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2010 Volumen 2, No.

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Revista Cientfica de la Universidad Autnoma de Coahuila

EXTRACCION DE POLIFENOLES ASISTIDA POR MICROONDAS A PARTIR DE Punica granatum L.


Alejandra Martnez-Ramrez , Juan Carlos Contreras-Esquivel y Ruth Belares-Cerda *. 1. Departamento de Bioqumica de los alimentos. Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad Autnoma de Coahuila. Blvd. Venustiano Carranza, 25,000. Saltillo, Coahuila, Mxico. 2. Centro Kappa de Conocimiento S.C. Saltillo, Coahuila, Mxico *Correo electrnico: ruthy_251m@yahoo.com.mx RESUMEN El aprovechamiento de los residuos agroindustriales generados en nuestro pas, es la pauta para reducir los niveles de contaminacin, as como el empleo de tecnologas que tengas poco impacto ambiental. En el presente trabajo, se empleo la tecnologa de microondas evaluando tiempos de 5, 20 y 30 minutos, as como tres agentes de extraccin (agua y etanol 20 % y 60%) a una temperatura de 40C. El mayor rendimiento en la extraccin de polifenoles totales se obtiene con el empleo de agua y etanol 60% en un tiempo de 30 minutos (3.04 % y 2.93 % respectivamente). INTRODUCCION La granada (Punica granatum), es una fruta nativa de Irn, pero es una fruta que se ha cultivado por todas partes del mundo. (Samadloiy y colaboradores, 2008; Berry 2005). De acuerdo con Berry (2005); Aradhya y colaboradores (2006), reportan que la granada representa una fuente de azucares, vitamina C y de hierro, pero deficiente en calcio. Los compuestos fitoqumicos presentes en la granada, son una gama de compuestos fenolicos, tales como, los flavonoides (antocianinas), taninos condensados (proantocianidinas) y taninos hidrolizables (elagitaninos y galotaninos). (Jaiswal y colaboradores, 2010; Aguilar y colaboradores, 2007). Los compuestos polifenlicos son considerados metablitos secundarios que se encuentran distribuidos por todas las partes de las plantas. (Silva, 1999; Miller y colaboradores, 2000; Melo, 2008; Queiroz, 2008; Soares, 2008) . Son sintetizados en el retculo endoplsmico y son almacenados en vacuolas en el interior de la clula. (Queiroz, 2008) Los alimentos de origen vegetal, como, frutas, vegetales hortalizas y productos de grano entero son considerados como una fuente natural de compuestos antioxidantes. (Kornsteiner y colaboradores, 2005; Sales y colaboradores, 2010). Por lo tanto estos compuestos entran en el organismo humano por medio de la dieta (Neyestani, 2008). Los compuestos polifenolicos poseen propiedades antioxidantes que le confieren caractersticas y participacin en los procesos responsables de color y el sabor astringente de algunos alimentos. (Soares, 2002; Silva y colaboradores 1999; Queiroz y colaboradores, 2002). Tienen la capacidad de precipitar las protenas solubles, inhibir la oxidacin de sustratos, molculas simples o polmeros y de bio-sistemas. (Queiroz, 2002; Soares, 2002). Actan como captadores de radicales libres y en algunas ocasiones en la quelacin de metales. (Vzquez, 2007; Soares, 2002). La actividad antioxidante de los polifenoles se debe a sus propiedades reductoras, que dependen fundamentalmente por el nmero y la posicin de los grupos hidroxilos en la molcula. (Melo y colaboradores, 2008; Miller y colaboradores, 2000). En las ltimas dcadas se han optimizado diferentes mtodos de extraccin que minimicen el dao al medio ambiente, y a su vez que se mejoren los rendimientos de reaccin. La tecnologa de microondas, se ha convertido durante los ltimos aos, en una herramienta que mejora la productividad de los procesos. (Wannberg, 2006; Duvernay, 2005). El microondas trabaja con radiaciones electromagnticas que se encuentran en el rango de 0.3 a 300 GHz ( = 1 hasta 0.001 m). (Wannberg, 2006; Duvernay, 2005; Tsubaki 2008). En comparacin con los mtodos convencionales de calefaccin, las microondas generan calor dentro del material, lo que conduce a velocidades de calentamiento ms rpido y en perodos de tiempos ms cortos. (Fang Li 2010; Duvernay, 2005 Wannberg, 2006.).
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MATERIALES Y METODOS Materia prima. La granada (Punica granatum) variedad California compraron en una tienda de auto servicio en Saltillo Coahuila, Mxico. Preparacin y acondicionamiento de la cscara de granada. Los frutos de granada fueron lavados con agua potable. La cscara de los frutos se retir de manera manual. Una vez separada la cscara, nuevamente se lav con agua potable y se deshidrat en un secador de charolas (Koleff K26, Quertaro, Mxico) a 60C hasta peso constante. Terminado el tiempo de secado, la cscara se tritur con la ayuda de un mortero de porcelana, para posteriormente ser almacenada en bolsas hermticamente cerradas, para evitar alteraciones en su composicin. Extraccin de antioxidantes de cscara de granada asistida por microondas. La cscara de granada seca (5 g) se coloc en un reactor de tefln (240 ml). Para llevar a cabo la reaccin, el reactor de tefln fue colocado en el equipo de microondas (Ethos Synth, Milestone, Bregamo, Italia) conteniendo el volumen del agente extractor (120 ml). Los factores evaluados fueron tiempos de 5, 20 y 30 min, concentraciones de etanol de 0, 20 y 60% y una temperatura de 40C, en las extracciones de cascara de granada. El equipo de microondas controla parmetros como el tiempo, la potencia, presin, temperatura y agitacin. Terminado el calentamiento de las muestras con la energa de microondas, la suspensin fue filtrada a travs tela muselina. Los extractos obtenidos fueron almacenados en frascos protegindolos de la luz y en refrigeracin. El material insoluble (cscara tratada) fue deshidratado a 60C hasta peso constante. Todos los experimentos de extraccin fueron realizaron por triplicado. Evaluacin de procianidinas totales (PT) y taninos condensados (TC) de extractos obtenidos de cscara de granada, (Vermerris, y Nicholson (2009). Los PT y TC en extractos de los residuos agroindustriales fueron estimados por el mtodo colorimtrico de la vainillina-acido sulfrico. En un tubo de ensayo se colocan 500 L de la muestra diluida apropiadamente con 1 ml de la solucin de vainillina-acido sulfrico 70% (comercial con pureza del 95-98%). Los tubos se mezclaron en vortex por 2 min y posteriormente fueron reposados por 15 minutos a 24C. El color de la reaccin es en tonos rosa o rojo cereza dependiendo de la concentracin de taninos condensados. Terminado el tiempo de incubacin se analizan en un espectrofotometreo de UV/visible (Marca VARIAN) a 500 nm. La concentracin de PT y TC se determina con la ecuacin de la recta de la curva patrn de acido glico y catequina de pureza 98% Sigma Aldrich a una concentracin de 100 ppm, respectivamente. Evaluacin de taninos hidrolizables (TH). (Vermerris y Nicholson, 2009). Los taninos hidrolizables (TH) fueron evaluados por el mtodo de fenol-Folin-Ciocalteu. En un tubo de ensaye fueron colocados 400 L de la muestra y 400 L del reactivo de fenol-Folin-Ciocalteu 2N (Sigma). El tubo fue agitado y se dejan reposar por 15 minutos a temperatura ambiente; posteriormente se agregan 400 L de carbonato de sodio (0.01 M) y se diluye la mezcla con 2 mL de agua destilada. Los tonos de coloracin de reaccin estn entre amarillo verdoso y verde oscuro. Las muestras son analizadas en un espectrofotmetro UV/Visible (Marca VARIAN) a 750 nm. La concentracin de TH es determinada de acuerdo a la ecuacin de la recta obtenida de la curva patrn de cido glico (Sigma-Aldrich) 200 ppm. Todos los anlisis fueron realizados por triplicado.

RESULTADOS Y DISCUSIONES Acondicionamiento de cscara de granada. El peso de la cscara de granada en base hmeda correspondi al 47%, mientras que las semillas y el jugo representaron el 53%. Estos resultados indican la alta proporcin de residuos que son generados durante el procesamiento de la granada. La cscara de granada lleg a peso constante luego de secar por 10 horas. El rendimiento de cscara de granada deshidratada con respecto al fruto es de 12.12%. El contenido de humedad y cenizas presente en la cscara de granada deshidratada fue de 0.41 y 3.19%, respectivamente. Extraccin de polifenoles de cscara de granada En la figura 1 se observa la liberacin de cido glico como ndice de taninos hidrolizables luego de exponer a la cscara de granada en presencia de etanol en concentraciones de 0, 20 y 60 % a 40 C. El mayor rendimiento de cido glico fue de 2.89 % con agua en 30 minutos. Por otro lado los rendimientos de etanol 20 y 60% son de 0.94%

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y 2.66% respectivamente. Los resultados obtenidos se ven afectados por la polaridad de los solventes empleados, pues el agua es una molcula muy polar, mientras que la mezcla de etanol- agua es moderadamente polar (J.M Coulson 2003), esto permite que la energa electromagntica se convierta en energa cintica que posteriormente se pierde en calor por friccin de las molculas. Lo anterior permite una mayor liberacin de los compuestos fenlicos. En el caso de la diferencia observada en la concentracin de etanol al 20 % se debe a que solubiliza en menor proporcin los compuestos fenlicos que el etanol que se encuentra en concentraciones de 0 y 60%. No se observa un diferencia significativa entre el empleo de etanol 60%

6 0% /40C 20%/ 40C 60%/ 40C

Acido glico (%)

0 0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (min)

Figura 1. Efecto del tiempo y concentracin de etanol sobre la liberacin de polifenoles de cscara de granada empleando irradiacin por microondas. La liberacin de catequina como ndice de taninos condensados, se representa en la figura 2. En comparacin con los resultados obtenidos en la evaluacin de los taninos hidrolizables, el mayor rendimiento obtenido es de 0.29 % con etanol 60% en 30 minutos. Los taninos condensados tienen estructuras moleculares ms complejas y con mayor peso molecular, lo que dificulta su liberacin, adems de que son menos solubles en agua.

0.6 0% /40C 20%/ 40C 60%/ 40C

0.5

Catequina (%)

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0 0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (min)

Figura 2. Efecto del tiempo y concentracin de etanol sobre la liberacin de polifenoles (catequina) de cscara de granada empleando irradiacin por microondas.

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Yasoubi y col. (2007) llevaron a cabo un estudio de extraccin de polifenoles de cscara de granada empleando calentamiento convencional, fluidos supercrticos y ultrasonido en combinacin con cinco solventes orgnicos (acetona, metanol, etanol, etil acetato y agua). Al utilizar fluidos supercrticos los autores lograron obtener un rendimiento de fenoles totales de 0.32-0.84%. Mientras que al utilizar ultrasounido como tecnologa de extraccin se logr incrementar el rendimiento hasta un 40%, le presente trabajo obtuvo rendimientos mayores a los presentados por Yasoubi y col. (2007). CONCLUSIONES Mediante el empleo de la tecnologa del microondas, para la extraccin de compuestos fenlicos a una temperatura de 40 C, se logran extraer los compuestos fenlicos a partir de la cscara de granada, aunque los rendimientos no se encuentran por debajo de otros mtodos extractivos, es importante optimizar el mtodo. Pues en el estudio se observo que el tiempo es un factor que influye en la mayor liberacin de los compuestos fenlicos. AGRADECIMIENTOS Por el apoyo otorgado para la realizacin de este proyecto dentro del Fondo Mixto de Fomento a la Investigacin Cientfica y Tecnolgica CONACYT-Gobierno del Estado de Coahuila; dentro del marco terico del proyecto: Desarrollo y Aplicacin de una Tecnologa de Proceso de Nanoencapsulado de Antioxidantes Vegetales para Incrementar la Efectividad de Insumos Orgnicos en el Sector Alimenticio COAH-2008-C08-3-117881. REFERENCIAS 1. Johan Wannberg, Karolina Ersmark, Mats Larhed. Microwave-Accelerated Synthesis of Protease Inhibitors. Top Curr Chem (2006) 266: 167198. Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2006. 2. Shuntaro Tsubaki, Hiroyuki Iida, Masahiro Sakamoto, Jun-Ichi Azuma. Microwave Heating of Tea Residue Yields Polysaccharides, Polyphenols, and Plant Biopolyester. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 11293 11299 3. P. Yasoubi, M. Barzegarl, M. A. Sahari andM. H. Azizi. Total Phenolic Contents and Antioxidant Activity of Pomegranate (Punica granatum L.) Peel Extracts. J. Agric. Sei. Technol. (2007) VoL 9: 35-42. 4. Ju-Fang Li, Fang Wei, Xu-Yan Dong, Lu-Lu Guo, Gang-You Yuan, Feng-Hong Huang, Mu-Lan Jiang, Yuan-Di Zhao, Guang-Ming Li, and Hong Chen. Microwave-assisted Approach for the Rapid Enzymatic Digestion of Rapeseed Meal. Food Sci. Biotechnol. 19(2): 463-469 (2010). 5. Cristbal No Aguilar, Antonio Aguilera-Carbo, Armando Robledo, Janeth Ventura, Ruth Belmares, Diego Martinez, Raul Rodrguez-Herrera, Juan Contreras. Production of Antioxidant Nutraceuticals by Solid-State Cultures of Pomegranate (Punica granatum) Peel and Creosote Bush (Larrea tridentata) Leaves. Food Technol. Biotechnol. 46 (2) 218222 (2008). 6. Harold E. Miller, Fred Rigelhof, Leonard Marquart, Aruna Prakash, and Mitch Kanter. Antioxidant Content of Whole Grain Breakfast Cereals, Fruits and Vegetables. Journal of the American College of Nutrition, Vol. 19, No. 3, 312S319S (2000). 7. Sergio Eduardo Soares. Phenolic acids as antioxidants. Rev. Nutr., Campinas, 15(1):71-81, jan./abr., 2002. 8. Margit Kornsteiner, Karl-Heinz Wagner, Ibrahim Elmadfa. Tocopherols and total phenolics in 10 different nut types. Food Chemistry 98 (2006) 381387. 9. Mara Reis SILVA, Maria Aparecida Azevedo Pereira da SILVA. Nutritional aspects of phytates and tannins. Rev. Nutr., Campinas, 12(1): 5-19, jan./abr., 1999. 10. Enayde de Almeida Melo*, Maria Ins Sucupira Maciel, Vera Lcia Arroxelas Galvo de Lima, Rosilda Josefa do Nascimento. Capacidade antioxidante de frutas. Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences vol. 44, n. 2, abr./jun., 2008. 11. Carla Regina Amorim dos Anjos Queiroz, Srgio Antnio Lemos de Morais e Evandro Afonso do Nascimento. Caracterizacao dos taninos da Aroeira-Preta (Myracrodruon urundeuva). R. rvore, ViosaMG, v.26, n.4, p.485-492, 2002. 12. Tirang R. Neyestani. Polyphenols and Immunity. Wild-Type Food in Health Promotion and Disease Prevention. Edited by: F. De Meester and R. R. Watson Humana Press Inc., Totowa, NJ.

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