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PRUEBAS BIOQUMICAS PARA IDENTIFICACIN DE BACTERIAS Mera Trochez Leidy Lise h !"#$!%#& Ci'(e) es Becerra *essica !"++,%& Paz P-rez Die.o !"$/$$% A0ri1 de /!!, 2r(3o 4/ Res(5e) En la prctica realizada en el laboratorio se implemento cepas conocidas de enterobacterias y luego de diversas pruebas bioqumicas realizadas se identific su gnero y especie. De estas se realizo una siembra por agotamiento en agar Mc Con ey !medio que separa colonias fermentadas de lactosa". # las colonias aisladas procedentes del agar Mc Con ey se le realizaron las siguientes pruebas bioqumicas$ %&'( lisina descarbo)ilasa( citrato de &imons( urea de c*ristensen( prueba de 'ndol( reaccin de ro+o de etilo( reaccin de ,ogues -roscaver y movilidad( con+untamente los reactivos$ reactivo de .ovacs( ro+o metileno( sulfato de cobre( como ya es de suponerse se utilizo las asas !punta y argolla"( el mec*ero y se implemento las tcnicas de asepsia. En si la bacteria que se pudo identificar con las pruebas mencionadas es la &erratia marcescens pues las caractersticas de esta coincidieron en gran parte con los resultados obtenidos en la practica. #dems se realizo la caracterizacin bioqumica del /acillus cereus con un diagnostico bacteriolgico( se utilizo el agar con la cepa de /acillus Cereus( una ca+a de petri dividida en cuatro partes$ agar nutritivo( agar lec*e( agar almidn y agar gelatina( adems de los reactivos !solucin lugol( reactivo de giress( cloruro de mercurio al 012"3 tambin se utilizo para esta caracterizacin tubos de ensayo con caldo nutritivo( caldo glucosa( caldo arabinosa y caldo )ilosa las asas y el mec*ero.

I) rod(cci6) 4a familia de Enterobacterias comprende un grupo relativamente *omogneo de -roteobacterias 5ama( que se caracterizan fenotpicamente por lo siguiente$ gran negativos( bacilos no esporulados( no mviles o si lo son es por flagelos de

insercin peritrica( anaerobios facultativos( o)idasa negativa( con requerimiento nutricionales relativamente simples y fermentan azucares con diversos productos finales. !M#D'5#6( 7889" 4a diferenciacin entre una y otra especie de las Enterobacterias se basa principalmente en la

determinacin de la presencia de sus enzimas. Estas enzimas pueden ser identificadas utilizando medios de prueba !:pruebas bioqumicas;"( que contienen los sustratos especficos para ellas e indicadores que puedan evidenciar la utilizacin de este sustrato por la presencia de compuestos intermediarios o finales de su metabolismo. 4a mayora de las bacterias de esta familia presentan las siguientes caractersticas bioqumicas$ <=ermentan glucosa. <6o poseen enzima citocromo o)idasa. <>educen nitratos a nitritos. 4os /acillus Cereus es una especie microbiana integrada por bacilos voluminosos( esporulados( con espero central o subterminal( pero no aumenta el tama?o del germen. 5eneralmente mvil( mediante flagelos peritricos( aunque e)isten especies inmviles3 5ram positivos. &e encuentra en una amplia gama de ambientes$ suelo( polvo( barro( aguas( vegetacin3 puesto que es un germen esporulado( su amplia distribucin en el ambiente da lugar a su acceso a varios alimentos dando lugar a into)icaciones a la *ora de su consumo. De la misma forma que se utiliza para la identificacin de especies de la familia Enterobacterias( se puede usar tambin para identificar las especies del genero /acillus !-#&C@#4( 0AAA". M- odos y Ma eria1es7

4os materiales utilizados durante el laboratorio fueron$ #sa de punta #sa de argolla #gar Mc Con ey Mec*ero %ubo de ensayo con %&'( Citrato de &imons( @rea de C*ristensen. >eactivos .ovacs >o+o metileno &ulfato de cobre Ca+a petri con medios de agar lec*e( agar almidn( agar gelatina y agar nutritivo Caldo glucosa Caldo arabinosa Caldo )ilosa Cloruro de Bg al 012 4ugol >eactivo de griess

#ntes de comenzar con el laboratorio( se utilizo tcnicas de asepsia( para evitar la contaminacin durante la manipulacin de los cultivos estriles( tales tcnicas fueron$ limpiar la mesa y lavar las manos con alco*ol( tener el mec*ero encendido durante la practica y quemar el asa *asta el ro+o vivo siempre que fuera ser utilizado.

Despus de *aber aplicado todas las tcnicas de asepsia( se procedi a identificar las caractersticas del agar Mc Con ey !=ig.0" ya preparado( posteriormente se realizo las siembras bioqumicas. 4a primera siembra fue en un medio %&' y 4isina Decarbo)ilasa( esta se realizo con el asa de punta( se tomo un poco de muestra del agar Mc Con ey se sembr de dos formas punzando y en superficie. 4a segunda siembra se llevo a cabo en Citrato de &imons y @rea C*ristensen esta fue sembrada en la superficie con el asa de punta. 4a tercera siembra se realizo en el medio &'M el cual fue punzado en un solo sitio con el asa de punta3 por ultimo con el asa de argolla se tomo una muestra del agar Mc Con ey( y se mezclo en los caldos M>,-. 4uego de las siembras se incubo por 79 *oras a CD oC y despus de este tiempo se identifico cambios en su apariencia y se realiz la respectiva caracterizacin bioqumica. -osteriormente la caracterizacin bioqumica en la siembra de &'M se *izo con la prueba de indol( agregando reactivo de .ovacs3 a uno de los caldos de M>,- se le agrego 1 gotas de ro+o etileno y al caldo sobrante se le agrego 1m4 de sulfato de cobre. De esta forma se podr saber cual fue la enterobacteria que se sembr en el agar Mc Con ey.

Fi.(ra 89 A.ar Mc Co):ey 4a segunda parte del laboratorio consisti en realizar siembras bioqumicas de una muestra identificada como /acillus Cereus !fig.7"( con el asa de punta se tomo un poco del cultivo bacteriano y se sembr en la ca+a de petri que contenan los medios de agar lec*e( agar almidn( agar gelatina y agar nutritivo( con el asa se les *izo una lnea en la superficie. De la misma forma( con el asa de argolla se tomo muestra bacteriana y se mezcl con el caldo nutritivo( el caldo de glucosa( caldo arabinosa y caldo )ilosa. &e incubo a CD oC por 79 *oras3 despus de este tiempo se observaron los cambios en la apariencia( *aciendo caracterizacin bioqumica para comprobar que la bacteria utilizada si era /acillus Cereus. -osteriormente al agar gelatina se le agreg 1 gotas de cloruro de Bg al 012( despus de 1 minutos se elimino con agua. #l agar almidn se le cubri la superficie con 4ugol3 y por ultimo al caldo de nitrato se le adiciono unos miligramos de

reactivos de 5riess3 Cada prueba fue analizada y registrada.

Fi.(ra /9 Cere(s

C(1 i;o

de

Baci11(s

realizacin de tres pruebas simultaneas$ utilizacin de azucares !glucosa y lactosa"( produccin de gas y produccin de acido sulf*drico. &on medios utilizados preferentemente para la diferenciacin de enterobacteria. En la interpretacin de %&' las reacciones obtenidas fueron$ en el fondo un color amarillo y en la superficie un tono ro+izo !fig.C"( lo que demuestra que no se produ+o gas por lo tanto no produ+o B 7&( pero si ferment glucosa !.E#".

Res(1 ados y Disc(si6) %omando de una enterobacteria desconocida se sembr en #gar Mc Con ey( con este agar se tomo todas las muestras a analizar. #gar Mc Con ey se interpreta como no fermentador y en fermentador( se analiza dependiendo al color( el color ro+izo es no fermentador (este fue el que se utilizo en la practica para la diferenciacin de bacterias3 y el tono fucsia es cuando el medio es fermentador3 por lo que el agar Mc Con ey es un medio de cultivo rico en lactosa y es empleado como un medio de cultivo diferencial debido a que se pueden mostrar caractersticas concretas de ciertas bacterias mediante la incorporacin de sustratos al medio. !Bernandez(788D" Despus de la incubacin cada siembra tuvo su respectiva prueba bioqumica3 el %&' o agar *ierro liger( es un medio de cultivo que permite la

Fi.(ra $9 TSI El #gar de Bierro y 4isina es un medio utilizado para la diferenciacin de microorganismos entricos en base a su capacidad para desaminar o descarbo)ilar la lisina y de producir sulfuro de *idrgeno. Este medio tambin es conocido como 4'# EdFards y =ife desarrollaron este medio para diferenciar a &almonella arizonae. Debido a que &. arizonae fermenta la lactosa rpidamente( la produccin de B7& es suprimida en el #gar de Bierro y %riple #zGcar.

Eliminando la lactosa e incorporando la lisina( EdFards y =ife encontraron que este medio diferencia a los bacilos entricos en base a su capacidad para descarbo)ilar o desaminar la lisina y producir B7&. Este medio es especialmente recomendado para la identificacin de bacilos que fermentan rpidamente la lactosa. En este medio la peptona provee la fuente de carbono y nitrgeno. El e)tracto de levadura provee vitaminas y cofactores para el crecimiento. 4a de)trosa es la fuente de energa. El *idrocloruro de 4<lisina es el sustrato donde actGan las enzimas descarbo)ilasa o desaminasa. El citrato frrico de amonio y el tiosulfato de sodio actGan como indicadores de la produccin de B7&. El pGrpura de bromocresol es un indicador de pB. El agar es adicionado como agente solidificante. !EDH#>D&( 0AI0" Cuando se desarroll la prueba de la lisina se observo que no obtuvo una coloracin diferente despus de 79 *oras( mantuvo su color violeta( en este caso una prueba negativa( as se pudo determinar que la muestra no tiene la caracterstica propia de la salmonella arizonae que es de descarbo)ilar la lisina *aciendo que el color del agar vire a amarillo !fig.9" Fi.(ra #9 Lisi)a C'%>#%J DE &'MMJ6&. &e desarrolla para demostrar la presencia de microorganismos que pueden utilizar el citrato como Gnica fuente de carbono y energa y el amoniaco como principal fuente de nitrgeno y se emplea para diferencia a los distintos miembros de las Enterobacterias. &obre la superficie del medio( que contiene como indicador azul de bromotimol( se inocula las bacterias en pendientes y la utilizacin del citrato se demuestra por la reaccin alcalina y el cambio de coloracin del indicador( que pasa de verde oscuro a azul !#ulton( 7889". &e determin que la prueba fue positiva ya que sufri un vira+e en su color debido a que las bacterias metabolizaron el citrato liberando iones al medio !fig.1".

fenol la *ace tonar ro+a!=ig.I" as pues la prueba es positiva.

Fi.(ra <9 CITRATO DE SIMMONS A.ar Urea de Chris e)se)& Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos molculas de amoniaco por accin del enzima ureasa. Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este gnero de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. -ara revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubacin ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco despus de la inoculacin y sus resultados deben ser ledos en las primeras 7<I *oras( mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 79<9K *oras de incubacin. !Cortes( 7880"

4a prueba demostr que *ubo actividad de la enzima ureasa pues su coloracin fue de ro+iza pues degrad la urea en dos molculas de amoniaco as el indicador ro+o de

Fi.(ra %9 Urea de Chris e)se) En el medio &'M se determino la movilidad( se observo que no se produ+o crecimiento entorno a la zona inoculada3 por lo tanto se pudo concluir que no tiene movilidad3 lo que significo que la prueba era negativa3 despus de determinar esto( se llevo a cabo la prueba '6DJ4( el 'ndol es un componente del aminocido triptfano. #lgunas bacterias tienen la capacidad de romper el triptfano con fines nutritivos( utilizando la enzima triptofanasa. Cuando se rompe el triptfano puede detectarse la presencia del indol mediante el reactivo de .ovacs( que es amarillo y que( al reaccionar con el 'ndol( produce color sobre la superficie del tubo de ensayo !5onzlez( 7889"( tambin se pudo establecer que la prueba indol fue negativa debido a

que no mostro vira+e en la parte superior por lo tanto no *ay presencia de indol. En el caldo de M>,- despus de que fue agregado 1 gotas de ro+o etileno( permiti determinar que el pB del caldo descendi por deba+o de 9.9 lo que indico que es totalmente acido( por lo tanto que es positiva3 la prueba del ro+o de metilo se utiliza para distinguir entre los microorganismos que producen y mantienen concentraciones elevadas de acidez( y los que producen acido inicialmente( pero que al continuar su metabolismo recuperan las condiciones de neutralidad. @n color ro+o indicara la produccin de acido !positivo" !fig.D" y un color amarillo( la presencia de lcalis !negativo". !#ulton( 7889"

4as pruebas *asta a*ora descritas *icieron posible la identificacin de una bacteria desconocida( al comparar los resultados con el cuadro de reacciones bioqumicas de algunas enterobacteria !tabla ane)a"3 la bacteria desconocida fue -roteus ,ulgaris. En la segunda parte del laboratorio se corroboro que la bacteria utilizada fue el /acillus Cereus( debido a que el almidn se le agrego solucin de 4ugol para determinar la capacidad de producir una enzima que *idrolice al almidn. 4a observacin fue que el bacilo Cereus fue resistente al colorante o sustancia y pudo *idrolizar al almidn formndose un *alo transparente alrededor del almidn. #l igual sucedi con la gelatina( el /acillus Cereus si *idrolizo( ya que en esta apareci una zona clara alrededor de la siembra. En el agar lec*e se observa una zona clara alrededor del crecimiento de la bacteria lo cual indico degradacin de la casena. En la =ig.K se puede observar el agar con sus respectivas siembras.

Fi.(ra +9 Ca1do de MR=P des3(-s de >(e '(e a.re.ado < .o as de ro?o e i1e)o #l caldo sobrante de M>,- se le adiciono 1 m4 de sulfato de cobre no provocando un vira+e ro+o en la parte superior lo cual ndico que es negativa la prueba3 a esta prueba se le llama >eaccin de ,ogues -roscaver.

Estas pruebas generalmente determinan la actividad de una va metablica !con+unto de reacciones qumicas" a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. De esta forma se pudo determinar que la enterobacteria que se utilizo para las siembras fue la&erratia marcescens( ya que al ser comprados todos los resultados de las pruebas bioqumicas( la mayor similitud las presento esta /acteria. #dems se pudo que la bacteria utilizada en otras siembras fue la /acillus Cereus( ya que los resultados de las pruebas bioqumicas son las que identifican esta bacteria. Cabe aclarar que en este laboratorio se utilizo una forma de interpretacin de datos no muy certera( ya que la interpretacin de estos se *ace de una forma mas completa( la cual es por medio de valores y probabilidades. Muc*as son las bacterias que pueden contaminar y da?ar un alimento( por lo cual es necesario saber que tipo de microorganismo es el causante del deterioro y como prevenirlo o en tal caso destruirlo. Bi01io.ra'@a

Fi.(ra "9 A.ar 1eche& a15id6)& )( ri i;o y .e1a i)a9

En los caldos de glucosa( arabinosa y )ilosa se pudo identificar que en la glucosa *ubo fermentacin( por lo tanto no *ubo presencia de gas3 en la arabinosa y )ilosa no *ubo fermentacin( ya que su coloracin no fue muy parcial. El caldo de nitrato no manifest la capacidad de transformar los 6itratos en 6itritos( ya que no se presento cambio de color en la muestra( lo cual indico negativa. Co)c1(sio)es #l finalizar este laboratorio se pudo determinar que las pruebas bioqumicas son muy importantes a la *ora de identificar un aislamiento bacteriano( este puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes.

<#@4%J6( M'CB#E44 E. =armacia$ Ciencia y dise?o de formas farmacuticas. &egunda edicin. Espa?a 7889 <LJ&E #. CJ>%E& !7880".Recursos Didcticos para Biologa. *ttp$EEFFF.+oseacortes.comEmicrobiol ogiaEpruebasbioqEureasa.*tm <5J6M#4EM DE /@'%>#5J( LJ&E M#6@E4. %cnicas y mtodos de laboratorio clnico. &egunda edicin. Espa?a 7889 <BE>6#6DEM #>%E#5#( EM'4'J. Microbiologa basada en la resolucin de problemas. Espa?a 788D

<M#D'5#6( M'CB#EE4 %. /roc biologa de los microorganismos. Decima edicin. Espa?a 7889 <-#&C@#4 #6D>E&J6( M#>'# DE4 >J&#>'J. Microbiologa alimentaria$ Metodologa analtica para alimentos y bebidas. &egunda edicin. -ublicado por Ediciones Daz de &antos( 0AAA

TABLA ANEAA

RESULTA PRUEBA DOS PRACTICA < < .E# < < < < MR=P SIM 2AS C/S TSI MO=ILIDAD INDOL C/S =O2UES PROSCA=E R RO*O DE METILO

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Pro e(s =(1.aris N N .E# N N N <

Sa15o)e11a y3hy < N .E# N < N <

B1e0sie11a P)e(5o)iae N < .E# < < < D

Serra ia Marcesce)s No< < .E# N < < N

N < #E# N N < <

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CITRATO UREA LISINA Lac osa

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