiento de azcares reductores obtenido fue menor, en parte, porque solamente se aplic una clase de enzima (celulasa). Mientras que Choi et al. (2013) reportaron que es ms conveniente el uso de un mix de enzimas que incluyan celulasas, hemicelulasas y pectinasas. El contenido celulosa representa aproximadamente el 20% del peso seco de las cscaras ctricas, un porcentaje similar representa la hemicelulosa, la pectina un 12% y la lignina un 8% (Moheno, 2013). Rendimiento de alcohol Cuadro 2. Grados alcohlicos obtenidos con cada tratamiento. Tratamiento T1 T2 T3 T4 Etanol GL 0 1.5 3 0.5

El rendimiento expresado como grado alcohlico se muestra en el Cuadro 2. El mejor rendimiento se obtuvo con el tratamiento 3, es decir, con la aplicacin de enzimas sin efectuar deslignificacin. Esto puede deberse al efecto inhibitorio de los reactivos utilizados en este proceso sobre las levaduras. El tratamiento que solamente recibi deslignificacin, no realiz una fermentacin, probablemente por esta causa. (Choi et al., 2013). CONCLUSIONES Los desechos de frutos ctricos presentan un potencial para la produccin de etanol. La deslignificacin desarrollada en el trabajo constituy un problema para el correcto desarrollo de la fermentacin. EL mejor rendimiento se obtuvo empleando solamente celulasas sin deslignificacin, siendo este de 3GL. BIBLIOGRAFA Antoni, D., Zverlov, V., Schwarz, W. (2007). Biofuels from microbes. Appl microbiol Biotechnol, 77, 23-35. Boluda-Aguilar, M. y Lpez-Gmez, A. 2013. Production of bioethanol by fermentation of lemon (Citrus limon L.) peel wastes pretreated with steam explosion. Industrial Crops and Products, 41: 188-197. Boluda-Aguilar, M., Garca-Vidal, L., GonzlezCastaeda, F. y Lpez-Gmez, A. 2010. Mandarin peel wastes pretreatment with steam explosion for bioethanol production. Bioresource Technology, 101: 3506-3513. Choi, I., Kim, J., Wi, S. Kim, K. y Bae, H. 2013. Bioethanol production from mandarin (Citrus unshiu) peel waste using popping pretreatment. Applied Energy, 102: 204-210.

Guarnizo, F., Martnez, P., Valencia, S. (2009). Pretratamiento de la celulosa y biomasa para la sacarificacin. Scientia Et Technica, 15, (42). 284-289. Kovalev, NG., Rabinovich, GY. y Fomicheva NV (2012). Resource-conserving and zero-waste principles of technologies for producing liquid-phase biosustances. Russian Agricultural Sciences, 38, 4-7. Moheno, M. 2013. Uso de un hidrolizado de cscaras de toronja y dos cepas de levadura para la obtencin de bioetanol. Tesis Ing. Ambiental. Universidad Veracruzana, Mxico.