Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiologa 2009; 29:91-97

Artculo original Clasificacin e identificacin de especies de actinomicetos: un estudio fenotpico comparativo

Mayela Uzctegui-Negrna,*, Jos Antonio Serranoa, Patrick Boironb, Vernica Rodrguez-Navab, Andre Coubleb, Delphine Monieb, Karina Snchez Herrerac, Horacio Sandovalc, Vera Reviakinad, Mara Mercedes Panizod, Mireya Mendozae
c a Universidad de los Andes, Venezuela. bUniversidad Claude Bernard Lyon 1, Francia. Universidad Autnoma Metropolitana-Xochimilco, Mxico. dInstituto Nacional de Higiene Rafael Rangel, Venezuela. e Instituto de Biomedicina, Venezuela.

Recibido 12 de junio de 2009; aceptado 3 de septiembre de 2009

______________________________________________________________________________________________________________ Resumen: Las pruebas fisiolgicas y bioqumicas constituyen dos de las principales metodologas utilizadas, principalmente en los laboratorios de microbiologa, para la identificacin y diferenciacin de los actinomicetos. La finalidad de este trabajo fue comparar y evaluar los mtodos fenotpicos que son utilizados de manera rutinaria en la identificacin de estos microorganismos. Se estudiaron setenta y tres cepas de actinomicetos provenientes de tres laboratorios de microbiologa de Venezuela. El comportamiento fisiolgico y bioqumico de las cepas en estudio fue evaluado mediante pruebas de descomposicin de diferentes sustratos. Los resultados obtenidos permitieron observar diferencias en la identificacin preliminar de las cepas realizada por estos laboratorios, conduciendo algunas veces a una nueva identificacin de las mismas, gracias a la utilizacin de estos sustratos. Se pudo observar que la metodologa empleada permiti la reclasificacin taxonmica de casi todas las cepas estudiadas, lo que sugiere que es necesario estandarizar la metodologa de identificacin para los actinomicetos. Palabras clave: pruebas fenotpicas, actinomicetos, Nocardia, identificacin

Classification and identification of Actinomyces species: a comparative phenotype study

Abstract: Physiologic and biochemical tests constitute two of the main methodologies, mainly used in microbiology laboratories, for the identification and differentiation of actinomyces. The purpose of this work was to compare and evaluate the phenotypic methods used routinely for the identification of these microorganisms. The study included seventy three actinomyces strains from three microbiology laboratories in Venezuela. The physiologic and biochemical behavior of the strains was evaluated through decomposition tests using different substrates. The results obtained showed differences in the preliminary identification of the strains done in the various laboratories, leading occasionally to a new identification arisen from the use of these substrates. It was seen that with the methods used it was possible to taxonomically reclassify almost all the strains studied, suggesting that it is necessary to standardize the methods for the identification of actinomyces. Keywords: phenotype tests, actinomyces, Nocardia, identification
____________________________________________________________________________________________________________________________ * Correspondencia: E-mail: mayela_uzcategui@yahoo.es

Introduccin Los actinomicetos son bacterias aerbicas, grampositivas, filamentosas y parcialmente cido resistentes, ampliamente distribuidas en el suelo, as como tambin en otros ambientes naturales del mundo. Inicialmente fueron clasificadas como hongos pero, debido a los estudios de los componentes de su pared celular, se reclasificaron

dentro del orden de los Actinomycetales. En este orden se encuentran agrupadas las especies del gnero Nocardia, quienes se caracterizan por presentar clulas cocobacilares a partir de las cuales se desarrollan las formas filamentosas. [1]. Las nocardias son bacterias endmicas en algunos nichos ecolgicos que se encuentran en zonas tropicales y subtropicales, mientras que son poco frecuentes en las zonas

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templadas o fras [2]. Ciertas especies de nocardias tienen gran importancia clnica como agentes patgenos para el hombre y los animales. Las infecciones causadas por estos microorganismos se pueden producir por la inhalacin de estas bacterias y/o por inoculacin, debida a traumatismos con espinas de plantas (principalmente cactceas) o astillas de madera contaminadas presentes en el suelo [3]. Cuando se establece la infeccin por estos microorganismos, la misma puede ser de tipo cutneo o subcutneo (actinomicetoma), o de tipo diseminado (nocardiosis). Estas infecciones por lo general afectan a personas inmunodeprimidas, aunque no se descartan otros factores de riesgo adicionales como son la exposicin frecuente al contacto con el suelo, principalmente durante la realizacin de actividades agrcolas sin la adecuada proteccin de la piel [2,4,5]. En Venezuela se ha observado una frecuencia relativamente elevada de infecciones causadas por nocardias, principalmente actinomicetomas [5]. Estos casos se han reportado sobre todo en las regiones centro-occidental, central y zuliana (97,1 %) y en la regin de los Andes (2,9 %) [5]. En la mayora de los laboratorios de microbiologa no especializados, la identificacin a nivel de gnero es posible utilizando las pruebas convencionales de identificacin ya establecidas por diferentes autores, basadas en los estudios de morfologa y pruebas fisiolgicas y bioqumicas [6]. Tambin han sido utilizados los perfiles de sensibilidad a antibiticos (tipos I, II, III, IV, V y VI) para la diferenciacin de estas especies [7]. Este gnero ha sufrido importantes cambios taxonmicos, debido a la realizacin de estudios moleculares que han demostrado una gran heterogeneidad entre sus especies [8]. La identificacin a travs de mtodos convencionales se dificulta a la hora de separar ciertas especies como Nocardia nova, N. farcinica, N. abscessus (anteriormente llamada N. asteroides tipo I) y N. cyriacigeorgica (anteriormente llamada N. asteroides tipo IV) debido a la similitud que existe entre ellas, por lo que se deben establecer otros criterios adicionales que contribuyan a su separacin. Otros parmetros han sido propuestos para la identificacin de estas especies, como el crecimiento a 45C, la actividad de arilsulfatasa y la opacidad de medios, entre otras [7]. El estudio de las caractersticas enzimticas, ofrece una herramienta til para la identificacin, pero estas pruebas a menudo no se encuentran disponibles de manera rutinaria en los laboratorios de microbiologa [9]. Tambin se han empleado sistemas comerciales para la identificacin de especies de actinomicetos, que se basan en pruebas de asimilacin de substratos, pruebas enzimticas y susceptibilidad a antibiticos, no obstante, estos sistemas no se utilizan como metodologa tradicional y su incorporacin en los laboratorios para el diagnstico de estos microorganismos suele ser costosa [10-12]. Las pruebas fenotpicas convencionales que pueden ser utilizadas rutinariamente para identificar las principales especies de microorganismos responsables de la nocardiosis y del actinomicetoma (N. asteroides, N. brasiliensis y N. otitidiscaviarum) se basan en la observacin de las caractersticas morfolgicas macroscpicas de las colonias en los diferentes medios de cultivo, observacin de morfo-

loga microscpica con las tinciones de Gram y Kinyoun y la descomposicin de algunos sustratos especficos, tales como adenina, xantina, casena, hipoxantina, testosterona, tirosina y urea [13]. Es importante mencionar que el cultivo, y la utilizacin de las pruebas anteriormente nombradas aun constituyen parmetros tiles y primordiales a nivel bacteriolgico para la identificacin de las nocardias. Sin embargo, la correcta identificacin de estos microorganismos va a depender del establecimiento de una metodologa adecuada de diagnstico, basada en la preparacin y utilizacin de mltiples pruebas de identificacin que no se encuentran disponibles a nivel comercial y que generalmente son de difcil interpretacin si el personal no est familiarizado y entrenado para esta tarea. Por otra parte, su crecimiento relativamente lento y la gran similitud morfolgica y fisiolgica que pueden presentar algunas de las especies de este gnero dificultan an ms la identificacin [14,15]. Debido a lo anteriormente expuesto, el objetivo de este estudio fue comparar y evaluar los mtodos fenotpicos clsicos utilizados de manera rutinaria en el laboratorio para la identificacin de los actinomicetos, particularmente los del gnero Nocardia. Materiales y mtodos El presente trabajo se bas en el estudio de 73 cepas de actinomicetos provenientes de las colecciones de cultivos de tres laboratorios de Venezuela: Laboratorio de Ultraestructura de Actinomicetos Patgenos y del Suelo de la Universidad de los Andes (Laboratorio 1), Micoteca del Departamento de Micologa del Instituto Nacional de Higiene Rafael Rangel (Laboratorio 2) y Laboratorio de Micologa del Instituto de Biomedicina (Laboratorio 3). Se estudiaron 35 cepas procedentes del laboratorio 1; los criterios fisiolgicos utilizados por este laboratorio para la identificacin preliminar de las cepas fueron la degradacin de casena, hipoxantina, tirosina y xantina. Del laboratorio 2 se tomaron para este estudio 34 cepas y las pruebas fisiolgicas que fueron utilizados para caracterizar estas especies fueron: urea, casena, tirosina y xantina. Del laboratorio 3 se recibieron para este estudio 4 cepas y no se obtuvo informacin sobre la metodologa de identificacin utilizada. Para realizar la comparacin entre las pruebas usadas para la identificacin de los actinomicetos, en este trabajo se utiliz el procedimiento elaborado por el laboratorio del Observatorio Francs de Nocardiosis (OFN), ubicado en la Facultad de Farmacia de la Universidad Claude Bernard de Lyon, Francia, utilizando el esquema de identificacin descrito en el Manual de Mtodos de Laboratorio para el Diagnstico de la Nocardiosis, el cual emplea criterios fenotpicos y fisiolgicos similares a los utilizados en los laboratorios 1 y 2 con algunas modificaciones [15]. Se utilizaron tanto substratos convencionales como especiales, por medio de los cuales se verific la identificacin y/o se realiz la reclasificacin de las cepas pertenecientes al gnero Nocardia.

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Todas las cepas fueron subcultivadas en agar Bennett (cido casamino 2 g/L, extracto de levadura 1 g/L, extracto de carne 1 g/L, glucosa 10 g/L y agar 15 g/L) [14]. El medio de cultivo se incub hasta lograr abundante crecimiento de los microorganismos. Cada uno de los substratos que se utilizaron fueron elaborados de forma artesanal, empleando como medio de cultivo base el agar Glucose Yeast-Extract (GYEA). Todos fueron esterilizados por el mtodo de tindalizacin, procedimiento que consisti en tres tratamientos a temperatura de 100 C por 30 minutos intercalados con intervalos de tiempo a temperatura ambiente. El comportamiento bioqumico de cada una de las cepas fue estudiado segn sus propiedades de descomposicin de los siguientes sustratos: casena al 11%, adenina, cido rico y tirosina al 5%, hipoxantina y xantina al 4%, y tes-

tosterona al 1%; todos los substratos fueron preparados en concentraciones peso/volumen [15]. Las cepas fueron sembradas en cada substrato y luego se incubaron por dos semanas a 37 C. Para la lectura e interpretacin de los resultados se realizaron observaciones despus de 48 horas de incubacin, donde la descomposicin de cada substrato en particular se observ mediante el aclaramiento del medio alrededor de la colonia, considerndose as la prueba positiva. Los patrones de descomposicin para cada uno de los substratos utilizados por las principales especies de Nocardia se presentan en la tabla 1, la cual fue utilizada como referencia para realizar este estudio de identificacin, siguiendo el protocolo propuesto por Boiron et al [14].

Tabla 1. Identificacin de las principales especies patgenas de Nocardia segn sus propiedades de descomposicin de substratos particulares (Boiron et al., 1993).

Caractersticas Descomposicin: Tirosina Xantina Acido rico Adenina Hipoxantina Casena Urea Testosterona

N. N. asteroides farcinica nuevo sentido + + + +

N. nova

N. N. N. brasiliensis otitidiscaviarum brevicatena

N. carnea

N. transvaliensis

+ +

+ + + + +

v + + + + -

v v + + -

+ = 90 % de cepas positivas; - = 90 % de cepas negativas; V = variables segn las cepas.

Resultados La distribucin general de las cepas utilizadas en este estudio, identificadas por medio de las pruebas de descomposicin de substratos particulares, fue la siguiente: complejo N. asteroides: 39 (53,4%); N. brasiliensis: 12 (16,4%); N. otitidiscaviarum: 14 (19,2%) y cepas no identificadas: 8 (11%), para un total de 73 cepas. El estudio morfolgico macroscpico de las colonias en agar Bennett permiti observar las siguientes caractersticas relacionadas con el color: predominio de colonias de color beige 12 de 73 (16,4%); colonias color salmn: 14 de 73 (19,2 %) y colonias de color blanco: 39 de 73 (53,4 %). En relacin a su aspecto macroscpico se obtuvieron los siguientes resultados: colonias de aspecto creo y secas: 23 de 73 (31,5%) y de consistencia cartilaginosa, recubierta de hifas areas y con aspecto pulverulento tipo tiza: 50 de 73 (68,5%). El crecimiento de la mayora de las colonias se present en la superficie del agar. Todas las cepas fueron grampositivas, observndose formas de cocos y/o bacilos, as como filamentos. Los patrones fisiolgicos particulares de las 73 cepas estudiadas se presentan en la tabla 2. Algunas de las cepas enviadas por los laboratorios pertenecan a los gneros Rhodococcus y Actinomadura,

sin embargo para este estudio finalmente slo se consideraron las del gnero Nocardia. En las tablas 3, 4 y 5 se presentan, de manera individual por cada laboratorio, el grado de concordancia que existi entre la identificacin preliminar de las cepas y la identificacin posterior realizada en este estudio. En el caso del laboratorio 1 (35 cepas), slo 9 de las cepas (26,7%) coincidieron con la identificacin, 13 cepas (38,2%) no coincidieron y 8 cepas (23,5%) no pudieron ser identificadas, mientras que 4 cepas (11,8%) que no posean identificacin inicial pudieron ser clasificadas por gnero y especie (Tabla 3). En el caso de las cepas provenientes del laboratorio 2 (34 cepas), al ser nuevamente identificadas aplicando la metodologa planteada en este estudio, se observ coincidencia en la mayora de las identificaciones proporcionadas previamente: 30 cepas (88,2 %) presentaron el mismo patrn de descomposicin para los sustratos xantina, casena y tirosina, 4 cepas (11,8 %) no correspondieron con la identificacin original y no se enviaron cepas sin identificacin previa (Tabla 4). Todos las cepas que provenan del laboratorio 3 (4 cepas) fueron identificadas como especies distintas, no coincidiendo ninguna con la identificacin inicial (Tabla 5), presentando patrones de degradacin de sustratos muy diferente al esquema de

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identificacin original. El porcentaje ms alto de concordancia lo obtuvo el laboratorio 2 (88,2 %), seguido del laboratorio 1, mientras que el laboratorio 3 no present

ninguna concordancia. La metodologa empleada en este estudio permiti la reclasificacin taxonmica de casi todas las cepas estudiadas.

Tabla 2. Identificacin fisiolgica de cepas de Nocardia segn sus propiedades de descomposicin de diferentes substratos.
Codigo de cepa PN15 PN30 PN16 PN17 PN14 PN22 PN 21 PN19 PN25 PN20 PN10 PN18 PN75 PN24 PN13 PN79 PN23 PN27 PN26 PN29 PN39 PN43 PN 47 PN56 PN57 PN58 PN80 PC97 RC1 PC3 PC4 PC7 PN44 PC83 PC85 PC88 PC91 PC93 PC98 PN8 PC99 PC100 PC104 PC105 PC106 PC107 PC96 28CZ/SA PC84 PC113 PC116 PC94 PC117 PC109 PC114 PC118 PC95 PC120 PC115 PN31 PC97 PC94 PC121 PC112 PC110 PC90 PC89 PC92 PC103 H1 17 CFB/SA 7CZ/SA 6CZ/SA Adenina Caseina + + + + + + + + + + + + Hipoxantina + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Xantina + + + + + + + + + + + + + c. rico + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Testosterona + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Tirosina + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Especie N. otitidiscaviarum N. otitidiscaviarum N. otitidiscaviarum Complejo N. asteroides N/I N. otitidiscaviarum Complejo N. asteroides N/I Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides N. otitidiscaviarum Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides N/I N/I Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides N/I N/I N/I N/I N. otitidiscaviarum Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides N. otitidiscaviarum Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides N. otitidiscaviarum N. brasiliensis Complejo N. asteroides N. otitidiscaviarum N. otitidiscaviarum N. brasiliensis N. otitidiscaviarum N. brasiliensis N. brasiliensis N. brasiliensis Complejo N. asteroides N. otitidiscaviarum Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides N. otitidiscaviarum Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides N. brasiliensis N. brasiliensis Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides N. brasiliensis N. otitidiscaviarum N. brasiliensis N. brasiliensis N. brasiliensis Complejo N. asteroides N. brasiliensis Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides

+ = cepas positivas; - = cepas negativas; N/I = cepa no identificada por estos substratos

Uzctegui y col. / Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiologa 2009; 29:91-97 Tabla 3. Comparacin entre los resultados originales obtenidos por el laboratorio 1 y los del presente estudio.

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Cdigo de Cepa PN15 PN30 PN16 PN17 PN14 PN22 PN 21 PN19 PN25 PN20 PN10 PN18 PN75 PN24 PN13 PN79 PN23 PN27 PN26 PN29 PN39 PN43 PN 47 PN56 PN57 PN58 PN80 PN44 PN8 PN31 H1 17 CFB/SA 7CZ/SA 6CZ/SA N de cepas Frecuencia (%)

Identificacin Fenotpica preliminar N. brasiliensis N. rubra N. brasiliensis N. otitidiscaviarum Rhodococcus sp Nocardia sp Nocardia sp N/I Nocardia asteroides Nocardia sp N. rubra N. brasiliensis Nocardia asteroides N. brasiliensis N. otitidiscaviarum N. brasiliensis N. brasiliensis N/I N/I S. albus N. asteroides N. brasiliensis N/I N/I N. brasiliensis N. brasiliensis N. otitidiscaviarum N. otitidiscaviarum N. brasiliensis N. asteroides N. asteroides N. asteroides N. asteroides N. asteroides

Identificacin Fenotpica definitiva N. otitidiscaviarum N. otitidiscaviarum N. otitidiscaviarum Complejo N. asteroides N/I N. otitidiscaviarum Complejo N. asteroides N/I Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides N. otitidiscaviarum Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides N/I N/I Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides N/I N/I N/I N/I N. otitidiscaviarum Complejo N. asteroides N. otitidiscaviarum Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides

Coincidencia SI NO x x x x

Cepas NI

Cepas I

x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 9 26,47

13 38,24

8 23,53

4 11,8

Cepa NI = cepa no identificada por los substratos utilizados Cepa I = cepa identificada N/I: cepa no identificada previamente

Discusin Los resultados de este estudio son comparables a los descritos por otros autores, quienes en la evaluacin de un gran nmero de aislados pertenecientes al gnero Nocardia han subrayado la dificultad que se presenta al momento de identificar las principales especies de este gnero. En la metodologa utilizada para realizar la identificacin de estos microorganismos se incluyen la observacin macroscpica y microscpica de las colonias, as como la combinacin de mltiples pruebas fisiolgicas, que pueden ser tiles para la discriminacin a nivel de especie. Todas las cepas valoradas en este estudio presentaron caractersticas sugestivas del gnero Nocardia y las diferentes especies obtenidas presentaron un comportamiento fisiolgico consistente a lo reportado en otros estudios [11,13,14]. En general, en las cepas enviadas por los tres laboratorios, identificadas posteriormente con la utilizacin de los sustratos particulares planteados en este estudio, predominaron las especies pertenecientes al complejo N. asteroides

(55,8 %). Las pruebas fenotpicas clsicas no permiten diferenciar la mayora de estas especies de Nocardia, (N. asteroides, N. farcinica y N. nova), sin embargo siguen siendo tiles para establecer una aproximacin taxonmica y lograr un diagnstico presuntivo de las especies de este gnero [13-15]. Otra especie que se identific con una frecuencia importante fue N. otitidiscaviarum (20,6 %), mientras que N. brasiliensis no fue identificada en este grupo de cepas; esto llama poderosamente la atencin, ya que en Venezuela el actinomicetoma es principalmente causado por N. brasiliensis y menos frecuentemente por N. otitidiscaviarum [2,4,5]. Durante la realizacin de este trabajo, algunas de las especies que venan clasificadas previamente como N. brasiliensis no correspondieron a esta clasificacin, ya que presentaron un patrn de asimilacin de substratos especfico para N. otitidiscaviarum (casena negativa y todos los dems substratos probados positivos) al ser identificadas nuevamente mediante las pruebas utilizadas en este estudio. Otra cepa identificada como Actinomadura pelletieri present un patrn de des-

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Uzctegui y col. / Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiologa 2009; 29:91-97 Tabla 4. Comparacin entre los resultados originales obtenidos por el laboratorio 2 y los del presente estudio

Cdigo de Cepa PC97 PC83 PC85 PC88 PC91 PC93 PC98 PC99 PC100 PC104 PC105 PC106 PC107 PC96 PC84 PC113 PC116 PC94 PC117 PC109 PC114 PC118 PC95 PC120 PC115 PC97 PC94 PC121 PC112 PC110 PC90 PC89 PC92 PC103 N de cepas Frecuencia (%)

Identificacin Fenotpica preliminar N. asteroides N. asteroides N. brasiliensis N. asteroides N. otitidiscaviarum N. otitidiscaviarum N. brasiliensis N. brasiliensis N. brasiliensis N. brasiliensis N.asteroides N. brasiliensis N. asteroides N. asteroides N.otitidiscaviarum N. asteroides N. asteroides N. asteroides N. asteroides N. asteroides N. asteroides N. asteroides N. brasiliensis N. brasiliensis N. asteroides N. asteroides N. asteroides A. pelletieri N. otitidiscaviarum N. brasiliensis N. brasiliensis N. brasiliensis N. asteroides N. brasiliensis

Identificacin Fenotpica definitiva Complejo N. asteroides N. otitidiscaviarum N. brasiliensis Complejo N. asteroides N. otitidiscaviarum N. otitidiscaviarum N. brasiliensis N. brasiliensis Complejo N. asteroides N. brasiliensis Complejo N. asteroides N. otitidiscaviarum Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides N. otitidiscaviarum Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides N. brasiliensis N. brasiliensis Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides Complejo N. asteroides N. brasiliensis N. otitidiscaviarum N. brasiliensis N. brasiliensis N. brasiliensis Complejo N. asteroides N. brasiliensis

Coincidencia SI NO x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 30 4 88,24 11.76

Cepas NI

Cepas I

0 0

0 0

Cepa NI = cepa no identificada por los substratos utilizados Cepa I = cepa identificada

Tabla 5. Comparacin entre los resultados originales obtenidos por el laboratorio 3 y los del presente estudio

Cdigo de Cepa RC1 PC3 PC4 PC7 N de cepas Frecuencia (%)

Identificacin Identificacin Fenotpica definitiva Fenotpica preliminar Complejo N. asteroides N. brasiliensis N. asteroides Nocardia sp N. brasiliensis N. otitidiscaviarum Complejo N. asteroides N. brasiliensis

Coincidencia SI NO x x x x 0 4 0 100

Cepas NI

Cepas I

0 0

0 0

Cepa NI = cepa no identificada por los substratos utilizados Cepa I = cepa identificada

composicin especfico de N. brasiliensis. Si bien, Actinomadura se asemeja a Nocardia en muchas de sus caractersticas de cultivo, difieren en que forman un micelio areo especializado que produce esporas frecuentemente en cadenas, en lugar de un micelio vegetativo que se fragmenta. Al mismo tiempo es importante mencionar que esta

especie tambin se presenta como agente etiolgico del actinomicetoma en regiones de Venezuela [2,5]. La concordancia ms elevada entre la identificacin preliminar y la obtenida posteriormente en este estudio la obtuvo el laboratorio 2 (88,2%), el cual utiliz 3 substratos en la identificacin preliminar de las cepas (casena, tirosina y xantina). El laboratorio 1, utilizando 4 de los substra-

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tos (casena, xantina, hipoxantina y tirosina), slo logr una concordancia de 26,7% (9 cepas). Las diferencias obtenidas en el proceso de identificacin pudieron deberse a errores de interpretacin al momento de realizar la lectura de las pruebas de descomposicin de substratos, ya que son pruebas difciles de interpretar. Segn los resultados de este estudio, las mayores dificultades se presentaron sobre todo en la identificacin de N. otitidiscaviarum. No hubo concordancia en la identificacin fenotpica de las 4 cepas que provenan del laboratorio 3, y la informacin sobre las pruebas utilizadas en la identificacin preliminar no estuvo disponible. Es importante sealar que todas las cepas utilizadas en este estudio provienen de colecciones de cultivo; han sido conservadas durante un tiempo prolongado, lo que puede influenciar el resultado de las pruebas de identificacin, sumado a que probablemente no se les realiz la actualizacin taxonmica segn las directrices propuestas actualmente. Por otra parte, si estas cepas son manipuladas con frecuencia corren el riesgo de contaminarse, afectando negativamente su identificacin posterior. Se recomienda que, una vez que las cepas sean aisladas y purificadas, se conserven segn los procedimientos adecuados. Finalmente, la metodologa empleada en este estudio permiti la reclasificacin taxonmica de casi todas las cepas estudiadas, lo que sugiere que es necesario estandarizar la metodologa de identificacin para los actinomicetos. Se consider que el proceso de identificacin mejor muchsimo cuando, adems de los estudios morfolgicos se realizaron estudios fisiolgicos convencionales, utilizando los substratos adenina, hipoxantina, xantina, cido rico, testosterona, tirosina y casena, elaborados bajo las condiciones de preparacin y esterilizacin antes descritas, los cuales mejoraron la calidad de cada substrato, asegurando as su degradacin por parte de la bacteria. Dada la importancia de contar con una adecuada identificacin de los miembros del gnero Nocardia, se recomienda la utilizacin de las pruebas fenotpicas utilizadas en este estudio para identificar y/o confirmar la taxonoma de los mismos, as como promover la capacitacin del personal que se encarga de realizar estas tareas en el laboratorio. Es necesario establecer un sistema nico que describa los procedimientos de aislamiento e identificacin de las principales especies de Nocardia, ya que tienen estrecha relacin con la calidad de la preparacin de los substratos utilizados. Esto evitar problemas de identificacin importantes que podran afectar posteriormente el conocimiento del impacto clnico y microbiolgico que tienen estas especies en nuestro pas. Lo que se pretende es mejorar la calidad del diagnstico. Por otra parte, en caso de presentarse dificultades en la identificacin, se debe contar con la ayuda de un laboratorio de referencia, el cual contribuya a la mejora continua de la calidad del diagnstico y aporte respaldo a los resultados obtenidos.

Agradecimientos A los laboratorios participantes se les agradece su valiosa colaboracin al proveer las cepas para la realizacin de este estudio. Agradecemos al convenio ECOS-Nord N V06S01 (Francia-Venezuela, ULA-FONACIT). Un reconocimiento especial para el personal del laboratorio del Observatorio Francs de Nocardiosis de Lyon, Francia, por su gran colaboracin en todo momento, desde el inicio de este trabajo. Referencias
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