Transformacin bacteriana en E. coli.

Introduccin
La transformacin es el proceso en el que las clulas procariontes toman DNA exgeno del ambiente, alterando a su fenotipo y el de sus descendientes. En general la entrada del DNA a las clulas es independiente de la fuente del DNA (o de sus secuencias , pero es muy dependiente del estado f!sico"qu!mico del DNA (tama#o, $ebra simple o doble, lineal o circular, rela%ado o superenrollado . La eficiencia con la que la clula blanco tima el DNA exgeno &ar!a ampliamente entre especies procariticas y dentro una especie, de las cepas . Algunas especies pueden ser manipuladas en el laboratorio para incrementar la eficiencia con la que toman el DNA. Las clulas pre"tratadas que toman el DNA m's eficientemente se dice que son (competentes). El efecto que tiene el DNA al entrar en una clula blanco y en los descendientes depende completamente de la secuencia espec!fica del DNA exgeno. El DNA exgeno pasar' a la descendencia slo si este se integra en el material gentico de la clula blanco o si el mismo tiene un origen de replicacin ( ori , que funcione en la clula blanco. *ransformaremos clulas de E. coli para demostrar la $abilidad de este DNA para modificar permanentemente la $erencia gentica de las clulas que lo adquieren. +e transformar' con un pl'smido que contiene su propio ori y un gen de resistencia a antibitico. Las clulas blanco que adquieran el pl'smido se transformar'n, de un fenotipo sensible al antibitico, a otro, resistente al antibitico. Despus de me,clase con el pl'smido, encontraremos a las clulas resistentes al antibitico sembrando las clulas tratadas sobre ca%as de agar que contienen antibiticos. El antibitico matar' cualquier clula que no adquiero al pl'smido.

Procedimiento
Preparacin de bacterias competentes con cloruro de calcio.
-. Descongelar un glicerol (stoc.) de la cepa adecuada de E. coli, adicionarlo a un matra, Erlenmeyer de /01 ml con 01 ml de medio *2 /3 precalentado e incubarlo a 45 67 en un ba#o de agua durante una $ora sin agitacin. 8osteriormente incubarlo de / a 4 $oras a 45 67 con agitacin a /01 rpm. La densidad ptica del culti&o no debe sobrepasar 1.9 en el momento de la cosec$a. /. *ransfiera :1 ml del culti&o a un tubo de centr!fuga de polipropileno de 01 ml y colecte las clulas por centrifugacin a 0111 rpm durante 9 minutos a : 67 en una centr!fuga con un rotor ;A/1 o similar. 4. Decantar el sobrenadante y resuspender el botn en la mitad del &olumen (/1 ml de cloruro de calcio 01 m< frio, incubar durante /1 minutos en ba#o de $ielo, centrifugarlo como anteriormente. :. Decantar el sobrenandante con muc$o cuidado y resuspender el botn en la dcima parte del &olumen inicial (: ml de cloruro de calcio 01 m< fr!o, esto nos dar' las suspensin de clulas competentes.

Preparacin de clulas competentes para almacenar congeladas

-. *ransferir -== l de las clulas competentes en un tubo Eppendorf de -,0 ml estril.

/. Adicionar 4: l de glicerol -11> &?& estril a las al!cuotas de -== l de la solucin de clulas competentes, dando una concentracin final de -5> de glicerol. 4. Las clulas competentes se colocan a "51 67 y pueden guardarse indefinidamente. :. 8ara usarse, sacar del congelador y de%ar descongelar por algunos minutos a 45 7. +eguir la tcnica de transformacin.

Transformacin
Nota@ Es necesario traba%ar con muc$o cuidado para mantener la esterilidad y no contaminar las muestras. -. 7ada grupo tomar' dos tubos con /11 l de clulas competentes para la transformacin. Los tubos deber'n conser&arse sobre $ielo. /. Adicionar / l de pl'smido slo a uno de los tubos. Los dos tubos se incubar'n 41"=1 minutos sobre $ielo. (El tubo al que se le agreg el DNA es el experimento y al que no se le agreg nada es el control negati&o . 4. 7olocar ambos tubos en un ba#o de agua a :/A7 por B1"-/1 segundos. Cemo&er el tubo inmediatamente $acia el $ielo e incubarlo otros 0 minutos (Al finali,ar este paso el DNA presente debi entrar en algunas clulas . :. Adicionar B11 l de LD a cada tubo resupendiendo sua&emente las clulas. Encubar 41"=1 min, esto permitir' a las clulas recobrarse del trauma del tratamiento de competencia y empe,ar la expresin de los genes funcionales recin introducidos. 0. Despus de la incubacin, resuspender las clulas de ambos tubos y sembrar por separado -11 l de cada uno en ca%as con LD, o el antibitico al que confiera resistencia el pl'smido (generalmente 01 g?ml , pre&iamente etiquetadas, y esparcir uniformemente sobre el agar con una &arilla de &idrio doblada como bastn de $oc.ey esterili,ada mediante flameo con alco$ol. =. 8ipetear -.B9 ml de medio LD en cuatro tubos estriles y arreglelos en dos $ileras de tubos. 5. Agitar en &ortex el tubo con el culti&o tratado con el pl'smido e inmediatamente pipetear /1 l en el primer tubo de la primera serie y agite &igorosamente. Este tubo contendr' la dilucin - a -11. 7ambiar la punta de la pipeta e inmediatamente pipetear /1 ml de esta dilucin -@-11 al segundo tubo y agitar &igorosamente. +e reali,aron dos diluciones seriales -@-11. F7u'l es la dilucin final en el segundo tuboG A$ora repita las diluciones con el tubo del control negati&o. 9. Agitar la dilucin final y pipetear -11 l de clulas diluidas en ca%as con LD m'rquelas como (transformadas). Hntarlas en la superficie de la placa con la &arilla de &idrio esterili,ada. Cepetir el procedimiento para la dilucin final del tubo del control negati&o y m'rcar. B. Encubar las placas a 40"45 A7 toda la noc$e y re&isar si $ay crecimiento al otro d!a. 7ontar el nImero de colonias en las ca%as con LD"antibitico. -1. 7uente el nImero de colonias en las dos ca%as con LD. FDeber!a ser el nImero de colonias en estas dos ca%as similarG F8odr!a decir cuantas clulas &i&as $ab!a en los tubos de culti&o al iniciar el paso 0G

Anlisis del procedimiento

F7u'ntos ml de medio LD se requieren para la pr'cticaG F7u'ntos ml requieren agar y de esos cu'ntos ampicilinaG

Resultados
Llene la siguiente tabla.
7ontrol J colonias LD (dilucin -1": LD"amplicilina Kactor de dilucin L-?(1.- MN-1: -"1.7lulas J suspendidas colonias (cels?ml *ransformadas Kactor de dilucin -?(1.- MN-1: -"1.7lulas suspendidas (cels?ml

7alcular la proporcin del control de clulas transformadas (Jclulas no transformadas ? total de clulas O PPPPPPPP 7alcule la proporcin de clulas transformadas (Jclulas transformadas ? total de clulas O PPPPPPPP

Medios de cultivo
Caldo TY <ateriales@ *riptona Extracto de le&adura <atra, erlenmeyer 0g 4g -L

-< 7a7l/ esterili,ar en autocla&e aparte. 8rocedimiento@ Adicione 0 g de *riptona y 4 g de extracto de le&adura a - litro de agua. Esterili,ar en autocla&e. En condiciones estriles adicionar -1 ml de 7a7l / -<. NQ*A@ Endicar en la etiqueta que se le adicion calcio. +i se requiere slido, agregar -0 g?l de agar, esterili,ar y adicionar el calcio despus, llenar las ca%as con 41 ml de medio cada una aprox. LD. *riptona Extracto de le&adura g?L -1 0

Na7l

Bibliografa.
-. +ambroo., ;., Kritsc$, E.K., and <aniatis, *., <olecular 7loning@ A Laboratory <anual. 7old +pring Rarbor Laboratory 8ress, N2, Sol. -, /, 4 (-B9B . /. ;erpset$, ;., et al.,T3L-"Dlue <CKU E. coli cells@ <crA", <cr7D", <crK", <rr", RsdC" deri&ati&e of 3L-"Dlue cellsT +trategies =, 9- (-BB/ . 4. /. Vlo&er, D.<. DNA 7loning Solume E@ A 8ractical Approac$. ECL 8ress, Qxford, -B90.