MICROPROPAGACIN CLONAL DE TRES VARIEDADES DE PIA NATIVAS DE LA REGIN AMAZNICA MEDIANTE CULTIVO DE YEMAS AXILARES Y APICALES

Hctor A. Blanco F., Teresa E. Vargas y Eva de Garca

RESUMEN El presente estudio tuvo como objetivo establecer un sistema de propagacin clonal eficiente de tres variedades de pia (Ananas comosus L., Merr.) autctonas del Amazonas venezolano. Se cultivaron in vitro yemas apicales y laterales de las variedades ERUW CAN (EC), TAB CAN (TC) y GOBERNADORA (GOB). En la fase inicial, explantes (con yemas) fueron descontaminados e inoculados en seis medios con diferentes concentraciones de auxinas, citocininas y tiamina. Se probaron dos valores de pH: 5,8 y 5,4. A las cuatro semanas hubo brotacin de una yema axilar en TC (MI3), yema apical en EC (MI4) y yema axilar en GOB (MI6). Los medios MI1, MI4 y MI6 contenan 5mgl-1 de tiamina, con pH 5,4. Las concentraciones endgenas de auxinas y citocininas difieren en cada una de las tres variedades y no se observ un patrn comn en relacin a las proporciones de auxinas y citocininas requeridas para la induccin de brotes. Solamente se observ brotacin en medios con tiamina 5mgl-1 y pH 5,4 independientemente de la concentracin de auxinas y citocininas presente en los medios. La multiplicacin de los brotes en las tres variedades se obtuvo en medios con iguales concentraciones de auxinas y citocininas. La variedad TC present la mayor cantidad de brotes por explante (9, 18). El sistema de inmersin temporal RITAs increment significativamente la tasa de multiplicacin de los brotes. El enraizamiento de los vstagos se obtuvo in vitro en medios sin sustancias de crecimiento y el traslado a tierra fue exitoso.

Introduccin En Venezuela, la pia (Ananas comosus L., Merr.) es uno de los frutos autctonos que ha mantenido su aceptacin y conservado su cultivo, compitiendo con otras frutas exticas. En el pas, la pia es el sexto rubro vegetal en importancia despus del ar roz, maz, caa de azcar, pltano y banano. A nivel mundial, Venezuela ocupa el puesto nmero 12 entre los principales pases productores con 363.075TM producidas en 2007 (FAO, 2009). En la regin Amaznica venezolana, el cultivo de la pia es llevado a cabo, principalmente, por aborgenes de la etnia Piaroa, localizada en Betania del Topocho, Municipio tures, Estado Amazonas. Esta actividad econmica for-

ma parte de su cultura ancestral. El mecanismo reproductivo de la especie Ananas comosus (Bromeliaceae), es vegetativo (partenocrpico) y la tasa de crecimiento y multiplicacin es lenta. El tiempo requerido para la fructificacin, a partir de la siembra de propgulos, es cercano a un ao (Roostika y Mariska, 2003). La propagacin por el mtodo convencional (vegetativo) de las plantas de pia produce un nmero muy limitado de propgulos, lo cual restringe la disponibilidad de material vegetal para la plantacin a gran escala. Adems de la limitacin del mtodo convencional, los cultivos son atacados por insectos y hongos que producen marchitamiento, fusariosis y la pudricin de la base del tallo, enfermedades que perju-

dican el cultivo afectando negativamente la produccin comercial del fruto (Santos y Matos, 1995; Coppens et al., 1997; Rodrguez et al., 2002). El cultivo in vitro es una alternativa biotecnolgica que permite la propagacin masiva de plantas de pia libres de enfermedades y en tiempos relativamente cortos. El mtodo de micropropagacin ha sido utilizado por diferentes autores, obtenindose diversos protocolos para el establecimiento de cultivo in vitro de la pia (Casale y De Garca, 1987; Sripaoraya et al., 2003; Mogolln et al. , 2004; De Garca et al., 2008; Saucedo et al., 2008). Adems, permite la obtencin de plantas de novo mediante procesos organognicos y embriognesis somtica (Sripaoraya et al., 2003; Firoozabady y Gutter-

son, 2003; Roostika y Mariska, 2003; Firoozabady y Moy, 2004; Amin et al., 2005). En el presente trabajo se tuvo como objetivo establecer un protocolo eficiente de multiplicacin clonal masiva de tres variedades de pia autctonas del Amazonas venezolano, a partir del cultivo in vitro de yemas axilares y/o apicales, aisladas de plantas provenientes de esa regin. El material producido en esta investigacin ser entregado a la comunidad Piaroa para su evaluacin en campo y posterior industrializacin de los frutos. Materiales y Mtodos Material vegetal El material vegetal utilizado en el establecimiento

PALABRAS CLAVE / Amazonas / Ananas comosus / Cultivo in vitro / Pia / Propagacin /

Recibido: 05/04/2010. Modificado: 26/04/2011. Aceptado: 02/05/2011.

Hctor A. Blanco. Licenciado en Biologa y Estudiante del Postgrado en Botnica, Universidad Central de Venezuela (UCV). Asistente de Investigacin, UCV, Venezuela (Proyecto PSUV-03-71617-2009/1).

Teresa Edith Vargas. Licenciada en Biologa y Doctora en Ciencias, UCV, Asistente de Investigacin, Instituto de Biologa Experimental (IBE-UCV) y Profesora, UCV, Venezuela.

Eva de Garca . Licenciada en Biologa, UCV, Venez uela. M.Sc., University of Wisconsin-Madison, EEUU. Doctora en Ciencias, UCV, Venezuela. Profesora, UCV, Venezuela. Direccin: Laboratorio de Bio-

tecnologa Vegetal. Instituto de Biologa Experimental (IBE). Facultad de Ciencias, UCV. Calle Suapure, Colinas de Bello Monte. Caracas 1041. Venezuela. e-mail: evacrisga@hotmail.com

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0378-1844/11/06/437-07 $ 3.00/0

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CLONAL MICROPROPAGATION OF THREE VARIETIES OF AMAZONIAN PINEAPPLE THROUGH CULTURE OF AXILAR AND APICAL BUDS Hctor A. Blanco F., Teresa E. Vargas and Eva de Garca SUMMARY The objective of the present study was to establish an efficient clonal propagation of three varieties of pineapple (Ananas comosus L., Merr.) indigenous to the Venezuelan Amazon. Apical and lateral buds of varieties: ERUW CAN (EC), TAB CAN (CT) and GOVERNOR (GOB), were grown in vitro. In the initial phase, explants (with buds) were decontaminated and inoculated on six different media with various combinations of auxins, cytokinins and thiamine. Two pH values, 5.8 and 5.4, were tested. After four weeks of culture, there was axillary bud sprouting from TC (MI3), apical bud from EC (MI4), and axillary bud from GOB (MI6). The media MI1, MI4 and MI6 contained 5mgl1 thiamine and had pH 5.4. The endogenous concentrations of auxins and cytokinins differed in each of the three varieties, and there was no common pattern in relation to the proportions of auxins and cytokinins required for induction of outbreaks. There was sprouting only in media with thiamine 5mgl-1 and pH 5.4, regardless of the concentrations of auxins and cytokinins present in the media. Shoot multiplication in the three varieties was obtained in media containing equal concentrations of auxins and cytokinins; the TC variety had the highest number of shoots per explant (9, 18). The RITA temporary immersion system increased significantly the rate of shoot multiplication. Rooting of shoots was obtained in media free of growth substances and transfer to the ground was successful.

MICROPROPAGAO CLONAL DE TRS VARIEDADES DE ABACAXI NATIVAS DA REGIO AMAZNICA MEDIANTE CULTIVO DE GEMAS AXILARES E APICAIS Hctor A. Blanco F., Teresa E. Vargas e Eva de Garca RESUMO O presente estudo teve como objetivo estabelecer um sistema de propagao clonal eficiente de trs variedades de abacaxi (Ananas comosus L., Merr.) autctones do Amazonas venezuelano. Cultivaram-se in vitro gemas apicais e laterais das variedades ERUW CAN (EC), TAB CAN (TC) e GOVERNADORA (GOB). Na fase inicial, explantes (com gemas) foram descontaminados e inoculados em seis meios com diferentes concentraes de auxinas, citocininas e tiamina. Provaram-se dois valores de pH: 5,8 e 5,4. Aps quatro semanas houve brotao de uma gema axilar em TC (MI3), gema apical em EC (MI4) e gema axilar em GOB (MI6). Os meios MI1, MI4 e MI6 continham 5mgl-1 de tiamina, com pH 5,4. As concentraes endgenas de auxinas e citocininas diferem em cada uma das trs variedades e no se observou um padro comum em relao as propores de auxinas e citocininas requeridas para a induo de brotos. Somente se observou brotao em meios com tiamina 5mgl-1 e pH 5,4 independentemente da concentrao de auxinas e citocininas presente nos meios. A multiplicao dos brotos nas trs variedades sfoi obtida em meios com iguais concentraes de auxinas e citocininas. A variedade TC apresentou a maior quantidade de brotos por explante (9,18). O sistema de imerso temporal RITAs incrementou significativamente a taxa de multiplicao dos brotos. O enraizamento dos vstagos se obteve in vitro em meios sem substncias de crescimento e o translado a terra foi exitoso.

de la micropropagacin mente, los explantes se (Figura 1) estaba constisumergieron en desinfectuido por coronas e hitante-esterilizador GERjuelos basales de infruDEX si n d ilu i r por tescencias de tres varie20 m i n. El componente dades de pia amazniactivo de GERDEX es el cas conocidas localmente bromuro de lauril-dimec omo ERU W CA N til-bencil-amonio 10%. (EC), TAB CAN (TC) De seguidas se procedi y G OBER NA D OR A al aislamiento e inoculaGOBERNADORA (GOB) (GOB), provenientes de ERUW CAN (EC) TAB CAN (TC) cin de las yemas axilalos sembrados de pia Figura 1. Muestras de pia tradas del Amazonas. En EC y TC se observan las co- res y apicales en los mecultivados por los Piaroa ronas e hijuelos basales de la infrutescencia. En GOB se muestran varios hijos ba- dios de iniciacin, bajo en Betania del Topocho, sales pasados a tierra. un ambiente estril en la estado Amazonas, Venecmara de flujo laminar. z uela. El mater ial vegetal vegetal cin jabonosa por 20min., fue facilitado por la FundaCultivo in vitro de yemas transferidos a una solucin cin para el Desar rollo de A las coronas e hijuelos diluida al 20% (v/v) de cloro las Ciencias Fsicas, MateFase de iniciacin (supresin basales se les elimina totalcomercial por 10min., luego mticas y Naturales (FUDEde latencia e induccin de mente las hojas para exponer lavados tres veces en agua CI). crecimiento). Las yemas aislalas yemas. Los tallos desnudestilada estril en la cmadas fueron cultivadas en medos fueron lavados en solura de f lujo laminar. FinalDesinfeccin del material
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TABLA I Medios de cultivos utiliZados para la supresin de latencia e induccin del crecimiento en Yemas aisladas de las tres variedades de pias
Medios BAP (mgl-1) 0,5 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 2,0 ANA (mgl-1) 1,0 2,0 0,5 2,0 0,01 0,01 AIB (mgl-1) 1,0 2,0 0,5 2,0 0,0 0,0 Tiamina (mgl-1) 0,4 0,4 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 pH Estado fsico del medio slido slido lquido slido lquido slido lquido

MI 1* MI 2* MI 3=MM 1 MI 4** MI 5*** MI 6*** MM2****

5,8 5,8 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4

MS0 se evalu el nmero y longitud de las races formadas por cada una de las tres variedades de pia estudiadas. Se aplic la prueba t-Student para la comparacin por pares de medias (P0,05). Se aplic ANOVA de una va con Tukey. Resultados Fase de iniciacin

* Modificado por Casale y De Garca (1987), ** propuesto por Casale y De Garca (1987), *** propuesto por Mogolln et al. (2004), **** propuesto por Sripaoraya et al. (2003), MI 3= MM1: medio utilizado tanto para iniciacin como para multiplicacin de brotes.

En la etapa de iniciacin del cultivo se observ una alta contaminacin de los explantes por hongos y bacterias, en las muestras colectadas en el Amazonas. La var. EC Figura 2. Brotes obtenidos por la supresin de latencia en los explantes. a: brote de present el mayor TC en MI3, colocado sobre un puente de papel de filtro en contacto con medio lquido dentro de un tubo de ensayo, b: vstago con races de EC cultivado en medio porcentaje de contaminacin y el menor slido MI4, c: vstago de GOB en medio slido MI6. lo present la var. GOB. El empleo de dio con sales MS (Murashige periodo de 0,5h cada 12h. Las GERDEX en la ltima fase y Skoog, 1962) suplementado concentraciones de tiaminadel protocolo de desinfeccin con mioinositol 100mgl-1, saHCl y de los reguladores de result favorable por la dismicarosa 30gl-1, tiamina-HCl y crecimiento, as como las connucin de dicha contaminadiferentes concentraciones diciones fsicas y el pH de los Fase de multiplicacin cin. (Tabla I) de los reguladores medios se presentan en la TaA las cuatro semanas de culde crecimiento bencil-aminobla I. El brote adventicio de TC, tivo se observ brotacin de una purina (BAP), cido naftaleno Se evalu el nmero de obtenido en la fase de iniciayema axilar en la var. TC y de actico (ANA) y cido indolbrotes y la longitud de butrico (AIB). Los medios de vstagos for mados por TABLA II cultivo fueron esterilizados en cada una de las variedades Medios de cultivos utiliZados para una autoclave bajo condicioestudiadas, en los diferenel establecimiento de la multiplicacin nes estndar de presin y tes medios de crecimiento. in vitro de los brotes de pia obtenidos -2 temperatura (1,1kgcm y Se aplic la prueba t-Stuen la fase de iniciacin 121C) durante 20min. Desdent para la comparacin pus de inoculados en los meLonguitud por pares de medias (P Agitacin de Nmero de promedio dios, los explantes fueron in0,05). Se aplic ANOVA Medios Variedades medios brotes/explante de brotes cubados a 25C bajo luz blande una sola va con Tukey. (cm) ca continua a 56molm-2s-1. a Constante (15) ** 7,13 0,18 1,06 0,17 a Fase de enraizamiento . EC RITA --Fase de multiplicacin y alarLos vstagos adventicios gamiento de los brotes. Los de 2cm de longitud, rege0,71 0,09 a Constante (7) ** 9,18 1,26 b TC brotes obtenidos en la fase de RITA (10) *** 39,4 nerados en medios de *MM1 iniciacin fueron cuidadosamultiplicacin, fueron Constante (15) ** 6,83 1,48 a 0,84 0,09 a GOB mente separados y transferitransferidos a medio MS RITA --dos a medios de multiplislido sin reguladores de Constante (2) ** 0 0 cacin (MM1 y MM2) y bajo crecimiento (MS0), para la *MM2 EC RITA --dos condiciones fsicas: a) en induccin de formacin de constante agitacin a 137rpm, races. Todos los cultivos * MM: medios de multiplicacin, ** valores entre parntesis indican el nmero y b) en recipiente de inmerfueron incubados bajo luz inicial de brotes cultivados en MM1 distribuidos en 4 fiolas, *** valor entre pasin temporal automatizada blanca per manente a rntesis indica el nmero de brotes cultivados en MM1 en el sistema RITA. Valores con letras distintas dentro de una variable indican diferencias estadsticamente (RITA). Este equipo fue regu56molm-2s-1 a 25C. significativas. Se aplic la prueba t-Student para la comparacin por pares de Despus de las ocho se- medias (P0,05). Se aplic ANOVA de una va con Tukey. La doble raya (--) siglado para sumergir los brotes manas de crecimiento en nifica que no se utiliz la RITA. en el medio lquido por un

una yema apical en EC en los medios MI3 y MI4, respectivamente. Los brotes tenan una longitud de ~4mm, y despus de permanecer cuatro semanas adicionales en sus respectivos medios, hubo alargamiento de las hojas en TC y alargamiento del vstago (4cm) y formacin de races en EC (Figura 2). En los medios MI1 y MI2 no tuvo lugar la supresin de latencia (Tabla II). Debido a la baja produccin de brotes de las vars. EC y TC en la fase de iniciacin, se decidi trabajar con el protocolo propuesto por Mogolln et al. (2004) para la siembra del explante inicial de la variedad GOB. Se emplearon los medios siguientes: MI5 slido con 1mgl-1 de BAP, y MI6 lquido con la misma concentracin de sustancias de crecimiento, ambos con 4mgl-1 de tiamina y pH 5,4 (Tabla I). Se evidenci la emergencia de un brote adventicio en MI6 a las cuatro semanas, y despus de ocho semanas de crecimiento en el mismo medio, se observ el vstago de 5,3cm. (Figura 2). En el medio MI5 no ocurri supresin de la latencia (Tabla II).

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Figura 3. Vstagos de pia formados a partir de brotes cultivados en medios de multiplicacin durante ocho semanas. a: agitacin continua, b: inmersin temporal en recipiente de inmersin temporal automatizada (RITA).

TABLA III Datos de la multiplicacin clonal de los brotes

Variedad EC TC GOB Nmero de races promedio * 2,2 0,5 a 2,1 0,4 a 3,5 0,5 b Longitud de races promedio * (cm) 1,47 0,3 a 2,2 0,2 b 2,2 0,2 b

muchas especies de plantas de variedades de pia (Escalona et al., 1999; Gonzlez-Olmedo et al., 2005; De Garca et al., 2008). Se transfirieron 10 brotes adventicios de TC al sistema RITA con medio MM1. Despus de ocho semanas se obtuvieron 39,4 brotes/explante (Tabla II y Figura 3) que al compararlo con el nmero de brotes por explante obtenidos en fiolas con agitacin cons tante (9,18 1,26), se evidencia que RITA es un sistema eficaz para la multiplicacin de brotes. Fase de enraizamiento Vstagos adventicios de >2cm de largo, obtenidos por multiplicacin, fueron recultivados en medio MS slido sin reguladores de crecimiento (MS0). Entre las 8-10 semanas de crecimiento en MS0 las vitro-plantas adquieren ms vigor debido al desarrollo de races (Figura 4). GOB fue la variedad de mayor vigor, debido a que produjo mayor nmero de races promedio (3,5 0,5) de mayor longitud promedio (2,2cm 0,2cm; Tabla III). Las variedades EC y TC presentaron los menores valores en el nmero de races promedio (2,2 0,5 y 2,1 0,4 respectivamente) y no mostraron diferencias estadsticamente significativas entre ellas, pero sus valores fueron significativamente diferentes a los obser vados en la var. GOB (Figura 5c). EC alcanz la menor longitud de races promedio por vstago (1,47 0,3cm), significativamente menor a la de TC y GOB (Tabla III y Figura 5d). En general, las tres variedades de pias amaznicas produjeron races adventicias en medio MS0, y las plantas se adaptaron fcilmente al ser transferidas a tierra. Discusin En las tres variedades de pia estudiadas, la supresin de la latencia de los explantes ocurri a las cuatro semanas de cultivo, nicamente en los medios de induccin que con-

Valores con distinta letra dentro de una variable indican diferencias estadsticamente significativas. Se aplic la prueba t-Student para la comparacin por pares de medias (P 0,05). Se aplic ANOVA de una va con Tukey. * n= 10.

cin, fue transferido al medio MM1. El mismo form ocho brotes despus de ocho semanas en agitacin continua (Figura 3). . El brote adventicio de EC, obtenido en la fase de iniciacin, fue transferido al medio MM2 y despus de ocho semanas y con agitacin constante no hubo multiplicacin sino elongacin del vstago de EC. Este vstago alargado se dividi longitudinalmente en dos y se coloc en MM1 y MM2. A las ocho semanas hubo multiplicacin de EC (cuatro brotes) en el medio MM1 (Figura 3). Estas experiencias demostraron que el medio MM1 induce la multiplicacin clonal de las dos variedades y el MM2, que carece de auxina, no funciona como inductor de la multiplicacin. Es necesaria la presencia de citocininas y auxinas en los medios de multiplicacin para la proliferacin de brotes de las pias amaznicas. El brote adventicio de GOB, obtenido en la fase de iniciacin, fue dividido longitudinalmente en dos y luego, ambas mitades transferidas nicamente a MM1, con base en los resultados obtenidos en la multiplicacin de las variedades TC y EC. En ocho semanas de cultivo se obtuvie-

ron en total 17 brotes para las dos secciones del brote inicial (Figura 3). Los primeros dos repiques para las tres variedades de pia en MM1 sirvieron para aumentar el nmero de brotes adventicios y en el tercer repique en dicho medio, se tomaron muestras (cuatro fiolas) de cada variedad para la estimacin de nmero de brotes por explante y longitud de brotes. La variedad TC mostr un nmero significativamente mayor de brotes por explante (9,18 1,26) en medio MM1 con agitacin constante, en comparacin con las otras dos variedades de pias amaznicas, cuyas diferencias en el nmero de brotes por explante no fueron estadsticamente significativas (Tabla II y Figura 5a). Las tres variedades de pias no mostraron diferencias significativas en la longitud promedio de los brotes en medio MM1 con agitacin constante (Tabla II y Figura 5b). Adicionalmente se evalu, solamente en la variedad TC, la eficiencia de la multiplicacin de brotes mediante inmersin temporal y utilizando el sistema RITA, el cual ha sido reportado como muy eficiente en la multiplicacin de

tenan 5mgl -1 tiamina-HCl, auxina y citocinina a diferentes concentraciones y con pH ajustado a 5,4. Estos resultados coinciden con los de Casale y De Garca (1987) trabajando con las variedades Espaola Roja, Nacional y Brecheche, los de Garita y Gmez (2000) con la var. Champaka F-153, y los de De Garca et al. (2008) en Espaola Roja, quienes obtuvieron induccin de brotes a partir de yemas trabajando con esas mismas condiciones. La gran diferencia estuvo en los cortos tiempos de respuesta de los respectivos explantes. Los explantes de las variedades amazonenses cultivados en medios de induccin con 0,4mgl-1 de tiamina y pH 5,8 (MI1 y MI2) no respondieron a la induccin, independientemente de la concentracin de auxina y citocinina utilizada. La cantidad de auxina y citocinina que requieren los explantes de las variedades en estudio para alcanzar la ruptura de la latencia de las yemas es variable. Los brotes obtenidos a partir de yema axilar de TC, yema apical de EC y yema axilar de GOB se formaron en MI3, MI4 y MI6, respectivamente. El medio MI3 (lquido) contiene una proporcin 1:1 citocinina:auxina y el medio MI4 (slido) contiene una proporcin 1:4 de citocinina:auxina, y el medio MI6 (slido) contiene un a proporcin 100:1 citocinina:auxina. Esto indica que adems de la presencia de 5mgl-1 de tiamina y pH 5,4 es necesaria la presencia de auxina y citocinina en el medio de cultivo, en concentraciones dependientes de la concentracin endgena de dichas sustancias en el explante. Estos resultados concuerdan con los reportados por Casale y De Garca (1987), Garita y Gmez (2000), De Garca et al. (2008), Saucedo et al. (2008) y Seplveda et al. (2008), quienes tambin lograron la supresin de latencia de yemas axilares de plantas adultas de distintas variedades de pia cultivadas in vitro, utilizando principalmente BAP y

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Figura 5. Evaluacin de crecimiento. a: nmero de brotes por explantes en cada una de las variedades estudiadas, b: longitud de los brotes formados en cada una de las variedades durante la etapa de multiplicacin, c: nmero de races totales formadas por cada variedad a las 10 semanas de cultivo, d: longitud de las races formadas por cada variedad a las 10 semanas de cultivo. Valores marcados con diferente letras son significativamente diferentes (p<0,05; test de Student).

ANA como reguladores de crecimiento. En el caso del medio slido MI6 que contena una proporcin 100:1 de citocinina:auxina, ste fue utilizado por Mogolln et al. (2004) para la micropropagacin de A. comosus Queen Australia, logrando tanto el establecimiento de pices caulinares extrados de hijos basales como la multiplicacin clonal de vstagos in Vitro; en el presente caso solo se us la fase en la fase de iniciacin de la var. GOB, y los resultados obtenidos fueron similares a los obtenidos para las vars. TC y EC cultivadas en medios con menores concentraciones de BAP, una sustancia que en altas concentraciones puede

terson, (2003) reportaron altas en la multiplicacin de las vaoriginar variaciones somaclotasas de multiplicacin de riedades de pia Champaka y nales. vstagos de A. comosus var. Hawaiana, manteniendo consEn relacin a la fase de Cayena Lisa en medios MS tante la dosis de cido indolmultiplicacin, el medio MM1, lquidos con una combinacin actico (AIA) en 2,0mgl-1 y con proporcin 1:1 citocinireportaron esa concentracin de de 1,5mgl-1 BAP y 0,5mgl-1 na:auxina, indujo la proliferaANA; Mogolln et al. (2004) AIA y 3,5mgl-1 BAP como la cin de vstagos adventicios combinacin ms adecuada lograron una alta tasa de mulen las tres variedades de pias para la proliferacin de brotes. tiplicacin clonal de vstagos amaznicas. Los brotes obteniTambin se ha utilizado otras de A. comosus Queen Ausdos en la fase de iniciacin citocininas en lugar de BAP tralia utilizando 1,0mgl -1 fueron multiplicados en dos BAP y 0,01mgl-1 ANA; Khan para la multiplicacin de los repiques sucesivos en MMI et al., (2004) reportaron mulbrotes. Akbar et al., 2003 usacon la finalidad de lograr un tiplicacin in vitro eficiente de ron 1,5mgl-1 cinetina (K) en nmero significativo de brotes combinacin con ANA vstagos adventicios de pia, que permitieran tener un n0,5mgl1, en medios MS slidos en medio MS con 0,5mgl -1 mero de replicas suficientes BAP, y ANA 0,001mgl -1; y obtuvieron la formacin de para la estimacin de la tasa Amin et al. (2005) tambin novo de vstagos adventicios de de multiplicacin de brotes y establecieron un protocolo de A. comosus, cv Madhupur, va la longitud de vstagos advenregeneracin rpida de vstaorganognesis indirecta. ticios. En el medio de multipligos de pia, cultivar Giant Tambin se ha logrado la cacin MM2, sin auxina, no Kew, reportando la combinamultiplicacin de la pia utilise observ proliferacin de cin BAP 1,0mgl -1 y ANA zando solamente BAP como vstagos, solo crecimiento de 0,1mgl-1 como el tratamiento regulador de crecimiento. Srilos existentes. Estos resultados ptimo para la multiplicacin paoraya et al., (2003) lograron indican que tambin en la fase de los vstagos; y, finalmente, la multiplicacin de A. comode multiplicacin de estas vaDanso et al. (2008) ensayaron sus cv. Phuket, utilizando soriedades se requiere tanto de distintas combinaciones de lamente 2,0mgl-1 de BAP en citocininas como de auxinas; el medio. Estos resultados diBAP y ANA en medios tanto por otra parte, los mismos fieren de lo observado en el slidos como lquidos para la coinciden con los obtenidos presente trabajo, en el cual no multiplicacin de A. comosus por De Wald et al. (1988), se obtuvo multiplicacin de var. MD2 y reportaron que la quienes obtuvieron altas tasas brotes de la variedad ERUW combinacin 5,0mgl-1 BAP y de proliferacin de vstagos 2,0mgl-1 ANA, en medio lCAN en medio MS lquido adventicios de Cayena lisa y quido increment significaticon 2,0mgl-1 BAP y sin auxilos cultivares Perolera y PR-Inas (MM2). vamente la tasa de multiplica67, en medios con 8 Cabe tambin resaltar el cin de brotes. (2mgl 1) BAP y 10,8 (2mgl-1) ANA (proporciones not able i nc r e me nt o e n la Varios autores han usado iguales de BAP y ANA). tasa de multiplicacin de la auxinas diferentes al ANA para Algunos reportes sobre las va r ie d a d TC obt e n ido a l la multiplicacin de brotes, condiciones ptimas para la utilizar los equipos de incomo Saucedo et al. (2008), multiplicacin de pias in vime r sin t e mp or a l, e n los quien evalu el efecto de distro coinciden con los resultaque la produccin incrementintas concentraciones de BAP dos del presente trabajo, pero difieren en la proporcin de BAP y ANA utilizadas, en algunos casos por un amplio margen, como son los casos de Garita y Gmez (2000) quienes reportaron el uso de 0,2mgl -1 BAP y 0,8mgl -1 ANA para Champaka F-53; de Rahman et al. (2001) quienes reencontraron mxima proliferacin de brotes a partir de yemas axilares de pia utilizando 1,0mgl-1 BAP TAB CAN (TC) GOBERNADORA (GOB) y 0,1mgl -1 ANA; ERUW CAN (EC) Firoozabady y Gut- Figura 4. Vitro-plantas de pias amazonenses en fase de enraizamiento.

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ta de 9,18 a 39,4 brotes por explante (Tabla II). Estos coinciden con los resultados obtenidos por otros investigadores, como Escalona et al. (1999), quien trabaj con A. comosus L. Merr) y observ que la inmersin temporal incrementa la multiplicacin y el peso fresco y se c o de los brot e s e n 42 das de cultivo; De Garca et al. (2008), quienes obtuvieron altas tasas de multiplicacin de brotes de Espaola Roja ut i l i z a ndo 2,0 mgl -1 BA P y 2,0 mgl -1 ANA en un sistema de inmersin temporal. Los vstagos de las tres variedades amaznicas obtenidos en la fase de multiplicacin, con una longitud mnima de 2cm de longit ud, fueron enraizados en medios MS sin hor monas (MS0). Otros trabajos publicados sobre enraizamiento de pia coinciden con los resultados del presente trabajo al obtener enraizamiento efectivo de vstagos en ausencia de reguladores de crecimiento. De Garca et al. (2008) obtuvieron buenos resultados de enraizamiento de las vitroplantas pertenecientes a la variedad Espaola Roja en MS0. Igualmente, los vstagos de A. comosus cv. Phuket, regenerados tanto por embriognesis somtica como por organognesis, enraizaron sin problemas en MS0 (Sripaoraya et al ., 2003). Wakasa et al . (1978) trabajando en el cultivo in vitro de A. comosus cv. Cayena Lisa cepa Mitsubishi, lograron el enraizamiento de todas las vitroplantas regeneradas de distintos tipos de explantes. Mogolln et al. (2004) ensayando con distintas concentraciones de ANA en medios MS consideraron que la adicin de esta hormona no es necesaria para la induccin rizognica de A. comosus cv. Queen Australia, y por otra parte, Casale y De Garca, (1987) obtuvieron formacin de races en vitroplantas de pia pertenecientes a las variedades Espaola Roja, Brecheche y Nacional en apenas t res

das sembradas en tierra. Sin embargo, otros trabajos hacen referencia al mejoramiento del enraizamiento de vitroplantas de pia utilizando auxinas. Saucedo et al. (2008) obtuvieron porcentajes de enraizamiento significativamente altos de vitroplantas de A. comosus variedad Hawaiana suplementando el medio MS con ANA 50mgl-1. Mogolln et al. (2004) observaron que ANA suplementado al medio MS incrementa el enraizamiento de vit roplant as de pia del cultivar Queen Australia, obteniendo mayor nmero de races promedio a una concentracin de 2mgl-1 de la hormona. Khan et al. (2004) ensayaron distintas concentraciones de ANA y AIB en medios basales de Murashige y Skoog (1962) con la mit ad de la f uerza inica (MS) y observaron que 1,0mgl-1 AIB fue el mejor tratamiento para la induccin rizognica. Akbar et al. (2003) trabajando con A. comosus cv Madhupur encontraron que 2,0mgl-1 AIB suplementado al medio MS fue la condicin ms favorable para la formacin de races adventicias, sin observar su formacin en medios sin auxina. En otros casos se ha reportado el uso de combinaciones de au xi nas para el enraizamiento de vitroplantas de pia Cayena Lisa regeneradas tanto por embriognesis somtica como por orga nognesis, ut ili za ndo medios MS suplementados con 3M (0,56mgl-1) ANA y 2,5M (0,51mgl -1) AIB (Firoozabady y Moy, 20 04). Similarmente, en los vstagos regenerados de A. comosus va r. Giant Kew, hubo mejoramiento del enraizamiento utilizando la combinacin ANA-AIB, ambas a 0,2mgl -1, en medios MS (Amin et al., 2005). Rahman et al. (2001) igualmente utilizaron la combinacin ANA 0,2mgl -1 y A I B 0,2mgl -1 pero en med io basal MS para enraizamiento in vitro de plantas de pias. Tam-

bin, vstagos regenerados de A. comosu s va r ied ad MD2, fueron enraizadas exitosa mente en med ios MS suplementados con la combinacin de ANA-AIB (ambas a 1mgl -1 ; Da nso et al., 2008). Cabe destacar la autonoma, en relacin a los requerimientos de auxina, que presentan los vstagos de las tres variedades en estudio a los fines de su enraizamiento in vitro, lo cual representa una ventaja econmica para el sistema de propagacin aqu presentado. Conclusiones La ruptura de la latencia en las yemas presentes en los explantes de las variedades de pias estudiadas constituy un obstculo para el establecimiento del cultivo; las variedades estudiadas fueron recalcitrantes a los medios probados en la etapa inicial. La supresin de la latencia se obtuvo a las cuatro semanas de cultivo en explantes de las tres variedades creciendo en medios de induccin que contenan 5mgl-1 tiamina-HCl y con pH ajustado a 5,4, independientemente del balance hormonal y estado fsico del medio de cultivo. Los resultados sugieren que las concentraciones endgenas de auxinas y citocininas son diferentes en cada una de las tres variedades, y en consecuencia no se observa un patrn comn en relacin a las proporciones de auxinas y citocininas requeridas para la induccin de formacin de brotes en los explantes de las variedades de pia analizadas. Se estableci que para la multiplicacin de los brotes se requiere la presencia de au x i n a s y cit o ci n i n a s e n proporciones equivalentes. El sist e m a de i n me r sin temporal es altamente recomendable para incrementar la tasa de multiplicacin de los brotes. Los vstagos resultantes del proceso de multiplicacin son i ndepend ientes de la

presencia de au xina en el medio para la formacin de races in vitro, en contraste con los repor tes de ot ros autores para diversas variedades de pia.
AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Carmen Garca por su colaboracin en la elaboracin de este documento, y a la Fundacin para el Desarrollo de las Ciencias Fsicas, Matemticas y Naturales (FUDECI) y al Consejo de Desarrollo Cientfico y Humanstico de la Universidad Cent ral de Venezuela la colaboracin institucional y financiamiento de la investigacin.
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