Actividad Antiadhesiva del biosurfactante pseudofactin II segregada por las bacterias rticas Pseudomonas fluorescens BD5 Resumen Antecedentes:

El Pseudofactin II es un biosurfactante identificado recientemente segregado por Pseudomonas fluorescens BD5, la cepa obtenida de agua dulce del Archipilago rtico de Svalbard. La Pseudofactin II es un compuesto nuevo identificado como un lipopptido cclico con un cido palmtico conectado al grupo amino terminal del octavo aminocido en la mitad del pptido. El grupo carboxlico C-terminal en el ltimo aminocido forma una lactona con el hidroxilo de Thr3 (phospho-Histone H3). La adhesin es la primera etapa en la formacin de la biopelcula y el mejor momento para la accin de los compuestos antiadhesivos y anti-biopelcula. La adsorcin de los biosurfactantes a una superficie ej, vidrio, poliestireno, silicona modifica su hidrofobicidad, interfiriendo con los procesos de adhesin microbiana y deadsorcin. En este estudio se investiga el rol y las aplicaciones del pseudofactin II como un compuesto antiadhesivo para perspectivas medicinales y terapeticas. Resultados: El pseudofactin II disminuyo la adhesin de tres tipos de superficies (vidrio, poliestireno y silicona) de las cepas bacterianas de cinco especies: Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Staphylococcus epidermis, Proteus mirabilis and two Candida albicans. El pretratamiento de la superficie de poliestireno con pseudofactina II 0.5mg/mL inhibi la adhesin bacteriana en un 36-90% y la de C. albicans en 92-99%. La misma concentracin de pseudofactina II desprendi el 26-70% del crecimiento de las biopelculas preexistentes en las superficies previamente no tratadas. Pseudofactin II tambin causo una marcada inhibicin de la adhesin inicial de las cepas E. faecalis, E. coli, E. hirae y C. albicans en catteres de uretra de silicona. La mayor concentracin probada (0.5mg/mL) caus una inhibicin total del crecimiento de S. epidermidis. Inhibicin parcial (18-37%) de las otras bacterias y un 8-9% de inhibicin del crecimiento de C. albicans.

Conclusiones: Pseudofactin II mostr actividad antiadhesiva contra muchos microrganismos patgenos que son potenciales formadores de biopelculas en catteres, implantes y prtesis internas. Ms de 99% de prevencin pudo ser lograda utilizando pseudofactin 0.5mg/mL. Adicionalmente, pseudofactin II dispersado preform biopelculas. Pseudofactin II puede ser utilizado como desinfectante o agente de recubrimiento de superficies contra la colonizacin microbiana en diferentes superficies, ej. Implantes o catteres de uretra. Palabras clave: Biosurfactante, Lipopptido, Adhesin, Biopelcula, Microorganismos uropatognicos.

Las biopelculas, que forman la mayora de los microorganismos en ambientes naturales, son estructuras con baja sensibilidad a las drogas. Muchos laboratorios estn sintetizando o aislando nuevos compuestos que impiden la formacin de biopeliculas o biofilms o provocando su eliminacin. La adhesin es la primera etapa de la formacin de biopelculas y el mejor momento para la accin de los compuestos antiadherentes y anti-biopelcula. Los biosurfactantes se hacen a menudo compuestos muestran propiedades antimicrobianas y antiadherente y algunas veces penetrar y eliminar los biofilms maduros. Surfactantes- anfiflicos y tensoactivos microbianos, metabolitos secundarios de bacterias u hongos que van desde glicolpidos de baja masa molecular, soforolpidos, ramnolpidos y lipopptidos, hasta protenas de alto molecularmass, lipopolisacridos y lipoprotenas, pueden interactuar con las interfaces e inhibir la adhesin de microorganismos a diferentes superficie. Ellos son una alternativa a los agentes tensioactivos sintticos debido a su baja toxicidad y biodegradabilidad. Otro mecanismo de accin biotensioactivo es la permeabilizacin de las clulas bacterianas. El ramnolpido secretada por Pseudomonas sp. S-17 permeabilizaron las clulas gramnegativas y grampositivas, pero se observ una fuerte inhibicin del crecimiento slo en el caso de las bacterias Gram-positivas. Se observ la interrupcin de biopelculas despus de la adicin de ramnolpidos de Pseudomonas aeruginosa y lipopptido de Bacillus spp. Un grupo particular de biotensioactivos, lipopptidos, puede actuar como antibiticos y tambin como agentes antivirales y antitumorales. La surfactina de Bacillus subtilis puede interactuar con las membranas plasmticas de las clulas bacterianas y fngicas que conducen a su interrupcin. Los efectos de biotensioactivos en menor adhesin microbiana y el desapego de diferentes superficies pueden ser convenientemente utilizados en muchos campos, desde la medicina a diversas ramas de la industria, por ejemplo, las actividades antimicrobianas y antitumorales y su actividad superficial y propiedades antiadherentes puede ser adecuado para prevenir la colonizacin microbiana de los implantes o catteres uretrales. Tensioactivos microbianos de Lactobacillus fermentum y Lactobacillus acidophilus adsorbidos del vidrio, reducen el nmero de clulas adherentes uropatgenos de Enterococcus faecalis de 77%. Un agente tensioactivo del Streptococcus thermophilus se ha usado para el control de incrustaciones de placas de intercambiadores de calor en pasteurizadores, ya que retarda la colonizacin de otras cepas termoflicas de Streptococcus responsables de ensuciamiento. Dentro de la coleccin de 132 bacterias morfolgicamente distintos aislados del agua y suelo proveniente del entorno natural alrededor de la Universidad de Wroclaw base cientfica en el archipilago rtico de Svalbard, la Pseudomonas fluorescens BD5 fue identificada como cepa que reduce fuertemente la tensin superficial de su cultura

sobrenadante. Se purific e identificam la estructura qumica de los dos nuevos P. fluorescens BD5 biotensioactivos, pseudofactin I y II. Ambos compuestos son lipopptidos cclicos con un cido palmtico conectado al grupo amino terminal de un octapptido. El grupo carboxlico C-terminal del ltimo aminocido forma una lactona con el hidroxilo de Thr3. el biotensioactivo fue encontrado con estabilidad dentro del intervalo de -20 C a 100 C, tena la tensin superficial mnima (31,5 mN / m) y la concentracin micelar crtica (72 mg / L).La actividad emulcificante y la estabilidad de pseudofactin II fue mayor que la de los tensioactivos sintticos tales como Tween 20 y Triton X-100. El objetivo de este trabajo fue evaluar cmo el pseudofactin II influye en la adherencia y la formacin de biopelculas de microorganismos tales como Escherichia coli, E. faecalis, Enterococcus hirae, Staphylococcus epidermidis, Proteus mirabilis, Vibrio ordalii, Vibrio harveyi y Candida albicans encontrados en el tracto gastrointestinal y urinario. Dado que los efectos de un agente tensioactivo pueden diferir dependiendo de tanto el tipo de microorganismo y del tipo de superficie que se adhiere a, hemos probado su accin sobre la adherencia de los microorganismos patgenos mensionados para tres tipos de superficies, poliestireno, vidrio (como estndar de laboratorio superficies para ensayos de adhesin) y de silicona (utilizado en aplicaciones mdicas, tales como catteres uretrales). Mtodos - Microorganismos y condiciones de cultivo Cepa de P. fluorescens BD5 se obtuvo a partir de agua dulce del archipilago rtico de Svalbard [19] y se mantiene en medio sales minerales MSM (7 g / l de K2HPO4, 2 g / L KH2 PO4, 1 g / l (NH4) 2SO4 0,5 g / L de citrato sdico 2H2O, y 0,1 g / l de MgSO4.7H2O) con 2% de D-glucosa. Las propiedades antimicrobianas y antiadhesivas de pseudofactin II se probaron en varias cepas de patgenos que colonizan el tracto gastrointestinal de animales o dispositivos mdicos. E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 10536, E. coli 17-2 (aislado clnico, Universidad Mdica de Wroclaw), E. faecalis ATCC 29212, E. faecalis JA / 3 (aislado clnico, Universidad Mdica de Wroclaw), E. hirae ATCC 10541, S. epidermidis KCTC 1917, P. mirabilis ATCC 21100 se cultivaron a 37 C y V. harveyi ATCC 14126, V. ordalii KCCM 41669 se cultivaron a 28 C en medio LB (10 g / l Bacto-triptona, 5 g / l de extracto de Bacto-levadura, 10 g / l de NaCl). Dos cepas de hongos, C. albicans ATCC 20231 y C. albicans SC5314 [21], se cultivaron en un 6,7 g / l de base nitrogenada de levadura (YNB, pH 5,5), caldo (Difco Laboratories) que contiene 2% de D-glucosa para pruebas de adhesin. Para prevenir la filamentacin de C. albicans, pre-cultivo se incub a 28 C, mientras que los experimentos con biopelculas se realizaron a 37 C. Se utiliz medio RPMI-1640 (Cambrex, Verviers, Blgica) para la formacin de biopelculas de Candida.

- Aislamiento y purificacin de pseudofactin II: Pseudofactin II producida por P. fluorescens BD5 se obtuvo por extraccin de sobrenadante libre de clulas por acetato de etilo y la evaporacin del extracto bajo vaco. El biosurfactante bruto se separ por RP-HPLC de la misma manera como se inform anteriormente. Fraccin purificada pseudofactin II se sec y se almacen a -20 C para estudios posteriores. La analtica mediante RP-HPLC (datos no mostrados) de pseudofactin II purificado mostr que su pureza era> 99%. - Ensayos antimicrobianos: La actividad antimicrobiana del pseudofactin II aislado se determin por el mtodo de microdilucin en microplacas de plstico de 96 pocillos de fondo plano (Sarstedt, Nmbrecht, Alemania). Brevemente, 50 ul volmenes de medio LB estril doble fuerza (para bacterias) o YNB (para la levadura) se dispensan en los pocillos de una microplaca de 96 pocillos. Posteriormente, 50 l volmenes de pseudofactin II (0,035 a 0,5 mg / ml), solucin en salina tamponada con fosfato (PBS) se aadieron a pocillos de la microplaca y se mezcla con el medio. Los pozos del crecimiento y del control negativo no contenan biosurfactante. Todos los pocillos (excepto los controles negativos) se inocularon con 2 ul de cultivos bacterianos o de levaduras durante la noche (diluido a DO600 = 0,1) en LB o medio YNB, respectivamente, y las microplacas se incubaron durante 24 horas a 37 C o 28 C durante cultivos de bacterias o levaduras, respectivamente. Despus de 24 h de incubacin, se midi la densidad ptica a 600 nm de cada pocillo utilizando un Asys UVM 340 (Biogenet) lector de microplacas. Los porcentajes de inhibicin del crecimiento a diferentes concentraciones pseudofactin II para cada microorganismo se calcularon como:

Donde ODT representa la densidad ptica del pocillo con una concentracin pseudofactin II dado y ODC es la densidad ptica del pocillo de control (crecimiento sin pseudofactin II). Los ensayos se llevaron a cabo tres veces en tres repeticiones. Tratamiento de Preadhesin con pseudofactin II La inhibicin de la adhesin microbiana por pseudofactin II fue probado en placas de 96 pocillos (Sarstedt, Nmbrecht, Alemania). Brevemente, los pocillos de una placa de fondo plano de 96 pocillos estriles se llenaron con 100 ul de 0,035 hasta 0,5 mg / ml pseudofactin II disolvi en PBS(tapn fosfato salino solucin amortiguadora de pH). Las placas se incubaron durante 2 horas a 37 C en un agitador rotatorio (MixMate, Eppendorf, Hamburgo, Alemania) a 300 rpm y, posteriormente, se lav dos veces con PBS. Control negativo (blanco) pozos contena pseudofactin II en la concentracin ms alta probada (0,5 mg / ml) mientras que los pozos de control positivo contenan tampn PBS slo. Los

cultivos de una noche de cepas microbianas se centrifugaron, se lavaron dos veces con PBS (pH = 7,4) y se resuspendieron en PBS a una densidad ptica DO600 = 1,0 para bacteriana y DO600 = 0,6 para las cepas de Candida. Se observ la mayor adherencia sin pseudofactin II en estas densidades pticas (datos no mostrados). Una alcuota de 100 ul de una suspensin microbiana lavada se aadi y se incubaron en los pocillos. Despus de una incubacin de 2 a 37 C en un agitador rotatorio (MixMate, Eppendorf, Hamburgo, Alemania) a 300 rpm clulas no adherentes se eliminaron mediante tres lavados con PBS. A continuacin, las placas se tieron con 0,1% de cristal violeta durante 5 min y se lav de nuevo tres veces con PBS. Los microorganismos adherentes se permeabilizaron y el tinte se resolubiliza con 150 ul de isopropanol-HCl 0,04 N y 50 ul de 0,25% SDS por pocillo. Cristal violeta lecturas de densidad ptica de cada pocillo se tomaron a 590 nm en el Asys UVM 340 (Biogenet) microplaca. Pseudofactin II no afect a la absorcin de control negativo (cristal violeta en blanco pozos). Se calcul la inhibicin de la adhesin microbiana como la inhibicin del crecimiento. Los ensayos se llevaron a cabo tres veces en tres repeticiones. Tratamiento post-adhesin con pseudofactin II

Las placas de 96 pocillos de fondo plano se incubaron durante 2 h en un agitador rotatorio (MixMate, Eppendorf, Hamburgo, Alemania) a 300 rpm con 100 ul de suspensin bacteriana (DO600 = 1,0) y la suspensin Candida (DO600 = 0,6) en PBS a 37 C. Clulas microbianas manuales libres eran eliminado por lavado de los pocillos tres veces con PBS. A continuacin, 100 ul de 0,035 a 0,5 mg / ml pseudofactin II fue aadido a cada pocillo y se incubaron a 37 C durante 2 h en una agitador rotatorio (MixMate, Eppendorf, Hamburgo, Alemania) a 300 rpm. Pocillos de control contenan slo PBS. Las placas se lavaron tres veces, las clulas adherentes fueron fijado con 100 ul de 0,1% de cristal violeta durante 5 min y se lav de nuevo tres veces con PBS. El adherente microorganismos se permeabilizaron y el colorante se resolubilizada con 150 ul de isopropanol-HCl 0,04 N y 50 ul de SDS al 0,25% por pocillo. El violeta cristal ptico densidad de cada pocillo se midi a 590 nm utilizando el lector de microplacas. Los ensayos se llevaron a cabo tres veces en tres repeticiones. El desalojo adhesin microbiana porcentajes en diferentes concentraciones pseudofactin II para cada microorganismo se calcula como: % inhibicin del crecimiento= Donde ODT representa la densidad ptica del pocillo con una concentracin II pseudofactin dado y la ODC densidad ptica del pocillo de control (sin pseudofactin II). Los ensayos se llevaron a cabo tres veces en tres repeticiones.

Microscopa confocal de barrido lser

Microscopia de escaneo lser confocal se utiliz (CLSM) para la visualizacin de la formacin de bacterias y Candida biopelculas en la ausencia o presencia de pseudofactin II (concentracin final 0,25 mg / ml) en el medio de cultivo. Biopelculas bacterianas y de levadura se formaron en Thermanox plstico cubreobjetos (Nalgen Nunc International Co., Rochester, Nueva York), los cubreobjetos de vidrio microscpicas (Menzel- Glaser, Alemania) y segmentos de silicona uretral catteres (Unomedical, Dinamarca) colocados en los pozos de 24 - placas (Nalgen Nunc International Co., Rochester, NY) que contiene medio LB para las bacterias y medio RPMI-1640 medio para la levadura. Los inculos se prepararon como sigue: despus de 24h los cultivos de la noche anterior se recogieron y se resuspendieron a diluciones normalizadas (DO600 = 0,01). Quinientos microlitros inculos se inyecta en los pocillos con los cubreobjetos y se incubaron durante 24 horas a 37 C. Despus de este tiempo, los cubreobjetos se lavaron con PBS durante 15 min. Entonces, las biopelculas bacterianas se tieron durante 30 min a 37 C con 1 ml de 0,6% BacLight Live / Dead viabilidad mancha (Molecular Probes, Eugene, OR) disuelto en PBS, y PBS que contiene concanavalina A-Alexa Fluor 488 (Molecular Sondas, Eugene, Oregn) conjugado (0,025 mg / ml) para las biopelculas de Candida. Las biopelculas teidas se visualizaron por CLSM con un FluoView 500 Olympus (Olympus Optical Co. Ltd., Japn) microscopio. El CLSM utiliza un lser de iones de argn a 480 a 490 nm de excitacin y un filtro de paso de 500 a 635 nm para la banda de emisin. CLSM imgenes fueron procesadas por Olympus FluoView 500 de software. Los ensayos se llevaron a cabo dos veces. Las Imgenes representativas se presentan en la Figura 1. La formacin de biopelculas en catteres uretrales Las cepas de uropatgenos E. coli, E. faecalis, E. hirae y C. albicans, fueron utilizados en estas pruebas. Diez microlitros de volmenes de cultivos de una noche de E. coli ATCC 25922, E. faecalis ATCC 29212, E. hirae ATCC 10541 se aadieron en 1000 ul de medio LB fresco, y el mismo volumen de C. albicans SC5314 se aadi en 1000 ul de fresco medio RPMI-1640. Para el medio se aadi 1,000 ul pseudofactin II (concentracin final 0,25 mg / ml) solucin en medio LB (por bacteriana) y el medio RPMI-1640 para C. albicans y 4 cm de largo segmentos de catteres uretrales de silicona estriles (Unomedical, Dinamarca). Los catteres se incubaron a 37 C durante la noche. Los cultivos se eliminan y los catteres se lavaron con agua destilada. Despus del lavado, se aadi 3,000 l de violeta cristal (0,1%) a los catteres para 20 min. Las biopelculas teidas se lavaron tres veces con agua destilada y se dejaron secar a temperatura ambiente durante 15 min antes del examen. En un experimento paralelo los catteres fueron pretratados con pseudofactin II por ser colocado en un tubo con 2.000 ul de 0,25 mg / ml pseudofactin II disuelto en PBS, se incubaron durante 2 horas a 37 C y posteriormente se lavaron dos veces con PBS.

A continuacin, el experimento se llev a cabo como en el caso de la adicin de pseudofactin II en el medio de crecimiento. Los ensayos se llevaron a cabo dos veces. Imgenes representativas se presentan en la Figura 2. Este experimento se llev a cabo bajo condiciones dinmicas utilizando una bomba peristltica, donde era el flujo de cultivo con o sin pseudofactin II cilindro catteres uretrales 50 ml / h. Conclusiones El biotensioactivo pseudofactin II, producida por la cepa P. fluorescens BD5 se purific por HPLC, mostr que la actividad antiadhesiva contra varios microorganismos patgenos, tales como E. coli, E. faecalis, E. hirae, S. epidermidis, P. mirabilis y C. albicans , que son potenciales formadores de biopelculas en catteres, implantes y prtesis internas. Hasta la prevencin del 99% de C. albicans SC 5314 adherencia se podra lograr por 0,5 mg / ml pseudofactin II. Microscopa confocal de barrido lser confirm la accin de pseudofactin II como un inhibidor de la formacin de biopelculas. Adems, pseudofactin II dispersa biopelculas preformadas. Debido a sus propiedades de tensin superficial y la falta de actividad hemoltica (datos no mostrados), pseudofactin II se puede utilizar como un agente de revestimiento de la superficie contra la colonizacin microbiana de los diferentes superficies, por ejemplo, implantes o catteres uretrales.