Deteccin alimentos

de

Staphylococcus

aureus

en

Grupo: 04 Equipo: 1 Integrantes

Objetivos Realizar adecuadamente la cuantificacin de Staphylococcus aureus en alimentos, mediante la tcnica descrita en la Norma Oficial Mexicana. Explicar el fundamento de todas las etapas del mtodo de deteccin de Staphylococcus aureus en alimentos.

Etiqueta de la Muestra:

Muestra: Fresas con Crema. Estado fsico de la muestra: Solido. Fecha: 28/ 02/ 2013 Hora: 07:00 am Nombre de la persona que tomo la muestra: Gachuz Lpez Gabriela. Temperatura: aproximadamente 20C Apariencia general de la muestra: Buen color, buen olor, producto fresco, recin elaborado. Apariencia general del lugar: Limpio

Tcnica Analtica (son los diagramas de cada una de las integrantes del equipo, que se integran al reporte). Resultados

1.- Aislamiento selectivo.

No hubo desarrollo de Staphylococcus aureus en las cajas Petri con Agar Baird Parker, para nuestra muestra (Fresas con Crema). Por lo que ya no se prosigui a la realizacin del punto 2 y 3. 2. Recuperacin de la cepa. 3. Pruebas bioqumicas. Al no encontrar en las cajas Petri colonias tpicas de Staphylococcus aureus, reportamos la sensibilidad de la metodologa empleada (extensin en superficie), que para este caso es de 100 UFC/g valor estimado para fresas con crema (muestra slida). Al no existir la presencia de S. aureus en el alimento recurrimos a tomar colonias de las cajas de Agar Baird Parker, dnde se sembr el control de este microorganismo, para la realizacin de los otros 2 pasos que consisten en la recuperacin de la cepa y las pruebas bioqumicas que nos ayudarn a confirmar la presencia y cuantificacin de esta especie en un alimento. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: 1. Aislamiento selectivo del control. Se sembr en el agar Baird Parker por agotamiento para obtener colonias aisladas.

Caractersticas macroscpicas de Staphylococcus aureus. (Control) Colonias negras circulares, brillantes, convexas, lisas, con dimetro de 1 a 2mm, muestran zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia. 2.-Recuperacin de la cepa (control) VISTA MICROSCOPICA
FECHA DE INOCULACIN: 28/ 02/ 2013 MUESTRA: tomada de un tubo que contena la cepa ya pura de Staphylococcus aureus para ser el control. TINCIN: Tincin de Gram. AUMENTO TOTAL: 1000 DESCRIPCIN: Gram positivo MORFOLOGA: cocos AGRUPACIN: Estafilococos, ttradas, diplococos.

VISTA MACROSCOPICA
Fecha de inoculacin: 28/ 02/ 2013 Fecha de observacin del crecimiento: 30/ 02/ 2013 Microorganismo: Staphylococcus aureus Medio de cultivo: Agar Baird Parker Tcnica de inoculacin: Estriado en cuadrante radial. Incubacin: 37C / 24 hrs

Observaciones: Caractersticas coloniales AGAR BAIRD PARKER. Forma Circular, conexa Color Negro, brillosas Elevacin Convexa Textura butirosas Aspecto/ Caract. Zona circular opaca, halo blanco alrededor de la

colonia.

CUADRO 1. Nmero de colonias a evaluar de S. aureus Cuenta total de colonias Colonias sospechosas a sospechosas en una caja caracterizar bioqumicamente representativa 51 a 100 UFC 5 Inoculacin de colonias aisladas y seleccionadas caractersticas de este microorganismo, segn el cuadro anterior BHI

3.- Pruebas bioqumicas del control 3.1.- Prueba de la presencia de la enzima coagulasa

Cuadro 2. Interpretacin de las reacciones en la prueba de la coagulasa Valor Caractersticas Formacin de cogulo 2+ (positiva) pequeo organizado Aparicin del coagulo: despus de 3 horas. Slo en los tubos que corresponden a las colonias 1, 3, 4, y 5

3.2.- Prueba de la enzima termonucleasa (control)

Al adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0.1M si existe una coloracin rosa brillante

# de Colonia EnzimaTermonucleasa 1 Negativa 2 Negativa 3 Positiva 4 Positiva 5 Positiva

3.3.-Prueba de fermentacin de manitol en anaerobiosis control Manitol + por el vire del indicador rojo de fenol a color amarillo #de Colonia 1 2 3 Prueba de Manitol Positiva Positiva Positiva

4 5

Positiva Positiva

3.4.- Prueba de la Catalasa (control) # de Colonia Enzima Catalasa 1 Negativa 2 Negativa 3 Positiva 4 Positiva 5 Positiva Clculos y expresin de resultados del control S. aureus toxignico Cmo este es un anlisis del control, el cual no provena de alguna dilucin conocida, se har un ejemplo de los clculos considerando las UFC encontradas en la caja Petri con Agar Baird Parker del control y las colonias caracterizadas que resultaron positivas para todas las pruebas bioqumicas (del control).

Al analizar un sope de la Facultad de Qumica se encontr que la caja Petri representativa estadsticamente contena 58 UFC sospechosas de contener a S. aureus . stas se localizaban en la caja Petri con agar Baird Parker que corresponde a una dilucin diez a la menos tres (0.001g/mL) y de esta dilucin se inocul 0.1 mL ( =0.0001g de muestra inoculada), extendiendo el inculo con una varilla de vidrio en forma de L, posteriormente se incub a 35 2 C durante 48 hrs, obteniendo los resultados antes mencionados (58 UFC). De las colonias caractersticas y tomando en cuenta el cuadro nmero 1, se tomaron 5 colonias para caracterizarlas bioqumicamente. De estas 5 colonias analizadas, solamente 3 resultaron positivas para todas las pruebas bioqumicas realizadas. Se pregunta: 1) Cuntas UFC/g de S. aureus toxignico, se encuentran en este alimento? 2) Se puede consumir el alimento? El razonamiento de los clculos es el siguiente: a) Determinar el porcentaje de colonias de S. aureus toxignico. Cinco colonias representan el 100 % de UFC muestreadas, tres colonias positivas, a qu porcentaje corresponden? 5UFC--------------------------------------- 100% 3UFC--------------------------------------- x X= 60% Enseguida, de las 58 UFC encontradas en esta dilucin (que contiene 0.0001 g de alimento), se dice que 58 UFC estn en 0.0001 g de muestra, cuntas UFC habr en 1.0 g de alimento? 58UFC----------------------------------------- 0.0001 g X ----------------------------------------- 1 g X= 580,000 UFC/g de alimento. De las 580,000 UFC/g de alimento, solamente el 60% de ellas son toxignicas, entonces cuntas UFC toxignicas/g de alimento, se encuentran en este alimento?

580,000 UFC/g------------------------------------- 100% X ------------------------------------ 60% X= 348,000 UFC/g El resultado debe expresarse en forma exponencial, tomando en cuenta solamente los 2 primeros dgitos: X= 35x UFC/g

Estas 350,000 UFC/g de alimento (35x UFC/g), de acuerdo a Jablonski et. al presentan riesgo para la salud pblica, ya que cada 20 min se va duplicando la poblacin de S. aureus toxignico llegando as en un tiempo corto a representando nmeros de UFC potencialmente riesgosas que pueden causar intoxicacin alimentaria. Por lo que el alimento no se debe de consumir.

Anlisis de Resultados En las cajas Petri con Agar Baird Parker, dnde se inoculo por extensin en superficpie 0.1 mL de cada dilucin, NO se encontr desarrollo de Staphylococcus aureus, esto lo vemos en la imagen reportada en resultados, donde podemos ver que no hay desarrollo, ni caractersticas que demuestren la presencia del microorganismo, los puntos que se ven en la imagen corresponde a otra especie de estafilococos, se propone que son Staphylococcus epidermidis porque est especie de estafilococos tambin se desarrolla en este medio, las caractersticas de crecimiento corresponden a estas colonias, ya que eran colonias negras, tamao irregular, con zona opaca alrededor de la colonia sin la zona clara alrededor, que es la que caracteriza a S. aureus y no podra ser algn otro gnero de microorganismo debido a que el medio Baird Parker es un medio de alta especificidad diagnstica, selectivo y diferencial para el aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva en alimentos, el cloruro de litio y el telurito potsico suprimen el crecimiento de microorganismos no deseados inhibiendo el desarrollo de ellos.

Con esto podemos decir que la nica contaminacin que encontramos presente en nuestro alimento analizado (fresas con crema) son S. epidermidis los cuales se encuentran en la piel humana, llegando a nuestra muestra por un mal lavado de manos previo a la preparacin de estas o a una contaminacin cruzada durante la elaboracin del producto. Anlisis de resultados del control Mediante una colonia caracterstica del Agar Baird Parker del control pudimos realizar una tincin en la que confirmamos que se tena la presencia de un microorganismo gram (+), al ser vistas de manera macroscpica pudimos observar las caractersticas similares que corresponden a Sthaphylococcus aureus como color negro, brillosas, halo blanco alrededor de la colonia. Se hizo el conteo de las colonias y detectamos 58 UFC en la caja Petri por lo que se prosigui a caracterizar 5 colonias sospechosas con pruebas bioqumicas, en las cuales slo 3 de las 5 colonias dieron positivo en todas las pruebas. La prueba de la coagulasa nos es de gran utilidad para detectar a S.aureus, el resultado positivo indica que la muestra contiene al microorganismo, la coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre formando un complejo llamado estafilotrombina, permitiendo que la enzima proteasa convierta el fibringeno en fibrina esto permite que la sangre coagule. La coagulasa se relaciona con la superficie de S. aureus porque puede cubrir su superficie con fibrina al tener contacto con sangre, est cubierta de fibrina es capaz de resistir la fagocitosis, haciendo de S. aureus un microorganismo de mayor virulencia. La prueba de DNasa se utiliza principalmente para determinar a los estafilococos denominados patgenos potenciales. La desoxirribonucleasa de S. aureus difiere de otras DNasas en que requiere calcio como un catin activador (cofactor), tiene un pH ptimo ms alto casi de 9 degradando el DNA ampliamente, presenta termoestabilidad alta resistiendo la ebullicin (100C) durante 15 min, obteniendo nucleasa termoestable, siendo as un indicador de S. aureus en la literatura se presenta como una propiedad constante en este microorganismo, ya que ninguna otra especie de estafilococos la presenta. La prueba del Manitol en anaerobiosis es para detectar a S. aureus ya que fermentan lentamente a los carbohidratos, como el manitol. La prueba resulto positiva en el medio que contena el indicador rojo de fenol, virando a color amarillo, indicndonos la capacidad de S.

aureus de fermentar el manitol degradndolo hasta cido sin produccin de gas; la prueba se lleva bajo condiciones de anaerobiosos debido a que S. aureus tiene un metabolismo anaerobio facultativo. La prueba de la catalasa nos dio positiva en algunas de las colonias caracterizadas indicndonos as que si contienen la enzima catalasa, la cual le es de gran utilidad a S. aureus para evitar la formacin de radicales txicos que se forman por el sistema de la mieloperoxidasa en las clulas fagocticas, evadiendo as los mecanismos de defensa en el husped, subsistiendo y multiplicndose dentro del mismo.

Conclusiones Las Fresas con crema que analizamos para detectar Staphylococcus aureus, muestran ser casi seguras al consumo humano, de acuerdo a la NORMA Oficial Mexicana NOM-243SSA1-2010, Productos y servicios. Leche, frmula lctea, producto lcteo combinado y derivados lcteos. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Donde se nos reporta lo siguiente para Staphylococcus aureus en cremas, un ingrediente principal para la elaboracin de nuestro alimento.
<100 UFC/g o mL
Mantequilla, cremas, leche condensada azucarada, leche fermentada o acidificada, dulces a base de leche. Quesos madurados y quesos procesados

Lo cual cumpli nuestro alimento ya que no encontramos colonias caractersticas de S. aureus durante el aislamiento selectivo. Para las fresas que se usan no encontramos reportado la cantidad permitida en UFC/g o mL de Staphylococcus aureus en la NMX-F131-1982. ALIMENTOS PARA HUMANOS. FRUTAS Y DERIVADOS. MERMELADA DE FRESA.

Al no tener desarrollo de este microorganismo desde la primera etapa del mtodo que consiste en un aislamiento selectivo; podemos decir que este producto al ser elaborado cumple con las buenas prcticas de Higiene, reportndolo slo con la sensibilidad mnima del mtodo de 100UFC/g valor estimado de fresas con

crema, cumple con las normas antes mencionadas lo que lo hace un alimento seguro para ser consumido.

Bibliografa
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-115-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodos para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. NMX-F-131-1982. ALIMENTOS PARA DERIVADOS. MERMELADA DE FRESA. HUMANOS. FRUTAS Y

NORMA Oficial Mexicana NOM-243-SSA1-2010, Productos y servicios. Leche, frmula lctea, producto lcteo combinado y derivados lcteos. Disposiciones y especificaciones sanitarias.