PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO Se denomina frotis a la extensin que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto

de separar lo ms posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparacin es muy difcil obtener una imagen clara y ntida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los m todos !abituales de tincin que permiten la observacin al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. "a fijacin de una extensin bacteriana !ace que las bacterias queden inactivadas y ad!eridas al vidrio alterando lo menos posible la morfologa y bacteriana y las posibles agrupaciones de c lulas que pudiera !aber. REALIZACIN DEL FROTIS #. $olocar una peque%a gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima gota de agua, que resulta suficiente. &. 'lamear el asa de siembra, tomar, en condiciones as pticas, una peque%a cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota de agua. (emover la mezcla con el asa de siembra !asta formar una suspensin !omog nea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensin bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos. ). Esperar !asta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el porta a la llama del mec!ero. En este caso !ay que tener muc!a precaucin de no calentar demasiado el porta pues las c lulas pueden deformarse o romperse. FIJACIN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS *. +or calor, +asar cinco veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. -ejar enfriar el porta entre los pases. .na vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. "o normal es continuar con el proceso de tincin. TINCIN DEL FROTIS BACTERIANO /. $ubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que indique el protocolo de cada tincin concreta. Suele oscilar entre # y / minutos. En ocasiones el colorante ti%e slo en caliente, por lo que el tiempo que dure su actuacin se deber sostener el portaobjetos con unas pinzas sobre la llama del mec!ero para que !umee el colorante, pero teniendo muc!o cuidado de que no llegue a !ervir ya que se producira la destruccin de las c lulas. 0. "avar la preparacin con agua para eliminar el colorante. Esta operacin se realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el c!orro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre l, pues podra arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la mxima cantidad de agua de los portaobjetos golpendolos por su canto con cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo. 1. Secar el porta, en ning2n caso se debe frotar el porta. 3. 4bservar la preparacin al microscopio llegando !asta el mximo aumento. Si se quiere montar de forma definitiva no se debe usar a!ora el aceite de inmersin. MONTAJE DEFINITIVO DE LA PREPARACIN "a t cnica siguiente es de aplicacin para cualquier preparacin microscpica que se desee montar de forma definitiva. Se anotar en un extremo del portaobjetos el contenido de la preparacin, la fec!a y, en su caso, el nombre del alumno.

5. +asar sucesivamente los portaobjetos por las siguientes soluciones manteni ndolos un mnimo de / minutos en cada ba%o. "a serie de alco!oles puede modificarse en funcin de la disponibilidad de los reactivos, pero el objetivo es que la preparacin quede totalmente des!idratada. Escurrir bien el reactivo antes de introducirlo en el siguiente ba%o. a b c d e 6lco!ol de 178 6lco!ol de 5/8 6cetona pura 6cetona9xilol :#,#; <ilol

#7. =ontar la preparacin. Emplear blsamo de $anad, euparal o alg2n medio de montaje sint tico. .tilizar preferiblemente cubreobjetos de &&x&& mm.

Examen de muestras a m!"r#s"#$!# Examen microscpico directo de las muestras clnicas >o se utiliza ning2n tipo de colorante. Es el montaje directo !2medo o examen en fresco, las muestras se extienden directamente sobre la superficie de un portaobjetos para su observacin. El material que es demasiado espeso para permitir la diferenciacin de sus elementos puede diluirse con igual volumen de solucin salina fisiolgica est ril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material. Este tipo de preparacin se emplea para detectar trofozotos mviles de parsitos intestinales como Giardia, Entamoeba, !uevos y quistes de otros parsitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, !ifas de !ongos, etc En la imagen, Candida sp en un examen en fresco. Examen microscpico de las muestras clnicas levemente modificadas Tincin Simple Sin Tincin

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se ti%en con la misma tonalidad :?inta c!ina, 6zul =etileno de "oeffler, 6zul de lactofenol;. El @idrxido de potasio al #7A :solucin de B4@; permite ver elementos de !ongos ya que el B4@ digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la c lula !u sped, pero no act2a sobre los polisacridos de las paredes celulares de los !ongos. "a tinta c!ina o >igrosina permite observar c lulas levaduriformes capsuladas : Cryptococcus;, sobre todo en "$(. "os polisacridos capsulares rec!azan la tinta c!ina y la cpsula aparece como un !alo claro alrededor de los microorganismos. 6zul de metileno de "oeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de !eces para observar la presencia de leucocitos. En la imagen, Cryptococcus neoformans en una tincin con tinta c!ina. Examen microscpico de las muestras clnicas muy modificadas Tincin Diferencial

Se utilizan varios colorantes combinados. "as estructuras celulares se diferencian en funcin de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitucin qumica.

"os ejemplos clsicos sera la tincin de C(6= o la de Die!l9>eelsen En la imagen, EC> y levaduras en una tincin C(6= Examen de muestras a m!"r#s"#$!#% a t!n"!&n 'RAM "a tincin de Cram es uno de los m todos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del "aboratorio de =icrobiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana :"#"#s( )a"! #s( $#s!t!*#s( ne+at!*#s , etc; se basan justamente en la tincin de C(6= -escripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente, el 'rotis fijado con calor se ti%e # min con Fioleta $ristal, se lava con agua, se cubre con solucin Godada durante # min y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alco!ol etlicoHacetona. Escurrir y cubrir con Safranina :color de contraste; durante &7 seg. "avar y secar. Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dan s $!ristian Cram, quien la desarroll en #3**. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Cram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas :en este caso, los t rminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga el ctrico, sino simplemente designan dos grupos morfologicos distintos de bacterias;. "as bacterias gram9positivas y gram9negativas ti%en de forma distinta debido a las d!,eren"!as "#nst!tut!*as en a estru"tura de sus $aredes "e u ares . "a pared de la c lula bacteriana sirve para dar su tama%o y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. "a pared de la c lula gram9positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Ceneralmente, 37A957A de la pared de la c lula gram9positiva es peptidoglicano. "a pared de la c lula gram9negativa, por otro lado, contiene una capa muc!o ms delgada, 2nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo #7A 9 &7A de la pared de la c lula gram9negativa es peptidoglicano. -ebido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con alg2n detalle la tincin de Cram y las interpretaciones que actualmente se !acen sobre el porqu de su funcionamiento. "as c lulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se ti%en, primero con una solucin de cristal violeta :otros colorantes bsicos no son tan efectivos; y son lavadas despu s para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las c lulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn te%idas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo9yoduro potsico. El ingrediente activo es aqu el I&J el BI simplemente !ace soluble el I& en agua. El I& entra en las c lulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. -e nuevo tanto las c lulas grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despu s la decoloracin, usando una mezcla de alco!ol9acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I&9cristal violeta. 6lgunos organismos :grampositivos; no se decoloran, mientras que otros :gramnegativos; lo !acen. "a diferencia esencial entre esos dos tipos de c lulas est por tanto en su resistencia a la decoloracinJ esta resistencia se debe probablemente al !ec!o de que en el caso de bacterias gram9negativas, la mezcla de alco!olHacetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la c lula :y tambi n puede da%ar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano;. "a delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta9yodo y la c lula se decolora. "as c lulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas :tienen ms peptidoglicano y menos lpido;, no son permeables al disolvente ya que ste des!idrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las mol culas y provocando que el de complejo cristal violeta9yodo quede atrapado dentro de la pared celular. -espu s de la decoloracin las c lulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras.

+ara poner de manifiesto las c lulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. @abitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. -espu s de la coloracin de contraste las c lulas gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules. -eben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Cram, #; El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las c lulas. &; "a decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las c lulas grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. ); $ultivos ms viejo de &* !oras pueden perder su !abilidad de retener el complejo cristal violeta 9 yodo. El carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. 6lgunos organismos son ms grampositivos que otros y algunos son gram9variables, es decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos. T!n"!&n 'RAM% M#r,# #+-a Ba"ter!ana Ga !emos visto que a t!n"!&n de 'RAM aporta dos ideas bsicas para la deficinin KtaxonmicaK de las bacterias, el color que adquieren tras la tincin y la forma que presentan las c lulas bacterianas. En lo relativo a la coloracin, ya !emos explicado anteriormente que !ablamos de microorganismos 'ram. $#s!t!*#s cuando aparecen te%idos de color azul9violeta y de 'ram ne+at!*#s cuando se visualizan de color rojo9rosado. F#rmas )/s!"as en que se puede visualizar la morfologa bacteriana en una tincin C(6=, Cocos =icrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. -iplococos, aparecen por pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tama%o Bacilos grandes variaciones morfolgicas, fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos Espirales :?reponemas, Eorrelias ...; .tilizamos el t rmino +leomorfismo para referirnos a la adopcin de diferentes formas en una misma especie. ZIE0L.NEELSEN 1BAAR2 "as paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos :cidos miclicos; de cadena larga :/7 a 57 tomos de carbono; que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alco!ol9 cido, despu s de la tincin con colorantes bsicos. +or esto se denominan cido9alco!ol resistentes. "as micobacterias como M tuberculosis y M marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido9alco!ol resistencia. "a coloracin clsica de Die!l9>eelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Se !a desarrollado una coloracin de cido9alco!ol resistencia modificada que diferencia las especies de !ocardia :bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen cidos9grasos de unos /7 tomos de carbono;, de los actinomiceos :muy semejantes pero no cido9alco!ol resistentes;. !ocardia

spp son decoloradas por la mezcla cido9alco!ol estndar pero no por un tratamiento ms suave con cido sulf2rico 7,/ a #A. Estos microorganismos se denominan cido9alco!ol resistentes parciales o d biles. El frotis se ti%e durante unos / min con $arbolfucsina aplicando calor suave. "avar con agua. -ecolorar con alco!ol etlico 5/A con un )A de $l@ concentrado. "avar y te%ir durante )7907 seg con 6zul de =etileno :color de contraste;. "avar y secar TINCIN DE ESPORAS 13IRTZ.CON4LIN2 6lgunos g neros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables :agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.; formndose una espora por cada forma vegetativa. 6l finalizar el proceso de esporog nesis, la c lula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. $uando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. "a capacidad de germinar perdura durante a%os. 6lgunas de las bacterias productoras de endosporas son patgenas para el !ombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme inter s. FUNDAMENTO "as endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las !acen resistentes a los factores ambientales adversos. 6dems, estas cubiertas !acen que las esporas aparezcan en el microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin. "a tincin especfica de esporas requiere dos colorantes, #.9 Ferde malaquita, capaz de te%ir las esporas en caliente. &.9 Safranina, colorante de contraste que ti%e las formas vegetativas. "as endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua, y s lo !arn las formas vegetativas, que quedarn te%idas con el segundo colorante. REALIZACIN Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas. Esta tincin es delicada en su realizacin y para poder obtener unos resultados satisfactorios !ay que seguir cuidadosamente las instrucciones. 56 +reparar los frotis bacterianos indicados. 76 ?e%ir con verde malaquita. $on unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del mec!ero de forma que el colorante !umee durante / min. Nota, evitar que la muestra !ierva. 6%adir ms colorante si ste se evaporaJ es importante que la muestra no se seque. 86 "avar con abundante agua el exceso de colorante. 96 ?e%ir con safranina # min. :6 "avar con abundante agua el exceso de colorante. ;6 Secar la preparacin. <6 4bservar la preparacin al microscopio. 6notar la disposicin y la morfologa de las tres especies del g nero Bacillus. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS "a posicin y la morfologa de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carcter taxonmico 2til para diferenciar especies dentro de un mismo g nero.

"as tres bacterias empleadas en esta prctica difieren en la disposicin y morfologa de las endosporas. B. sphaericus posee una endospora esf rica con localizacin terminal y deformante de la c lula vegetativa, por lo que suele ser denominada Ken palillo de tamborK. B. thuringiensis tiene localizada la endospora elipsoidal en el centro de la c lula vegetativa, lo que provoca un abombamiento caracterstico denominado Ken !usoK. B. subtilis forma una espora cilndrica subterminal no deformante

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
Qu es una tincin negativa?

La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas

Negroni Marta Microbiologa estomatolgica, Editorial Mdica Panamericana S. A., Buenos Aires 1999. Liebana Urea J. Microbiologa oral 2 Ed. Interamericana de Espaa Mc Graw-Hill,Madrid, 1995