Trabajo Cientifico 3

UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN
NICOLS DE HIDALGO

FACULTAD DE BIOLOGA

Estandarizacin y Validacin de la Tcnica de
Biobalstica para la inoculacin de Geminivirus
en plantas de Arabidopsis thaliana

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL TTULO DE:
BILOGO

PRESENTA:
Victoria Nancy Romero Gonzlez

DIRECTORES DE TESIS:
Dr. Rafael F. Rivera Bustamante
M.C. Diana L. Trejo Saavedra

Morelia, Mich., Marzo del 2006

Firmado digitalmente por
AUTOMATIZACION
Nombre de reconocimiento
(DN):
cn=AUTOMATIZACION,
c=MX, o=UMSNH, ou=DGB,
email=soporte@biblioteca.
dgb.umich.mx
Motivo: Certifico la precisin e
integridad de este documento
Fecha: 2008.02.20 11:09:15
+01'00'

El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Virologa Vegetal del
Departamento de Ingeniera Gentica del Centro de Investigacin y de
Estudios Avanzados CINVESTAV, Irapuato.

La investigacin fue apoyada por el proyecto 041 Rockerfeller Intereses

La tesis fue dirigida por el Dr. Rafael F. Rivera Bustamante y asesorada
por la M.C. Diana L. Trejo Saavedra.

Una de las tcnicas mas utilizadas para inocular plantas con virus es la
tcnica conocida como biobalstica o bombardeo con micropartculas. Esta
tcnica es un proceso muy original desarrollado por el grupo del Dr. J ohn
Sanford, que permite introducir DNA a cualquier tipo de clula sin daar
demasiado el tejido. La biobalstica ha sido utilizada con xito para producir
plantas transgnicas a partir de una gran variedad de tejidos vegetales
(Sanford, J . 1988).

RESUMEN

Existe una gran diversidad de virus vegetales, 45 familias han sido
reconocidas de las cuales el 85% contiene ARN en su genoma y el 15%
restante contiene DNA. (Argello y col., 1994).
Los geminivirus pertenecen a un grupo de virus de DNA que ocasionan
enfermedades severas particularmente en yuca, maz y otros cereales. En
nuestro pas los geminivirus afectan cultivos de importancia agronmica tales
como frijol (Phaseolus vulgaris L.), tomate (Lycopersicum esculentum M.), chile
(Capsicum annuum L.) y calabaza (Cucrbita pepo) (Torres y col., 1996). Sin
embargo las enfermedades que son ocasionadas por virus han despertado un
mayor inters en las distintas reas de la investigacin debido a que en
trminos prcticos las enfermedades provocadas por virus no son reversibles
(Ascencio y col., 1999).
El nombre de los geminivirus deriva de la morfologa de su partcula,
pues vista al microscopio electrnico se aprecia una partcula asemejando dos
poliedros gemelos o geminados unidos por uno de sus lados. Los geminivirus
se caracterizan por presentar un pequeo genoma de aproximadamente 2.5 a
3.0 kilo bases (kb) (Rivera y col., 1997).
Arabidopsis thaliana es una planta modelo que ha sido muy utilizada
para el estudio de expresin de genes cuando est presente un virus, esta
planta tiene diversas ventajas para usarla en experimentos genticos, pues ya
se tiene su secuencia genmica en bases de datos disponibles al pblico.
En aos recientes una de las tcnicas ms desarrolladas y utilizadas
para identificar genes se basa en la integracin aleatoria de construcciones con
genes reporteros que emplea elementos de insercin llamados enhancer trap y
gene trap (Simn, 1994; Handley-Bowdoin et al., 1999; Lartey y col., 1998).
Con este sistema es posible identificar los genes o factores de la planta
involucrados tanto en el ciclo de replicacin como en la diseminacin de los
geminivirus, siguiendo la expresin de un gen reportero.
Para identificar algunos genes que se expresen cuando la planta es
invadida por virus, es necesario imitar las condiciones naturales para la
infeccin en el laboratorio.

NDICE GENERAL

Contenido Pg

I. INTRODUCCIN 1
II. ANTECEDENTES

II.1 Problemtica e impacto econmico 3
II.2 Generalidades sobre los virus 3
II.3 Importancia 4
II.4 Taxonoma 5
II.5 Geminivirus y Begomovirus 10
II.6 Arabidopsis como modelo de estudio 11
II.7 Transposones 13
II.8 Tail-PCR 14
II.9 Biobalstica

III. JUSTIFICACIN 19
IV. OBJETIVO GENERAL

IV.1 Objetivos particulares 21

V. METODOLOGA, RESULTADOS Y DISCUSIN

V.1 Diseo de la estrategia para la inoculacin de virus con
diferentes presiones, concentraciones y distancias de
bombardeo 22
V.2 Estandarizacin de la tcnica de bombardeo utilizando
plntulas de Arabidopsis thaliana silvestre 24
V.3 Validacin de la tcnica de bombardeo utilizando lneas
transposantes 41
V.4 Identificacin del gen etiquetado por Tail-PCR 45

VI. CONCLUSIONES 54
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 55
VIII. LISTA DE ABREVIATURAS 58
IX. ANEXOS 59

NDICE DE TABLAS

Tabla 1. Clasificacin actual de los miembros de la familia Geminiviridae. 5
Tabla 2. Variables establecidas en el diseo de la estrategia del bombardeo. 24
Tabla 3. Condiciones utilizadas en el diseo de la estrategia del bombardeo
con la pistola de punta. 25
Tabla 4. Resultados obtenidos del conteo de puntos del primer bombardeo a
partir del tercer da post-inoculacin. 27
Tabla 5. Resultados obtenidos del conteo de puntos del primer bombardeo a
partir del quinto da post-inoculacin. 28
Tabla 6. Condiciones utilizadas a partir de la anulacin de la variable de
3 cm. 29
Tabla 7. Resultados obtenidos del conteo de puntos del segundo bombardeo a
partir del tercer da post-inoculacin. 30
Tabla 8. Condiciones utilizadas en el diseo de la estrategia del bombardeo
con la pistola de filtro. 31
Tabla 9. Resultados obtenidos del conteo de puntos del tercer bombardeo a
partir del primer da post-inoculacin. 31
Tabla 10. Resultados obtenidos del conteo de puntos del tercer bombardeo a
partir del segundo da post-inoculacin. 31
Tabla 11. Condiciones utilizadas en la primera cintica con la pistola de
filtro. 32
Tabla 12. Total de plantas infectadas las cuales fueron bombardeadas con el
virus CaLCuV. 33
Tabla 13. ltimas condiciones utilizadas para la estandarizacin final del
mtodo con la pistola de filtro y con partculas de tungsteno. 34
Tabla 14. Resultados obtenidos del conteo de puntos del cuarto bombardeo a
partir del primer da post-inoculacin. 34
Tabla 15. ltimas condiciones utilizadas para la estandarizacin final del
mtodo con la pistola de filtro y con partculas de oro. 35
Virus CaLCuV, obtenidos de la segunda cintica con la pistola de filtro y con
partculas de tungsteno. 35
Virus CaLCuV, obtenidos de la segunda cintica con la pistola de filtro y con
partculas de oro. 36
Tabla 17. Resultados obtenidos de la segunda cintica con la pistola de filtro y
con partculas de oro. 36
Tabla 18. Resultados obtenidos del conteo de puntos del quinto bombardeo a
partir del primer da post-inoculacin y con partculas de tungsteno. 37
Tabla 19. Resultados obtenidos del conteo de puntos del quinto bombardeo a
partir del primer da post-inoculacin y con partculas de oro. 37
Tabla 20. Grafica que muestra los resultados obtenidos del ltimo bombardeo
con la pistola de filtro y las partculas de tungsteno. 38
Tabla 21. Grafica que muestra los resultados obtenidos del ltimo bombardeo
con la pistola de filtro y las partculas de tungsteno. 38
Tabla 22. Fotografa de plantas inoculadas en el ltimo bombardeo con DNA
de control positivo PWRG1515, observadas al estereoscopio. El bombardeo fue
realizado con la pistola de filtro y partculas de tungsteno. 39
Tabla 23. Fotografa de plantas inoculadas en el ltimo bombardeo con DNA
de control positivo PWRG1515, observadas al estereoscopio. El bombardeo fue
realizado con la pistola de filtro y partculas de tungsteno. 39
Virus CaLCuV. 40
Tabla 25. Fotografa de la cintica de una planta bombardeada con partculas
de tungsteno, mostrando los sntomas tpicos del virus (mosaico y arrugamiento
de las hojas).
Tabla 26. Fotografa de la cintica de una planta bombardeada con partculas
de oro, mostrando los sntomas tpicos del virus (mosaico y arrugamiento de las
hojas).
Tabla 27. Resultados obtenidos del conteo de puntos del bombardeo de las
plantas transposantes con DNA de control positivo PWRG1515.
Tabla 28. Fotografa de las plantas transposantes inoculadas con el virus
CaLCuV, observados con el microscopio.

NDICE DE FIGURAS

Figura 1. Fotografa en microscopio electrnico de un geminivirus. 6

Figura 2. Proceso de infeccin de los geminivirus en clulas vegetales. 6

Figura 3. Mapa Genmico de Begomovirus bipartitas. 10

Figura 4. Esquema de la construccin de las lneas transposantes. 13

Figura 5. Esquema que muestra la forma en que son obtenidos los productos
del Tail-PCR. 14

Figura 6. Representacin esquemtica del sistema de bombardeo con
micropartculas o biobalstica. Se muestra el sistema ms moderno en donde el
microproyectil es propulsado por una descarga de helio a alta presin. 16

Figura 7. Tipos de pistola utilizadas y su correspondiente dimetro de
disparo. 17

Figura 8. Instrumentos diseados y utilizados para un mejor manejo de la
Tcnica de bombardeo. 26

Figura 9. Fotografa de un gel de agarosa donde se muestra una reaccin de
Tail-PCR. 47

Figura 10. Fotografa de un gel de agarosa donde se muestra los productos
obtenidos del Tail-PCR clonados en el vector de pGEM. 47

Figura 11. Anlisis surgidos a partir de la base de datos, de la lnea MGT 221
DS3-3 AD2, donde se muestra la comparacin de la secuencia y el sitio de
insercin del transposn. 48





Infeccin geminiviral en plantas de Arabidopsis thaliana,
utilizando biobalstica como mtodo de inoculacin.

I. INTRODUCCIN

Los virus que infectan plantas presentan en su mayora un genoma
compuesto de RNA, sin embargo existen grupos como los geminivirus,
caulimovirus y los nanovirus cuyo genoma esta compuesto por molculas de
DNA.
Los geminivirus son la segunda familia ms grande de virus de plantas, son
capaces de infectar una amplia variedad de plantas de inters agro-econmico
(maz, tabaco, tomate, frjol, yuca, chile, papa, papaya), causando graves
prdidas en cultivos de zonas tropicales y subtropicales del mundo. (Torres y
col, 1996)
Los geminivirus presentan un genoma compuesto de ADN de cadena
sencilla, se caracterizan por presentar una morfologa vista al microscopio
electrnico de dos poliedros regulares idnticos unidos por uno de sus lados.
Para llevar a cabo su replicacin, los geminivirus utilizan la maquinaria
biosinttica de su hospedante, por lo tanto estos patgenos son altamente
dependientes de protenas celulares para poder replicar y expresar sus genes
mediante un mecanismo conocido como crculo rodante (MCR) (Saunders,
1991).
Los geminivirus han resultado ser un modelo de estudio muy interesante, su
anlisis inicial como fitopatgenos permiti entrever el potencial que ahora
representan, tanto para los estudios de interaccin planta-microorganismo, as
como de eventos bsicos de bioqumica de la clula vegetal. Estos virus dirigen
su replicacin en el ncleo de la clula infectada y gracias al estudio de este
proceso, se ha logrado mayor conocimiento respecto a eventos primarios de la
replicacin vegetal y de los procesos involucrados en el ciclo celular y an ms
sobre la apoptosis (Simn 1999). Entre ms se profundice en el estudio de los
geminivirus mas nos acercaremos a elucidar intrincados mecanismos del ciclo
celular vegetal que an no se comprenden en su totalidad.

1

An ms si se llega a entender con profundidad el sistema fitopatolgico
geminiviral, se podrn establecer bases slidas para aplicar esos
conocimientos a la bsqueda de resistencia en las plantas contra estos
devastadores agentes. (Argello y col., 1994).
El virus del enrollamiento de la hoja de la col (CaLCuV) es un virus de DNA
de cadena sencilla del gnero Begomovirus que pertenece a la familia
Geminiviridae. Su hospedero natural son las plantas de col, pero es capaz de
infectar plantas de Tabaco y Arabidopsis, lo que hace a este virus un patgeno
interesante para el estudio de expresin de genes utilizando plantas de
Arabidopdsis como hospedero experimental.
En el Cinvestav unidad Irapuato, se han generado lneas transgnicas de
Arabidopsis thaliana las cuales tienen insertado un transposn, que a su vez
tiene un gen reportero GUS y un gen de resistencia a kanamicina (NPTII).
Estas lneas son utilizadas para identificar genes endgenos que son
expresados o reprimidos cuando la planta es infectada con geminivirus. Los
mtodos ms utilizados para infeccin de plantas son la biobalstica y la
agroinoculacin.
En el laboratorio de Virologa Vegetal se utiliza el mtodo de biobalstica
para llevar a cabo la inoculacin de geminivirus en plantas de chile, tomate,
tabaco y frijol. La planta de Arabidopsis thaliana tiene la ventaja de que su
secuencia genmica es conocida, esto la convierte en una potencial
herramienta que puede ser utilizada en la identificacin de genes que
respondan a la infeccin geminiviral. Las plantas Arabidopsis son muy
pequeas, con hojas ms delgadas y frgiles. Dado dicho fenotipo, no pueden
ser utilizadas las mismas variantes de biobalstica utilizadas para plantas ms
grandes. Es por esto que surge la necesidad de estandarizar el mtodo de
biobalstica para la inoculacin de geminivirus en plantas de Arabidopsis y
encontrar aquellas variantes que sean las ideales para lograr una infeccin
exitosa y as poder aplicar dicho mtodo de inoculacin en las plantas
transposantes de Arabidopsis thaliana para poder identificar genes.

2

II. ANTECEDENTES

II.1 PROBLEMTICA E IMPACTO ECONMICO.
Las plantas en su estado natural se ven influenciadas por factores
abiticos como las sequas, inundaciones y heladas as como factores biticos
tales como plagas y enfermedades provocadas por diversos patgenos
pertenecientes a distintos reinos. Las bacterias, hongos e insectos, han
propiciado prdidas parciales o totales en los cultivos. Sin embargo las
enfermedades que son ocasionadas por virus han despertado un mayor inters
en las distintas reas de la investigacin debido a que en trminos prcticos las
enfermedades provocadas por virus no son reversibles (Ascencio y col., 1999).
Los geminivirus pertenecen a un grupo de virus que ocasionan
enfermedades severas particularmente en yuca, maz y otros cereales. Son
fitopatgenos verstiles que infectan monocotiledneas como el maz hasta
dicotiledneas como el tomate. En nuestro pas los geminivirus afectan cultivos
de importancia tales como frijol (Phaseolus vulgaris L.), tomate (Lycopersicum
esculentum M.), chile (Capsicum annuum L.) y calabaza (Cucrbita pepo)
(Torres y col., 1996).
Los principales factores de propagacin de nuevos geminivirus son las
variantes evolutivas de los virus adems de la aparicin del biotipo B de
mosquita blanca as como el incremento en las poblaciones del vector. La
recombinacin genmica no slo entre variantes del mismo virus sino tambin
entre especies y gneros ha propiciado una rpida diversificacin (Varma,
2003).

II.2 GENERALIDADES SOBRE LOS VIRUS
Los virus considerados como el paquete de una o ms molculas de
RNA (cido ribonucleico) o DNA (cido desoxiribonucleico) de cadena sencilla
o doble que normalmente se encuentra encapsidada por cubiertas de protenas
o lipoprotenas, son endoparsitos intracelulares obligados, pues requieren de
una clula hospedante susceptible para poder llevar a cabo su ciclo de vida
(Vega y Rivera 2001).
3
Existe una gran diversidad de virus vegetales, de los cuales han sido
reconocidas aproximadamente 45 familias entre las cuales el 85% contiene
ARN en su genoma mientras que el 15% restante contiene ADN. (Argello y
col., 1994)
Desde un enfoque econmico el grupo de los geminivirus y los potyvirus
se han convertido en los dos grupos ms importantes debido a las prdidas
ocasionadas en los cultivos. Estos dos grupos presentan una diferente
composicin genmica, mientras que los potyvirus presentan un genoma
constituido por ARN, los geminivirus estn constituidos por una o dos
molculas de DNA de cadena sencilla (Rivera y col., 1997).

II.3 IMPORTANCIA
El anlisis de virus de DNA en animales ha contribuido
significativamente para entender la replicacin de DNA, transcripcin y
regulacin del ciclo celular en mamferos. Los geminivirus por otra parte, han
resultado ser excelentes modelos de estudio para comprender los procesos
celulares en plantas. La importancia del estudio de los geminivirus en el mbito
biolgico radica en que ha permitido profundizar en los estudios de interaccin
planta-patgeno, en eventos bioqumicos de la clula vegetal as como en
procesos involucrados en el ciclo celular e incluso han aportado informacin en
procesos de apoptosis (Hanley-Bowdoin y col., 1999). Reportes recientes
proveen importantes conocimientos acerca de la estructura y funcin del origen
de replicacin de estos virus.
Las pocas protenas necesarias para su replicacin y encapsidacin, su
pequeo tamao y su relativa sencillez en la organizacin de su genoma
convierten a los geminivirus en el marco conceptual para estudios de biologa
molecular de plantas y en excelentes modelos de estudio en procesos
bioqumicos.

4
II.4 TAXONOMA
La clasificacin en un inicio fue de acuerdo a la sintomatologa
desarrollada pero debido a las variantes en la sintomatologa relacionada
con distintos factores resulto ser muy imprecisa y poco confiable razn por
la cual se opt por clasificarlos sobre la base de otras caractersticas; la
familia Geminiviridae est conformada hasta el momento por cuatro gneros
(Tabla 1).

Tabla 1. Clasificacin actual de los miembros de la familia Geminiviridae
GENEROS

Mastrevirus
Curtovirus
Begomovirus

Topocuvirus

ORGANIZACIN
GENMICA

Monopartita
Monopartita
Monopartita o
Bipartita

Monopartita

RANGO DE
HOSPEDANTES

Monocotiledneas
Dicotiledneas
Dicotiledneas

Dicotiledneas

INSECTO
VECTOR

Chicharritas
Chicharritas
Mosca
blanca

Saltamontes

Son de particular inters para los Taxnomos la regin comn, la regin
intergnica, la regin que codifica para las protenas de la cpside y la protena
asociada a la replicacin, (Mattews 1991)

II.5 GEMINIVIRUS Y BEGOMOVIRUS
El nombre deriva de la morfologa de su partcula, pues vista al
microscopio electrnico se aprecia una partcula asemejando dos poliedros
gemelos o geminados unidos por uno de sus lados (Rivera y col., 1997). Los
geminivirus se caracterizan por presentar un pequeo genoma de
aproximadamente 2.5 a 3.0 kilo bases (kb) (Figura 1).

5

Figura 1. Fotografa en microscopio electrnico de las partculas virales de un geminivirus

Para llevar a cabo su replicacin, los geminivirus utilizan la maquinaria
biosinttica de su hospedante, por lo tanto estos patgenos son altamente
dependientes de protenas celulares para poder replicar y expresar sus genes
mediante un mecanismo conocido como crculo rodante (MCR) (Saunders
1991) (Figura 2).

Sntesis de la cadena
complementaria
Replicacin por crculo
rodante
TrAP
CP
Transactivacin
REn
Rep
Autorrepresin
Transcripcin
BR1
Encapsidacin
Movimiento
REPLICACIN POR CRCULO RODANTE

Figura 2. Proceso de infeccin de los geminivirus en clulas vegetales

6
Dentro del gnero Begomovirus se encuentran todos los virus que
presentan un genoma bipartita, es decir su genoma lo integran dos molculas
de DNA que son denominados DNA-A y DNA-B. Es importante sealar que se
requiere de ambos componentes para generar una infeccin sistmica an
cuando ambos componentes son encapsidados por separado (Hamilton y col.,
1983, Rogers y col., 1986).
El gnero Begomovirus es el ms grande de la familia Geminiviridae y
dentro de este gnero se encuentran virus con un genoma bipartita y algunos
con genoma monopartita.
Los virus con genoma bipartita presentan dos componentes que difieren
en su secuencia nucleotdica excepto por una regin comn (RC) de
aproximadamente 200 nucletidos, donde se encuentran secuencias
requeridas para la replicacin de DNA viral. El DNA genmico contiene
secuencias codificantes divergentes separadas por una regin intergnica no
codificante, estos genes se denominan de acuerdo al componente que
pertenecen, al sentido en que se orienta la cadena y a la secuencia con
respecto a la regin intergnica (Lazarowitz, 1992; Fontes y col., 1994; Hanley-
Bowdoin y col., 1999)
Estudios han demostrado que toda la informacin necesaria para la
replicacin se encuentra en el componente A. El componente B no puede
replicarse en ausencia del componente A pero este componente es requerido
para el movimiento sistmico y la produccin de sntomas (Rogers y col., 1986;
Sunter y col., 1987).
Los dos componentes son diferentes en secuencia nucleotdica excepto
por una regin intergnica (RI) en la que se encuentra una secuencia altamente
conservada denominada regin comn (RC) de aproximadamente 180 a 200
bases, pero diferente entre cada gnero de virus. Dentro de esta regin se
encuentra una secuencia de aproximadamente 30 nucletidos rica en G y C en
los extremos y A y T en el centro. Esta secuencia tiene la capacidad de formar
una estructura de tallo y horquilla, que es comn en todos los geminivirus y es
donde se encuentra el origen de la replicacin viral u horquilla de replicacin.

7
El DNA A, contiene de cuatro a cinco marcos de lectura abiertos (MLA)
traslapados (Fig. 3). En sentido complementario se encuentran los siguientes
MLAs:
1. AL1 codifica una protena conocida como Rep que es suficiente e
indispensable para la replicacin del virus. A pesar de no poseer
actividad de polimerasa, se sabe que Rep es una protena multifuncional
que tiene la actividad de topoisomerasa y de corte en sitios especficos,
funciona como ligasa y helicasa, introduce un corte en la cadena positiva
de DNA para el inicio y terminacin del ciclo de replicacin (Saunders y
col., 1991; Fontes y col., 1994). Rep induce en clulas que no estn en
proceso de divisin y activa la expresin del antgeno nuclear de
proliferacin celular (PCNA), una de las protenas encargadas de la
sntesis de DNA de la planta hospedera. Rep presenta una homologa
significativa con protenas involucradas en replicacin tipo crculo
rodante (RCR) (Nagar y col., 1995).
2. AL2 codifica para una protena nuclear llamada TrAP, que transactiva la
expresin de genes tardos, como la protena de la cpside (CP) y una
de las protenas de movimiento (BRI) (Sunter y col., 1990; Sunter y col.,
1997). TrAP presenta las caractersticas generales de una protena
reguladora de la transcripcin. Tiene una estructura modular consistente
de una regin bsica en el amino terminal (involucrada en dominios de
unin a DNA) y una regin acdica en el carboxilo terminal (relacionada
con dominios de activacin). A pesar de estas caractersticas, no se ha
podido demostrar la unin de TrAP a secuencias especficas en el DNA
de doble cadena (DNAcd) (Hartitz y col., 1999).
3. AL3 genera una protena conocida como Ren, que es encontrada
nicamente en virus de los gneros Curtovirus y Begomovirus, aumenta
la eficiencia de la replicacin. Esta protena acta incrementando la
acumulacin de DNA viral por medio de un mecanismo desconocido. Su
ausencia reduce ms de 50 veces la tasa replicativa (Elmer y col., 1988;
Sunter y col., 1990).

8
Se localiza en el ncleo de las clulas infectadas, lo que indica que
puede participar directamente en la replicacin dando estabilidad al DNA de
cadena sencilla (DNAcs) (Nagar y col., 1995), en la interconversin de
DNAcs a DNAcd o controlando algn paso en el ensamblaje de la partcula
viral (Lazarowitz 1992; Hanley-Bowdoin y col., 1999).
4. En algunos casos puede estar presente el marco de lectura AC4, del
cual se desconoce su funcin.
En sentido positivo, se encuentra nicamente el gen ARI, que codifica
para la protena de la cpside (CP), la cual es la ms abundante de las
protenas virales durante la infeccin y protege al virin durante su paso
por el vector. En los mosquitos que son transmitidos por mosquita
blanca, la CP se encuentra muy conservada y se ha podido establecer
que esta directamente involucrada en la especificidad del vector
(Webster y Granoff, 1988).
En los geminivirus bipartitas la protena de la cpside no es esencial
para la replicacin del DNA, el movimiento sistmico o el desarrollo de
sntomas (Brough y col., 1988). Entendiendo por infeccin sistmica aquella en
la que el virus es capaz de moverse dentro y a travs del sistema vascular de
su hospedante (Pascal 1993 citado por Noueiry y col., 1994).
Mientras que en los monopartitas la protena de la cpside es requerida
tanto para el movimiento como para el desarrollo de sntomas, pero no para la
replicacin (Lazarowitz y col., 1989).
En el DNA B se encuentran codificadas las protenas necesarias para el
movimiento y para el desarrollo de sntomas. En sentido complementario se
encuentra BLI que genera la protena necesaria para el movimiento clula-
clula. Esta protena se ha localizado entre la pared celular y la membrana
plasmtica, tiene dominios de unin a DNA similares a los encontrados en
chaperonas y tiene la capacidad de alterar el lmite de exclusin de los
plasmodesmos (Pascal y col., 1993; (Nagar y col., 1995). Von Arnim y col.,
1993).

9
En sentido positivo se encuentra BR1 que codifica una protena que
permite el transporte del genoma viral, desde el ncleo al citoplasma y
viceversa (Nouery y col., 1994). Esta protena presenta seales de localizacin
nuclear en su extremo amino terminal y en el carboxilo terminal tiene un
dominio de interaccin con la protena BL1 (Sanderfoot y Lazarowitz, 1996).
BR1 tiene la capacidad de unirse al DNA de cadena sencilla y moverlo a travs
de la envoltura nuclear (Pascal y col., 1994) (Figura 3).

Figura 3. Mapa Genmico de Begomovirus bipartitas

II.6 Arabidopsis thaliana COMO MODELO DE ESTUDIO
El sistema de Arabidopsis como planta modelo inici en 1943 cuando
Friedrich Laibach realiz los primeros estudios sistemticos con Arabidopsis y
present las ventajas de usarla en experimentos genticos; despus de haber
establecido el 1907 el nmero de cromosomas haploides de esta planta. Junto
con algunos colaboradores recaud diferentes ecotipos y junto con Reinholz
hicieron el primer experimento de mutagnesis (Covarruvias y col., 2001;
Meyerowitz 1987; Bowman 1994).
Algunas ventajas que presenta A. thaliana son: tamao pequeo, ciclo
de vida corto (4-6 semanas de semilla a semilla), capacidad de producir gran
cantidad de semilla, permite analizar un gran nmero de individuos en un
espacio pequeo, se autopolinizan pero adems permiten la polinizacin
cruzada, son fciles de mutagenizar y poseen un genoma de aproximadamente
120 millones de bases.
RC
Rep
A
REn
RC
B
BL1 BR1
CP
TrAp
10
Arabidopsis se ha caracterizado genticamente, se han podido inducir
un gran nmero de mutaciones interesantes que se han analizado y mapeado,
por lo que se ha podido establecer que esta planta no difiere de otras como
tomate y maz que tambin son simples pero que poseen mucho ms DNA
repetido (Dennis y Surridge 2000, Kerth y col., 1994, Bowman 1994).
Las poblaciones silvestres (ecotipos) de Arabidopsis se han colectado
principalmente de Europa y el Oeste de Asia, as como de Japn, Norte de
frica y Norte Amrica (Robbelen 1965; Kranz and Kirchheim, 1987 citados por
Bowman, 1994). La mayora de los ecotipos utilizados en laboratorio provienen
de una sola semilla para mantener el material gentico original homogneo.
Algunas como Lansberg erecta no son en realidad de tipo silvestre, si no que
se seleccionaron a travs de mutaciones que resultaron en un desarrollo
adecuado para trabajar con ellas en condiciones de invernadero y laboratorio.
Se han utilizado ampliamente debido a su fenotipo pleiotrpico (roseta
compacta, pecolos cortos y reducida elongacin de entrenudos) (Bowman,
1994; Alonso-Blanco y Koornneef, 2000), crecen bien en suelo, en agar o
medio lquido. Por ejemplo bajo condiciones adecuadas de luz, a 25C, con
buena nutricin los ecotipos Columbia y Lansberg tienen un ciclo de vida de 6
semanas (Langriedge 1957; Rdei y col., 1971, citados por Meyerowitz 1987).

II.7 TRANSPOSONES
A pesar de los estudios realizados con protenas virales como la CP o
las protenas de movimiento para entender parte de las interacciones virus-
planta, se sabe poco de los factores requeridos para estos procesos y el
mecanismo por el cual los geminivirus y virus en general, se establecen en la
planta. En aos recientes, una forma de identificar genes involucrados en
defensa e interaccin con diferentes patgenos, es utilizando trampas gnicas,
las cuales se basan en la integracin aleatoria de construcciones y seguimiento
de genes reporteros. (Simn 1994; Handley-Bowdoin y col, 1999; Lartey y col.,
1998).

11
Los transposones (unidad gentica mvil), fueron identificados
originalmente en maz por Brbara McClintock en 1950, ella les dio el trmino
de elementos controladores ya que son capaces de influenciar la expresin
de un locus cuando se integran dentro o cerca de ste. Los transposones se
han encontrado en eucariotes y procariotes, algunos de estos similares o
distintos a los elementos del maz (Sundaresan y col., 1995; The Arabidopsis
Genome Initiative, 2000; Ramachandran y Sundaresan 2001).
En otros casos existen transposones que solo se activan como
respuesta a algn tipo de estrs. Estas tecnologas de mutagnesis, emplean
elementos de insercin llamados enhancer trap y gene trap (Sundaresan y col.,
1995)
Los transposones se definen como elementos de DNA que tienen la
capacidad de moverse a nuevos sitios dentro del genoma y causar la
interrupcin de genes dependiendo del sitio donde se inserte (Springer,2000).
Los elementos enhacer trap (ET) tienen un gen reportero fusionado a un
promotor mnimo derivado del promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor
(CaMV 35S ) cuya expresin no es detectable. Cuando el elemento se inserta
en la proximidad de un gen, el resultado es la expresin del gen reportero bajo
el control de los potenciadores vecinos (Sundaresan y col., 1995) (Figura 4).
Mientras que los elementos gene trap (GT) el gen reportero no tiene
promotor, por ello la transcripcin del gen reportero depende del promotor del
gen cromosomal. En este tipo de elementos, el marco de lectura del gen
reportero, tendr que estar en sentido con respecto al marco de lectura del gen
donde se ha insertado (Sundaresan y col., 1995) (Figura 4).
En el Cinvestav Irapuato en el laboratorio de Desarrollo Reproductivo y
Apomixis, cuenta con una coleccin de lneas de Arabidopsis thaliana
etiquetada con trampas gnicas (Gene trap y Enhancer trap), estas se estn
utilizando por el laboratorio de Virologa Vegetal, para la bsqueda de genes
involucrados en el desarrollo del ciclo viral de algunos geminivirus.

12
TRAMPA GNICA (Gene trap)

Figura 4. Esquema de la construccin de las lneas transposantes.

II.8 TAIL-PCR
Tail-PCR (Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction) por
sus siglas en ingles, fue desarrollado en 1995 y es una poderosa herramienta
utilizada para amplificar secuencias adyacentes a secuencias conocidas
(Ochman y col., 1993).
Para llevar a cabo la tcnica de PCR, es necesario el uso de oligos
especficos que identificaran la secuencia conocida y oligos degenerados que
se unirn a diferentes secuencias del genoma. Ambos tipos de oligos, fueron
diseados para ser alineados a diferentes temperaturas, ya que en los ciclos
utilizados hay varias combinaciones de temperaturas altas y bajas (Liu y col.,
1995).
Se amplifica un producto especfico, encontrado por el oligo especfico y
un oliogo degenerado del otro lado. La especificidad ms lejana, es obtenida
por rondas subsecuentes de Tail-PCR, usando inserciones anidadas de oligos
especficos (Singer y col., 2003) (Figura 5).

I I A A G GU US S K Ka an n
Sitios aceptores de
splicing
DETECTOR DE POTENCIADORES (Enhancer trap)
T TA AT TA A G GU US S K Ka an n
Repetidos invertidos para la
movilizacin
del transposn
13
OLIGOS
DEGENERADOS
OLIGOS ESPECFICOS
PARA EL TRANSPOSON
OLIGOS
DEGENERADOS
5 3
GENOMA GENOMA
Liu y col, 1995
1
2
3
1
2
3
1 2 3 MPM 1 2 3 MPM

Figura 5. Esquema que muestra la forma en que son obtenidos los productos del Tail-PCR.

II.9 BIOBALSTICA

La biobalstica o bombardeo con micropartculas es un proceso muy
original desarrollado por el grupo del Dr. John Sanford, que permite introducir
DNA a cualquier tipo de clula. En este procedimiento el DNA es introducido a
las clulas por medio de microproyectiles, que son partculas esfricas (de 0.4
a 2.0 micrmetros de dimetro), constituidas de materiales densos e inertes
como tungsteno u oro, a las que se adhiere el ADN que se desea transferir a
las plantas, estas partculas microscpicas son aceleradas a velocidades
supersnicas, que atraviesan la pared y la membrana celular sin causar, por lo
general, efectos letales (Sanford 1998).
En los primeros experimentos se usaron partculas de tungsteno
aceleradas con un dispositivo de explosin de plvora. La pistola de genes,
desarrollada inicialmente en la Universidad de Cornell (Nueva York), opera de
forma similar a una pistola. Un cartucho vaco de calibre 22 dispara al interior
de las clulas una salva de microproyectiles metlicos revestidos de DNA.
14
Otras pistolas o caones utilizan descargas elctricas o gas a alta
presin para propulsar los proyectiles revestidos de DNA.
Para acelerar los microproyectiles y que adquieran un momentum
(masa x velocidad) suficiente para penetrar a las clulas blanco, se utilizan
macroproyectiles que son impulsados a grandes velocidades (los
microproyectiles son colocados sobre su superficie), por un choque de gas, que
puede derivarse de una explosin qumica, la explosin elctrica de una gota
de agua, o una descarga de un gas inerte. Las clulas o tejidos que constituyen
el blanco de los proyectiles se disponen de tal forma que presentan la mxima
superficie para el bombardeo, en un rea de cerca de 5 cm de dimetro.
(Sanford 1988) (Figura 6).
El mtodo de bombardeo de micro-partculas podra considerarse lo ms
cercano a un mecanismo "universal" de transferencia de genes, ya que por su
naturaleza totalmente fsica, es independiente del tipo de clula blanco y ha
sido utilizado no slo para introducir DNA exgeno a clulas vegetales, sino a
clulas de una gran variedad de organismos tales como bacterias, algas,
hongos, clulas animales, y an animales y plantas intactas. Adicionalmente, el
proceso de biobalstica parece ser al presente el nico medio de transformar de
modo reproducible organelos celulares, como: mitocondrias y cloroplastos
(Sanford 1988).
La biobalstica ha sido utilizada con xito para producir plantas
transgnicas a partir de una gran variedad de tejidos vegetales, entre los que
se incluyen hojas, meristemos, embriones en desarrollo, embriones maduros,
callos embriognicos, suspensiones celulares, etc. Los principales logros en la
obtencin de plantas transgnicas por medio de este mtodo, incluyen
especies de gran inters econmico como son la soja, el maz, el arroz, el
sorgo, la papaya, la caa de azcar, el trigo y el esprrago. Tambin se ha
utilizado para transformar microorganismos como levaduras, el moho
Aspergillus y el alga Chlamydomonas (Sanford 1988).
Esta metodologa de transformacin tiene ciertas limitaciones. Algunos
tejidos oponen una resistencia natural a la penetracin de las partculas, dada
por cutculas endurecidas, paredes celulares lignificadas o superficies vellosas.

15
Sin embargo, los principales limitantes del mtodo continan siendo la
baja relacin entre el total de clulas sometidas al bombardeo y el nmero de
clulas que logran incorporar de manera permanente la informacin gentica
transferida, como as tambin la alta frecuencia de mltiple insercin de copias
del transgn o re-arreglos del mismo, dentro del genoma vegetal.
A pesar de estas desventajas, la versatilidad de la aceleracin de
partculas para introducir transgenes ha superado muchas de las barreras
asociadas a otros mtodos de transformacin.

Figura 6. Representacin esquemtica del sistema de bombardeo con micropartculas o
biobalstica. Se muestra el sistema ms moderno, en donde el microproyectil es propulsado por
una descarga de helio a alta presin.

En el laboratorio de Virologa Vegetal del Centro de Investigacin y de
Estudios Avanzados Unidad Irapuato, se disearon dos aceleradores de
partculas para bombardeo de tipo manual, basadas en el modelo Sanford
Dupont modelo (PDS-1000) (Garzn y col, 1993) (Figura 7). Las cuales utilizan
gas helio comprimido. Estos aparatos presentan modificaciones comparadas
con la de alta presin. Una de ellas es la pistola de punta, la cual utiliza una
punta de polipropileno para micropipeta, esta se utiliza generalmente para
inocular geminivirus en plantas grandes como chile, jitomate y frjol, con este
tipo de pistola se puede bombardear un tejido especfico (hoja, pice),
alcanzando un dimetro de disparo de 1.5 cm (Fig. 7).
16
La segunda pistola utiliza un filtro, la cual es utilizada especialmente
para plantas ms pequeas como lo es Arabidopsis, esta pistola permite una
amplia dispersin del DNA viral, en un dimetro de disparo de 2.2 cm (Fig. 7).
Generalmente se bombardean con dos tipos de partculas que son
tungsteno y oro. Se sabe que el oro penetra los tejidos de la planta de una
forma ms profunda, ya que este penetra las capas ms internas de la hoja
produciendo una infeccin sistmica a lo largo de toda la planta, en un tiempo
relativamente corto (a partir del 6 dpi), utilizando una presin muy baja (50psi)
(Jos Luis Cabrera, comunicacin personal). Mientras que con el tungsteno la
infeccin sistmica se logra en un periodo de tiempo ms largo (a partir del 15
dpi) utilizando una presin ms alta (120 psi).
Estos tipos de pistola de baja presin presentan grandes ventajas en
comparacin con la pistola de alta presin y esto es debido al ligero peso que
tienen, por no estar fijas pueden fcilmente ser transportadas a cualquier lugar
y disminuyen la presin de gas helio utilizado.

Pistola de punta Dimetro del disparo

17

Pistola de filtro Dimetro del disparo

Figura 7. Tipos de pistola utilizadas y su correspondiente dimetro de disparo

18
III. JUSTIFICACIN
El genoma de los geminivirus consiste de DNA de cadena sencilla, circular y
se replican por medio de un mecanismo de crculo rodante en el ncleo de
clulas vegetales infectadas (Saunders 1991). No codifica para una polimerasa,
por lo cual dependen en su totalidad de los factores proporcionados por la
clula hospedera, a fin de replicarse correctamente.
Las plantas pueden defenderse contra la infeccin si poseen genes de
resistencia especficos para virus invasores, o activando mecanismos de
resistencia general como la resistencia sistmica adquirida (Baker y col., 1997).
Estas respuestas de resistencia son acompaadas por cambios dramticos en
la expresin de genes del hospedero (Cooper 2001).
Hasta este momento se tiene un nmero limitado de genes del hospedero
que son expresados cuando hay una infeccin geminiviral. Por lo que un amplio
entendimiento de los cambios en la expresin de genes asociados con las
infecciones virales, revelarn importantes detalles de cmo las plantas
responden a las infecciones virales.
Los anlisis genticos clsicos para la identificacin de genes, se basan en
la alteracin de la funcin de un gen, para luego observar algn fenotipo
reconocible. Estos anlisis continan siendo tiles, sin embargo se han
desarrollado nuevas alternativas para la identificacin de genes que no
muestran un fenotipo obvio. Una de estas alternativas es la identificacin de
genes observando su patrn de expresin (Springer 2000).
Uno de los propsitos del laboratorio de Virologa Vegetal es la
identificacin de los genes de la planta que estn directa o indirectamente
relacionados en algn paso del ciclo infectivo de los geminivirus y que le
permitan al virus por lo tanto establecer una infeccin exitosa.
Para lograr que este fin se realice exitosamente se necesita de la aplicacin
de un buen mtodo de infeccin del virus con su hospedante, la biobalstica
presenta las caractersticas necesarias para lograr nuestro propsito, es decir
que mediante el bombardeo logremos establecer una correcta interaccin del
virus con la planta y para eso se necesita saber a detalle la concentracin de
DNA viral que se necesita introducir, a que presin y a que distancia requiere
ser liberando y cuales partculas resultarn ms efectivas, teniendo que probar
diferentes condiciones y establecer la mejor.
19
Una vez encontradas las condiciones adecuadas, se proceder a la
validacin del mtodo, para entonces hacer la bsqueda de genes que sean
activados por la presencia geminiviral utilizando las lneas transposantes antes
mencionadas.

20

IV OBJETIVO GENERAL

Estandarizar la Tcnica para la inoculacin de geminivirus por medio de
Biobalstica y obtencin de sntomas en plantas de Arabidopsis thaliana.

IV.1 OBJETIVOS PARTICULARES

1. Diseo de la estrategia para la inoculacin de virus con diferentes
presiones, concentraciones de DNA y distancias de bombardeo.
2. Estandarizacin de la Tcnica de Bombardeo utilizando plntulas de
Arabidopsis thaliana silvestre.
3. Validacin de la tcnica de Bombardeo utilizando Lneas
Transposantes.
4. Identificacin del gen etiquetado en las lneas transposantes utilizando
la tcnica de Tail-PCR.

21
V. METODOLOGA, RESULTADOS Y DISCUSIN

V.1 DISEO DE LA ESTRATEGIA PARA LA INOCULACIN DE VIRUS CON
DIFERENTES PRESIONES, CONCENTRACIONES DE DNA Y DISTANCIAS
DE BOMBARDEO.

En el Laboratorio de Virologa Vegetal, se utiliza el mtodo de
biobalstica para llevar a cabo la identificacin de genes que respondan a la
infeccin geminiviral, utilizando como modelos de estudio plantas de chile y
Arabidopsis.
La tcnica de biobalstica por si sola presenta una gran cantidad de
variantes que pueden influir en lograr o no una buena infeccin, observada
mediante la aparicin de sntomas propios del virus utilizado.
Tomando en cuenta dichos factores, nos dimos a la tarea de investigar
la forma en que eran llevados a cabo bombardeos anteriores en plantas, esto
con la finalidad de observar las variantes utilizadas y los resultados obtenidos.
Para plantas de chile y tabaco la presin de bombardeo fue de 120 psi, a
una concentracin de 2.5 g/l de DNA viral, con el uso de la pistola de punta
y con partculas de tungsteno, observando una sintomatologa a los 7 das
despus de la inoculacin (dpi). Sabiendo que este es el periodo de tiempo en
que las plantas muestran una sintomatologa propia del virus de forma natural.
Partiendo de este dato, se llevo a cabo la seleccin de lneas
transposantes que solo dieran respuesta a la infeccin con el Virus del
Enrollamiento de la hoja de la col (CaLCuV).
Las lneas transposantes de Arabidopsis thaliana fueron proporcionadas
por el Laboratorio de Apomixis del Dr. Jean Philipe Vielle Calzada del
CINVESTAV, Irapuato.
Las semillas previamente desinfectadas (Ver anexo, protocolo 1) se
germinaron in Vitro, en un medio de cultivo nutritivo de Murashige y Skoog
(MS) con 50mg/ml de kanamicina. Las cajas petri fueron colocadas a 4 C para
romper la dormancia de la semilla, despus se pasaron a una cmara de
crecimiento con un fotoperodo de 8 hrs. luz y 16 hrs. oscuridad y a una
temperatura de 24C.
22
Las plntulas de Arabidopsis fueron transferidas a una mezcla especial
de sustrato (3:1:1 mezcla sunshine (no 3), zololite vermiculita, agrolita hortiperl)
y tapadas con una charola transparente para aclimatarlas al mismo fotoperiodo
y temperatura mencionado. Cuando las plntulas presentaban de 6 a 8 hojas
verdaderas se procedi al bombardeo. Para el bombardeo fue necesario hacer
una preparacin de las partculas de tungsteno (Ver anexo, protocolo 2 y 3).
Una vez preparadas las partculas las plantas fueron bombardeadas con
el virus CaLCuV y como controles negativos se utiliz el DNA de un vector
pBluescript, partculas sin DNA y plantas sin bombardear.
Despus de haber realizado el bombardeo las plantas fueron incubadas
nuevamente en la cmara de crecimiento y se tomaron muestras a 1,3,5,7 das
despus de la inoculacin. Las muestras fueron tratadas mediante anlisis
beta-glucoronidasa, (ver anexo, protocolo 4) para ver expresin del reportero
GUS.
Despus de llevar a cabo el bombardeo en plantas transposantes de
Arabidopsis, los resultados fueron desconcertantes, pues ninguna de las
plantas tuvo los sntomas caractersticos de una infeccin geminiviral. Esto
indicaba que la tcnica utilizada para inocular plantas como tabaco o tomate,
no serva para plantas ms pequeas como Arabidopsis. Esto de alguna
manera se esperaba pues el fenotipo de Arabidopsis es muy diferente al de
tabaco, pues es mucho ms pequea con hojas muy delgadas y frgiles.
Posiblemente lo que estaba sucediendo era que las partculas atravesaban las
hojas de Arabidopsis y por eso no se obtena los sntomas de una infeccin
viral.
A partir de los resultados obtenidos de esta pequea prueba con lneas
transgnicas, diseamos la estrategia de bombardeo, para llevar a cabo la
estandarizacin del mtodo, es decir que a partir de las condiciones de
bombardeo utilizadas, se hizo una amplitud de las variantes, por ejemplo, a
partir del dato de la presin que era de 120 psi, se tomo un valor arriba que fue
de 140 psi y un valor por debajo que fue de 100 psi, en cuanto a la
concentracin de DNA viral se parti de lo mismo, se tomo un valor arriba de
2.5 g/l, o sea 5 g/l y 1.25 g/l y por ltimo la distancia que hay entre la
punta de la pistola y el pice u hoja a bombardear, estas fueron a 1 cm, 2 cm y
3 cm (Tabla 2).
23

Tabla 2. Variables establecidas en el diseo de la estrategia del bombardeo

Distancia
(cm)
Presin (lb) Concentracin g/l
1 100 1.25
2 120 2.5
3 140 5.0

V.2 ESTANDARIZACIN DE LA TCNICA DE BOMBARDEO UTILIZANDO
PLNTULAS DE Arabidopsis thaliana SILVESTRE

Se comenz con un primer bombardeo de plantas de Arabidopsis
thaliana silvestre, ecotipo Lansberg erecta, estas fueron germinadas y crecidas
in Vitro y en placas de petri con medio nutritivo MS.
Las condiciones utilizadas fueron las siguientes:
Se utiliz la pistola de punta, con partculas de tungsteno, preparadas
exactamente igual que en el primer bombardeo, se utiliz un DNA como
control positivo (PWRG1515) que permiti comprobar que el DNA fue
introducido a las clulas eficazmente, porque este vector cuenta con un
promotor constitutivo 35S que se expresa nicamente en plantas, en forma de
puntos azules en interaccin con los ensayos histoqumicos de GUS y como
control negativo se dejaron plantas sin bombardear.
El bombardeo se hizo por duplicado y fue dirigido a hojas. Las
combinaciones con las condiciones establecidas, se muestran en la siguiente
tabla.

24
Tabla 3. Condiciones utilizadas en el diseo de la estrategia del bombardeo con la pistola de
punta

concentracin (g/l) presin (psi) distancia (cm)
1.25 100 1
1.25 100 2
1.25 100 3
1.25 120 1
1.25 120 2
1.25 120 3
1.25 140 1
1.25 140 2
1.25 140 3
2.5 100 1
2.5 100 2
2.5 100 3
2.5 120 1
2.5 120 2
2.5 120 3
2.5 140 1
2.5 140 2
2.5 140 3
5.0 100 1
5.0 100 2
5.0 100 3
5.0 120 1
5.0 120 2
5.0 120 3
5.0 140 1
5.0 140 2
5.0 140 3

25
Para minimizar errores de bombardeo y llevarlo a cabo de la forma ms
precisa se disearon dos instrumentos artesanales. Una pala que nos permiti
mantener inmvil a las plntulas y evitar el dao de las mismas al momento del
disparo y una regla de fierro que nos permiti dirigir con ms precisin y a la
misma distancia los disparos (Figura 8).
Esperbamos mediante la observacin de las plantas bombardeadas
con DNA control positivo una cantidad suficiente de puntos azules, como
resultado de la expresin del mensajero GUS, al menos con una de todas las
condiciones utilizadas porque esto nos indicara con cual condicin el DNA
lleg eficazmente a las clulas logrando la infeccin.

regla pala

Figura 8. Instrumentos diseados y utilizados para un mejor manejo de la tcnica de
bombardeo

Una vez realizado le bombardeo, las plantas fueron incubadas
nuevamente en la cmara de crecimiento y las muestras fueron tomadas 3 y 5
das despus de la inoculacin. Las muestras fueron tratadas mediante
anlisis beta-glucoronidasa. El conteo de puntos en las muestras que fueron
bombardeadas con el DNA control positivo, se hizo mediante observaciones
con ayuda de un estereoscopio, los resultados obtenidos de estas
observaciones en los 2 periodos de tiempo despus de la inoculacin se
aprecian en la tabla 4 y 5.

26

Tabla 4. Resultados obtenidos del conteo de puntos del primer bombardeo a partir del tercer
da post-inoculacin
distancia
(cm)
presin (lb) concentracin (g) no. puntos
1 100 1.25 2
1 100 2.5 0
1 100 5.0 1
1 120 1.25 0
1 120 2.5 1
1 120 5.0 0
1 140 1.25 1
1 140 2.5 0
1 140 5.0 1
2 100 1.25 0
2 100 2.5 0
2 100 5.0 1
2 120 1.25 0
2 120 2.5 0
2 120 5.0 0
2 140 1.25 1
2 140 2.5 2
2 140 5.0 3
3 100 1.25 0
3 100 2.5 0
3 100 5.0 1
3 120 1.25 0
3 120 2.5 0
3 120 5.0 0
3 140 1.25 0
3 140 2.5 0
3 140 5.0 0

27
Tabla 5. Resultados obtenidos del conteo de puntos del primer bombardeo a partir del quinto
da post-inoculacin
distancia (cm) presin (lb) concentracin (g) no. puntos
1 100 1.25 0
1 100 2.5 0
1 100 5.0 0
1 120 1.25 0
1 120 2.5 0
1 120 5.0 0
1 140 1.25 1
1 140 2.5 1
1 140 5.0 3
2 100 1.25 0
2 100 2.5 1
2 100 5.0 2
2 120 1.25 2
2 120 2.5 0
2 120 5.0 1
2 140 1.25 0
2 140 2.5 1
2 140 5.0 0
3 100 1.25 0
3 100 2.5 0
3 100 5.0 0
3 120 1.25 0
3 120 2.5 0
3 120 5.0 0
3 140 1.25 0
3 140 2.5 0
3 140 5.0 0

.

28
Con base en los resultados obtenidos se realiz otro bombardeo
exactamente de la misma manera que el primero, a excepcin de que se anul
la variable de 3 cm puesto que fue en la que se obtuvieron menos puntos con
el DNA control positivo, las combinaciones posibles ahora quedaron de la
forma siguiente (ver tabla 6).

Tabla 6. Condiciones utilizadas a partir de la anulacin de la variable de 3 cm
concentracin (g/l) presin (psi) distancia (cm)
1.25 100 1
1.25 100 2
1.25 120 1
1.25 120 2
1.25 140 1
1.25 140 2
2.5 100 1
2.5 100 2
2.5 120 1
2.5 120 2
2.5 140 1
2.5 140 2
5.0 100 1
5.0 100 2
5.0 120 1
5.0 120 2
5.0 140 1
5.0 140 2

Se procedi al bombardeo por triplicado y una vez realizado las plantas
fueron incubadas nuevamente en la cmara de crecimiento y se tomaron
muestras al 3 da despus de la inoculacin. Las muestras fueron tratadas
mediante anlisis beta-glucoronidasa, como en el anterior. El conteo de puntos
se hizo mediante observaciones con ayuda de un estereoscopio. De donde se
obtuvieron los siguientes resultados (Tabla 7).

29
Tabla 7. Resultados obtenidos del conteo de puntos del segundo bombardeo a partir del tercer
da post-inoculacin

distancia (cm) presin (psi) concentracin (g) no. pun tos
1 100 1.25 0 0 0
1 100 2.5 1 4 1
1 100 5.0 2 0 0
1 120 1.25 0 5 5
1 120 2.5 0 1 4
1 120 5.0 0 1 1
1 140 1.25 0 0 0
1 140 2.5 0 3 0
1 140 5.0 0 3 0
2 100 1.25 0 0 0
2 100 2.5 0 0 1
2 100 5.0 1 0 3
2 120 1.25 0 0 0
2 120 2.5 0 0 0
2 120 5.0 0 4 0
2 140 1.25 0 0 0
2 140 2.5 0 0 0
2 140 5.0 1 0 0

De las plantas bombardeadas, 21 de ellas no presentan ningn punto
azul la mayora correspondientes a aquellas que fueron bombardeadas con la
concentracin ms baja utilizada que fue la de 1.25 g/l, mientras que en las
restantes por lo menos en una de las tres repeticiones hay presencia de puntos
azules.
Tambin pudimos observar que a un centmetro de distancia entre la
punta y la hoja a inocular, las plantas moran por el excesivo dao causado por
el bombardeo.
El siguiente bombardeo se realiz con ayuda de otro tipo de pistola con
la que cuenta el laboratorio, que es la pistola de filtro, el cual es de la marca
Millipore Swinnex, este tiene una apertura mayor lo que nos da un dimetro
de disparo de partculas mucho ms ancho que la pistola de punta.
Por lo cual se decidi probar una nueva estrategia modificando un poco
las condiciones de las variables (Tabla 8). Adems de la observacin de que
las plantas bombardeadas a 1 cm se daaban al momento del disparo.

30
Tabla 8. Condiciones utilizadas en el diseo de la estrategia del bombardeo con la pistola de
filtro

distancia(cm) presin (psi) concentracin (g)
2 80 1.25
2 80 2.5
2 80 5.0
2 100 1.25
2 100 2.5
2 100 5.0

Se hicieron 5 repeticiones de cada combinacin con el control positivo
PWRG1515, una vez realizado el bombardeo se tomaron muestras del 1 y 2
dpi y se procedi a los ensayos beta-glucoronidasa y a su observacin al
estereoscopio, de donde surgieron los siguientes resultados (Tabla 9 y 10).

Tabla 9. Resultados obtenidos del conteo de puntos del tercer bombardeo a partir del primer
da post-inoculacin

distancia (cm) presin (psi) concentracin (g) 1 2 3 4 5
2 80 1.25 0 3 4 4 3
2 80 2.5 6 6 6 3 0
2 80 5.0 0 0 1 0 0
2 100 1.25 2 2 2 1 0
2 100 2.5 5 5 4 3 1
2 100 5.0 2 0 0 1 0

Tabla 10. Resultados obtenidos del conteo de puntos del tercer bombardeo a partir del
segundo da post-inoculacin

distancia (cm) presin (psi) concentracin (g) 1 2 3 4 5
2 80 1.25 0 3 3 4 3
2 80 2.5 7 5 5 3 2
2 80 5.0 2 2 1 0 1
2 100 1.25 2 3 2 0 2
2 100 2.5 3 3 2 3 1
2 100 5.0 1 0 0 1 0

31
Con estos resultados podemos comprobar que la pistola de filtro
necesit de menor presin para introducir DNA a las clulas, pues se observa
que la mayor cantidad de puntos coincide con la presin mas baja (80 psi), y de
las concentraciones utilizadas (1.25 o 2.5 g), la ms favorecida fue la de 2.5
g, mientras que a mayor concentracin de DNA (5g), menor nmero de
puntos. Por lo que en el siguiente experimento, esta ltima concentracin fue
anulada.
Lo que podemos concluir hasta este momento a partir de los tres
bombardeos realizados con los diferentes tipos de pistolas es que la de punta
funciona mejor a 2 cm. de distancia, entre 100 y 120 psi y entre 2.5 y 5.0 g de
DNA. Como vemos las condiciones no son muy claras an, por el contrario con
la pistola de filtro se aprecia claramente que funciona tambin a 2 cm. de
distancia, a 80 psi y a 2.5 g. Es decir que con esta pistola de filtro los
resultados son ms claros que con la pistola de punta.
Por otro lado tambin se sigui la cintica de sintomatologa de las
plantas infectadas, para encontrar si exista algn tipo de correlacin en cuanto
a las mejores condiciones que se iban encontrando, tanto para la expresin del
mensajero GUS (puntos azules) y a la expresin de sntomas virales (tabla
11).
Para hacer la cintica se hizo el bombardeo con DNA del virus CaLCuV,
se bombardearon 10 plantas de cada posible combinacin. Despus de
inocular las plantas, estas fueron observadas a diario para contabilizar el da
post-inoculacin en que presentaban la sintomatologa propia del virus y el
nmero correspondiente de plantas enfermas (ver tabla 12).

Tabla 11. Condiciones utilizadas en la cintica con la pistola de filtro

distancia (cm) presin (psi) concentracin (g)
2 100 1.25
2 100 2.5

32

Tabla 12. Total de plantas infectadas las cuales fueron bombardeadas con el virus CaLCuV

dpi no. plantas infectadas
2cm.100.psi.1.25g
no. plantas infectadas
2cm.100psi.2.5g
6 4 7
8 5 7
11 5 7
13 5 8
18 5 8
20 5 8
25 5 8
total 5 8

Con estos resultamos concluimos que efectivamente existi una relacin
en cuanto a la concentracin de DNA viral y la concentracin del DNA control
positivo, ya que como habamos visto en los resultados anteriores con una
concentracin de 2.5 fue donde se encontr mayor nmero de puntos. Y fue lo
mismo que paso con la cintica de sintomatologa, hubo ms plantas con
sntomas en la concentracin mayor de DNA viral (2.5 g).
En resumen; vimos que los ltimos bombardeos con la pistola de filtro
resultaron ser mejores en cuando a cantidad de puntos observados en
comparacin con la pistola de punta, favoreci bajar la presin y la
concentracin de DNA viral, por lo consiguiente se volvi a bombardear con el
control positivo PWRG1515, modificando un poco las presiones. Las
condiciones utilizadas se muestran en la tabla 13.

33
Tabla 13. Condiciones utilizadas para la estandarizacin final del mtodo con la pistola de filtro
y con partculas de tungsteno

no. combinacin distancia(cm) presin (psi) concentracin (g)
1 2 50 1.25
2 2 70 1.25
3 2 90 1.25
4 2 50 2.5
5 2 70 2.5
6 2 90 2.5
7 3 50 1.25
8 3 70 1.25
9 3 90 1.25
10 3 50 2.5
11 3 70 2.5
12 3 90 2.5

Se hicieron 6 repeticiones de cada combinacin para posteriormente
tomar muestra del primer da y se procedi a los ensayos beta-glucoronidasa y
a la observacin de puntos en el estereoscopio. Los resultados obtenidos
fueron los siguientes (Tabla 14).

Tabla 14. Resultados obtenidos del conteo de puntos del cuarto bombardeo a partir del primer
da post-inoculacin

distancia (cm) presin (psi) concentracin (g) total puntos
2 50 1.25 7
2 70 1.25 31
2 90 1.25 69
2 50 2.5 33
2 70 2.5 4
2 90 2.5 74
3 50 1.25 1
3 70 1.25 22
3 90 1.25 68
3 50 2.5 14
3 70 2.5 41
3 90 2.5 79

Los nmeros marcados con azul muestran la mayor cantidad de puntos
que se obtuvieron de partir de la concentracin de 2.5 (g) y de la presin de
90 psi, aunque la distancia de bombardeo no qued muy definida hasta este
momento. Pero lo que si fue claro, es que los mejores resultados que se
obtuvieron con el uso de las partculas de tungsteno y la pistola de filtro han
sido a partir de la concentracin de 2.5 (g).
34
Se pens en la posibilidad de probar otro tipo de partculas en este caso
de oro, sabiendo que estas son ms densas que el tungsteno y por lo tanto su
penetracin es ms rpida, por lo cual se diseo un pequeo experimento solo
para ver la cintica de sintomatologa.
El bombardeo se realiz con las mismas combinaciones que el anterior
para partculas de tungsteno pero en el caso de las partculas de oro solo se
probaron las siguientes (ver tabla 15).

Tabla 15. Condiciones utilizadas para la estandarizacin final del mtodo con la pistola de filtro
y con partculas de oro

distancia(cm) presin (psi) concentracin (g)
2 50 1.25
3 50 2.5
3 70 2.5

Se utilizaron 144 plantas para partculas de tungsteno y 36 plantas para
partculas de oro porque se hicieron 12 repeticiones de cada combinacin. Para
las partculas de tungsteno fueron 12 combinaciones y para las de oro 3
combinaciones. Las plantas despus del bombardeo fueron observadas a
diario para ver la aparicin de la sintomatologa, la cuales se describe en las
Tablas 16 y 17.

Tabla 16. Total de plantas infectadas las cuales fueron bombardeadas con el Virus CaLCuV,
obtenidos de la segunda cintica con la pistola de filtro y con partculas de tungsteno

dpi no. combinacin
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
6 3 5 3 4 5 2 5 5 3 5 7 7
11 3 5 3 5 8 3 5 5 3 5 7 7
14 3 5 3 6 10 6 5 5 3 5 7 7
18 3 5 3 7 10 7 5 5 3 5 7 7
22 3 5 3 7 10 7 5 5 3 7 7 7
total 3 5 3 7 10 7 5 5 3 7 7 7

35

Tabla 17. Total de plantas infectadas las cuales fueron bombardeadas con el Virus CaLCuV,
obtenidos de la segunda cintica con la pistola de filtro y con partculas de oro

dpi no. plantas infectadas
2cm.50psi.1.25g
3cm.50psi.2.5g
3cm.70psi.2.5g
6 10 9 4
11 11 11 6
14 11 11 7
18 11 11 8
22 12 11 8
total 12 11 8

En base a estos resultados podemos observar que el mejor bombardeo
hecho con las partculas de tungsteno, fue utilizando una distancia de 2 cm.,
70 psi y 2.5 g., ya que de 12 plantas bombardeadas 10 presentaron sntomas,
mientras que en el bombardeo hecho con partculas de oro, los resultados son
mejores en cualquiera de las tres combinaciones usadas, siendo la de mayor
nmero de plantas infectadas las bombardeadas a 2 cm., 50 psi y 1.25 g.,
habindose infectado las 12 plantas utilizadas.
Otro aspecto muy importante es el del periodo de tiempo despus de la
inoculacin. En estos experimentos se logr acortar el tiempo, ya que a partir
de 5to. da las plantas mostraron una sintomatologa muy visible, adems de
que el nmero de plantas con sntomas se mantiene en los das posteriores a
la inoculacin.
Hasta este momento concluimos que las partculas de oro resultaron
mejores para la infeccin en comparacin con las partculas de tungsteno y
que sta ltima combinacin (2 cm., 50 psi y 1.25 g) fue la mejor para una
infeccin sistmica con geminivirus. Adems esta combinacin tiene una gran
ventaja, pues la cantidad de gas helio es mucho menor ya que se utiliza una
presin muy baja.
36
Una vez que se logr encontrar la condicin ms estable y favorable se
procedi a corroborar los resultados obtenidos. Para esto se decidi volver a
repetir el bombardeo, pero esta vez utilizando nuestro control positivo
PWRG1515 y utilizando los dos tipos de partculas. Se procedi a tomar
muestra del primer dpi y se hicieron los ensayos correspondientes de beta-
glucoronidasa. Se hicieron 3 repeticiones para cada combinacin, dando un
total de 46 plantas para cada tratamiento. Las observaciones hechas al
estereoscopio para el conteo de puntos azules, se muestran en las Tablas 18 y
19 para cada tipo de partculas correspondiente.

Tabla 18. Resultados obtenidos del conteo de puntos del quinto bombardeo a partir del
primer da post-inoculacin y con partculas de tungsteno

distancia
(cm)
concentracin
(g)
presin
(psi) no. de repeticiones
2 1.25 50 11 1 0
2 1.25 70 6 13 0
2 1.25 90 10 20 17
2 2.5 50 6 7 8
2 2.5 70 15 9 4
2 2.5 90 4 2 2
3 1.25 50 4 3 2
3 1.25 70 4 4 1
3 1.25 90 5 4 3
3 2.5 50 3 10 0
3 2.5 70 3 10 0
3 2.5 90 4 4 4
Tabla 19. Resultados obtenidos del conteo de puntos del quinto bombardeo a partir del
primer da post-inoculacin y con partculas de oro

distancia
(cm)
concentracin
(g)
presin
(psi) no. de repeticiones
2 1.25 50 65 40 80
2 1.25 70 50 30 4
2 1.25 90 4 0 0
2 2.5 50 45 45 34
2 2.5 70 28 30 35
2 2.5 90 15 14 7
3 1.25 50 0 0 0
3 1.25 70 22 22 6
3 1.25 90 22 32 36
3 2.5 50 20 24 42
3 2.5 70 0 0 0
3 2.5 90 11 9 6

37
Se pudo comprobar que las partculas de oro en la condicin de 2 cm,
1.25 g y 50 psi resultan ser la mejor en la expresin del mensajero GUS, ya
que es en la que ms puntos azules se observaron, en comparacin con las
partculas de tungsteno donde el nmero de puntos es menor y la condicin de
2 cm, 1.25 g y 90 psi es diferente a la que ya se haba encontrado en el
bombardeo anterior, es decir no permanece estable.
Los resultados del conteo de puntos de cada combinacin, se
promediaron y se graficaron para una mejor apreciacin (Tabla 20 y 21).
Despus se tomaron fotos de las plantas bombardeadas con el control positivo
PWRG1515, con los dos tipos de partculas tungsteno y oro, las cuales se
observan en la tabla 22 y 23 respectivamente.

Tabla 20. Grafica que muestra los resultados obtenidos del ltimo bombardeo con la pistola de
filtro y las partculas de tungsteno

TUNGSTENO
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Combinaciones
N
o
.

P
u
n
t
o
s

Tabla 21. Grafica que muestra los resultados obtenidos del ltimo bombardeo con la pistola de
filtro y las partculas de oro
ORO
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Combinaciones
N
o
.

P
u
n
t
o
s

38
Tabla 22. Fotografa de plantas inoculadas en el ltimo bombardeo con DNA de control
positivo PWRG1515, observadas al estereoscopio. El bombardeo fue realizado con la pistola
de filtro y partculas de tungsteno

Tabla 23. Fotografa de plantas inoculadas en el ltimo bombardeo con DNA de control
positivo PWRG1515, observadas al estereoscopio. El bombardeo fue realizado con la pistola
de filtro y partculas de oro

39

Una vez conocida la mejor combinacin para el bombardeo, se procedi
a comparar la sintomatologa de esta combinacin con los dos tipos de
partculas, utilizando DNA del virus (CaLCuV). Para esto se utilizaron 20
plantas para cada tratamiento, por ltimo se contabiliz el nmero de plantas
infectadas con los dos tipos de partculas (Tabla 24) y se procedi a tomar
fotografas para observar la cintica de una planta para cada tratamiento y de
esta manera observar el grado de infeccin, como se muestra en las tablas 25
y 26 respectivamente.

Tabla 24. Total de plantas infectadas las cuales fueron bombardeadas con el Virus CaLCuV
Tungsteno
2cm.50psi.1.25g
Oro
2cm.50psi.1.25g

Total

7

13

Tabla 25. Fotografa de la cintica de una planta bombardeada con partculas de tungsteno,
mostrando los sntomas tpicos del virus (mosaico y arrugamiento de las hojas)

7 dpi
11 dpi 15 dpi 18 dpi

40
Tabla 26. Fotografa de la cintica de una planta bombardeada con partculas de oro,
mostrando los sntomas tpicos del virus (mosaico y arrugamiento de las hojas).

7 dpi 11 dpi 15 dpi 18 dpi

Para concluir en este objetivo y despus de haber probado varias
combinaciones, se llego a lo siguiente: la mejor presin fue de 50 psi, la mejor
distancia fue de 2 cm y la mejor concentracin de DNA fue de 1.25 g,
utilizando la pistola de filtro y las partculas de oro.

V.3 VALIDACIN DE LA TCNICA DE BOMBARDEO UTILIZANDO LINEAS
TRANSPOSANTES
En este objetivo se validaron los resultados obtenidos con la
estandarizacin en plantas silvestres de Arabidopsis. Para llevar a cabo dicha
validacin, se utilizaron plantas transgnicas de Arabidopsis, las cuales poseen
un transposn modificado. Las semillas transgnicas fueron proporcionadas
por el Laboratorio de Desarrollo Reproductivo y Apomixis.
Las lneas transgnicas utilizadas para validar el mtodo estandarizado
de bombardeo, haban sido previamente seleccionadas en el laboratorio de
Virologa Vegetal. Para seleccionar esas lneas, se hizo un escrutinio de 500
lneas transgnicas como parte del trabajo doctoral de MC. Diana Trejo.
41
De este escrutinio, fueron seleccionadas 8 lneas que solo mostraron
expresin del gen reportero GUS en las plantas bombardeadas con el Virus
CaLCuV. Los nmeros de las lneas son los siguientes: 24, 208, 209, 210, 221,
327, 643 y 699. Cabe mencionar que las lneas seleccionadas corresponden a
aquellas que poseen el transposn (trampa gnica) con la modalidad gene trap.
Una vez identificadas dichas plantas, se procedi a la germinacin de la
semillas previamente desinfectadas (Ver anexo, protocolo 1) in Vitro, posterior
a ello se colocaron en un medio de cultivo nutritivo de Murashige y Skoog (MS)
con 5mg/ml de kanamicina y se mantuvieron durante tres das a 4 C para
romper la dormancia, despus se pasaron a una cmara de crecimiento con un
fotoperodo y temperatura controlado.
Despus de la germinacin de semillas de Arabidopsis silvestre cuando
las plntulas presentaban de 2 a 3 hojas verdaderas, estas fueron transferidas
a una mezcla especial de sustrato para Arabidopsis (3:1:1 mezcla sunshine (no
3), zololite vermiculita, agrolita hortiperl). Se mantuvieron tapadas con una
charola transparente incubadas en una cmara de crecimiento con un
fotoperodo 8 horas luz, 16 horas oscuridad.
Cuando las plntulas tenias de 6 a 8 hojas verdaderas, se procedi al
bombardeo aplicando la condicin ms favorable lograda con la
estandarizacin en Arabidopsis silvestre (2cm., 50psi, 1.25 g, partculas oro y
pistola de filtro).
El bombardeo fue realizado con el virus CaLCuV, y como controles
negativos, se utiliz DNA de un vector pBluescript y plantas sin bombardear.
Se tom muestra del tejido bombardeado a diferentes das post-
inoculacin (1,3,5,7 dpi) y se procedi al ensayo histoqumico de GUS (ver
anexo, protocolo 4). El tejido fue observado al estereoscopio y los resultados se
muestran en la Tabla 27.

42
Tabla 27. Resultados obtenidos del conteo de puntos del bombardeo de las plantas
transposantes con DNA de control positivo PWRG1515

MGT CaLCuV
1 3 5 7
PKS
1 2 3 4
S/B

24 50 36 40 15 0 0 0 0 0
208 6 8 6 1 1 7 3 4 1
209 1 0 1 1 0 1 3 1 1
210 6 4 0 0 2 4 1 0 7
221 3 1 2 1 1 4 0 2 8
327 13 18 0 8 0 0 0 0 0
643 10 10 7 5 3 3 0 1 0
699 9 20 5 5 0 0 0 0 0

Como se observa en la tabla, las lneas MGT 24, 327 y 699 son las que
mostraron un mejor patrn de expresin, especialmente la MGT 24 ya que es la
que presenta mayor cantidad de puntos azules. Este solo se present en las
plantas bombardeadas con el virus, mientras que con los dos tipos de controles
negativos no hubo expresin; tambin pudimos observar que la mayor
expresin surge entre el primero y tercer da post-inoculacin, esto nos indica
que en este tiempo el gen etiquetado por la trampa gnica presenta mayor
actividad cuando el virus est presente.
En las otras lneas tambin hay expresin, aunque esta es ms baja.
Pero aparte la expresin tambin est en los controles, esto puede deberse al
dao mecnico que sufren las plantas por si solas al presentarse el bombardeo
o a que quiz la condicin con la que fueron seleccionadas en el primer
bombardeo (escrutinio) no era la correcta. Se tomaron fotografas de las
plantas transposantes, estas son mostradas en la Tabla 28.

43
Tabla 28. Fotografa de las plantas transposantes inoculadas con el virus CaLCuV,
observados con el microscopio

CaLCuV
MGT 24
MGT 208
MGT 209
MGT 210

MGT 221

MGT 327
MGT 643
MGT 699
44
V.4 IDENTIFICACIN DEL GEN ETIQUETADO POR TAIL-PCR

En este ltimo objetivo se identificaron las secuencias adyacentes al
sitio de insercin de las lneas transgnicas seleccionadas (transposantes), por
medio de la tcnica de TAIL-PCR.
Lo primero que se hizo fue una extraccin de DNA de las lneas
transposantes (MGT 24, 208, 209, 210, 221, 327, 643 y 699) (ver anexo,
protocolo 5).
Una vez obtenido el DNA se corri 1 l en un gel de agarosa 1% para
comprobar el estado del DNA.
Se procedi a la preparacin de las lneas para la tcnica de Tail-PCR
(ver anexo, protocolo 6).
Se volvi a correr otro gel de agarosa 1%, de los productos obtenidos en
el Tail-PCR de las tres reacciones, de cada una de las muestras. (Figura 9).

1 2 3 4

2. Segunda reaccin
1. Primera reaccin
3. Tercera reaccin
4. 100 pb

Figura 9. Fotografa de un gel de agarosa donde se muestra una reaccin de Tail-PCR

45

En el primer carril tenemos la primera reaccin del Tail-PCR donde se
uso el primer oligo especfico que se unir a una secuencia del transposn y
el primer oligo degenerado que se unir a cualquier secuencia del genoma,
estos se unirn debido a ciclos subsecuentes de varias combinaciones de
altas y bajas temperaturas, obtenindose un producto especfico encontrado
por el primer oligo especfico y un primer oligo degenerado del otro lado. En la
segunda reaccin pasa exactamente lo mismo slo que aqu se utiliza otro tipo
de oligo especfico, este es ms pequeo y se encuentra alineado un poco ms
adentro de la secuencia del transposn, mostrando ms claramente un
producto especfico que debe ser casi del mismo tamao que el obtenido en la
primera reaccin y por ltimo en la tercera reaccin tenemos tambin otro tipo
de oligo especfico, ms chico y alineado ms adentro de la secuencia del
transposn que el segundo, por eso la amplificacin es menor, por esta razn
es fcilmente observado y debido a la forma de alineacin de los oligos
especficos, surge este efecto de escalera.
Estas lneas fueron clonadas en un vector denominado pGEM (ver
anexo, protocolo 7).
La ligacin fue introducida a bacterias calcio-competentes de
Escherichia coli cepa JM-109 (ver anexo, protocolo 8 y 9).
Posterior a la transformacin, las colonias crecidas fueron seleccionadas
e inoculadas en 2 ml de medio Lb lquido con antibitico, haciendo una rplica
de estas en una placa de Lb con carbenicilina, X-Gal e IPTG, estas fueron
incubadas a 37C toda la noche.
Continuando, los tubos fueron procesados para (ver anexo, protocolo
10). extraer el DNA plasmdico
Una vez obtenido el DNA se hizo una digestin con la enzima EcoR I
para cada DNA de las colonias que se obtuvieron para comprobar que
efectivamente el fragmento estuviera clonado en el vector. (ver anexo,
protocolo 11).
Finalmente se corri un gel de agarosa 1%, tomando los 10 l de la
digestin, para checar que el patrn de bandeo correspondiera al obtenido del
Tail-PCR, de las lneas seleccionadas.

46

pGEM
Fragmentos
clonados y
liberados por
EcoRI

Figura 10. Fotografa de un gel de agarosa donde se muestra los productos obtenidos del Tail-
PCR clonados en el vector de PGEM

Una vez observado que el tamao de las bandas correspondiera al
obtenido en el Tail-PCR, el resto del DNA se envi a secuenciar en el
Laboratorio de Genmica del CINVESTAV.
Las secuencias obtenidas fueron analizadas y comparadas en las bases
de datos NCBI y TAIR (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/,
http://www.arabidopsis.org/) para identificar la secuencia del gen que flanquea
al transposn, as como sus regiones regulatorias.
Debido a que las lneas seleccionadas corresponden a aquellas que
poseen el transposn (trampa gnica) con la modalidad gene trap, las cuales
no llevan un promotor mnimo, por lo tanto dependen de la trascripcin del gen
cromosomal para reportar la expresin del gen.
Los resultados son mostrados en las figuras 12, 13, 14, 15 y 16.

47

Sequences producing significant alignments: Score E
(Bits) Value
gi|6468048|gb|AC006932.8|AC006932 Genomic sequence for Arabid... 1342 0.0
gi|30680628|ref|NM_100714.2| Arabidopsis thaliana GTP binding AT 662 0.0
gi|42454491|emb|BX841833.1|CNS09Y39 Arabidopsis thaliana Full... 490 4e-135
gi|66792665|gb|BT023444.1| Arabidopsis thaliana At1g08410 gene, 472 9e-130

5' 3'

20 140

160 pb

regin promotora

marco de lectura abierta

sitio de insercin

Figura 11. Anlisis surgidos a partir de la base de datos, de la lnea MGT 221 DS3-3 AD2,
donde se muestra la comparacin de la secuencia, correspondiente al gen AT1G08410 que
codifica para la protena relacionada a mantenimiento estructural del cromosoma y el sitio de
insercin del transposn.
48
Del anlisis de esta primera secuencia podemos observar que el
transposn, se insert en un promotor del gen AT1G08410 para una protena
relacionada a mantenimiento estructural del cromosoma, pero el cual esta en
antisentido con respecto a GUS, por lo cual no puede haber expresin de dicho
gen, o si existe no es debido al transposn, por el lado contrario hay un gen
que si esta en sentido a GUS y aunque est muy cerca del inicio del promotor,
no existen las condiciones necesarias para su expresin (inicio ATG, cajas
TATA, GATA, etc).

(Bits) Value
gi|6822049|emb|AL137080.2|ATF28O9 Arabidopsis thaliana DNA chrom 1491 0.0
gi|166638|gb|M58464.1|ATHBG3A Arabidopsis thaliana beta-1,3-g... 204 3e-49

3' 5'

650 3330

3980 pb
regin promotora


sitio de insercin

donde se muestra la comparacin de la secuencia correspondiente al gen AT3G57240 que
codifica para la protena beta 1,3 glucanasa y el sitio de insercin del transposn

49

Del anlisis de esta secuencia observamos que el transposn, se
insert en un promotor del gen AT3G57240 que codifica para la protena beta
1,3 glucanasa la cual esta en antisentido con respecto a GUS, por lo cual no
puede haber expresin de dicho gen.

(Bits) Value
gi|3510345|dbj|AB017069.1| Arabidopsis thaliana genomic DNA, chr 1134 0.0
gi|38603959|gb|BT010947.1| Arabidopsis thaliana At5g37260 gene, 394 1e-106
gi|18421626|ref|NM_123084.1| Arabidopsis thaliana protein bin... 270 5e-69
i|18421624|ref|NM_123082.1| g Arabidopsis thaliana protein bin... 230 5e-57
3' 5'
630 pb
regin promotora
sitio de insercin
la protena de la familia relacionada a dedos de zinc y el sitio de insercin del
ansposn

500 130

donde se muestra la comparacin de la secuencia correspondiente al gen AT5G37250 que
codifica para
tr
50
insert en sentido al marco de lectura abierta del gen AT5G37250 que codifica
para la protena de la familia relacionada a dedos de zinc, la cual esta en
sentido con respecto a GUS, en este caso si hay expresin de dicho gen, el
cual es encendido cuando la planta es bombardeada por el virus CaLCuV.

Sequences producing significant alignments:
(Bits) Value
Score E
gi|12408726|gb|AC010927.5|ATAC010927 Arabidopsis thaliana chr... 1871 0.0
gi|6942236|gb|AF221984.1|AF221984 Arabidopsis thaliana threon... 1871 0.0
gi|30681122|ref|NM_111840.2| Arabidopsis thaliana OMR1 (L-O-M... 535 9e-149
5

regin promotora
sitio de insercin
ente
licsido
idrolasa poligalacturonasa y el sitio de insercin del transposn

3 '

185

DS3-3 AD2, donde se muestra la comparacin de la secuencia correspondi
al gen AT3G61500 que codifica para la protena de la familia del G
h
51

sertado no corresponde a dicho gen, por lo cual no hay expresin
del mismo.

Del anlisis de esta secuencia observamos que aunque el transposn,
se insert en sentido con respecto al gen AT3G61500 que codifica para la
protena de la familia del Glicsido hidrolasa poligalacturonasa, el promotor
donde fue in

(Bits) Value

gi|7270796|emb|AL161593.2|ATCHRIV89 Arabidopsis thaliana DNA chr 1558 0.0
gi|9502398|gb|AC069558.5|AC069558 Genomic Sequence For Arabid... 1558 0.0
gi|4467131|emb|AL035540.1|ATF20M13 Arabidopsis thaliana DNA c... 1558 0.0
gi|6686899|emb|AJ270310.1|ATH270310 Arabidopsis thaliana mRNA... 706 0.0
'

500

5000 pb
regin promotora
sitio de insercin

5 3'

4 50

52
donde se muestra la comparacin de la secuencia correspondiente al gen AT4G38590 Protena
beta galactosidasa putativa y el sitio de insercin del transposn

insert en antisentido con respecto al marco de lectura abierta del gen
AT4G38590 que codifica para la protena beta galactosidasa putativa, por lo
cual, en este caso no hay expresin de dicho gen.
En las lneas seleccionadas, el patrn de expresin observado se deber
a que el transposn ha etiquetado un gen que se expresa por la presencia viral
(para el caso de las lneas gene trap).

53
VI. CONCLUSIONES

1. Debido al rea de dispersin de las partculas, la pistola de filtro fue la
ms eficiente para inoculacin de DNA viral en plantas de Arabidopsis
thaliana.

2. Las mejores condiciones utilizando partculas de oro fueron: 50 psi de
presin, 1.25 g y una distancia de 2 cm con respecto a la planta.

3. Las mejores condiciones utilizando partculas de tungsteno fueron: 90
psi de presin, 2.5 g de DNA y 3 cm de distancia.

4. Las partculas de oro son las mejores candidatas a utilizar, ya que la
cantidad tanto de gas helio como de DNA viral utilizado fue menor que
la cantidad utilizada con las partculas de tungsteno.

5. Ambas condiciones (oro y tungsteno) pueden ser utilizadas para hacer
ensayos transitorios, as como para inocular DNA viral en plantas de
Arabidopsis thaliana.

6. Se logr amplificar las secuencias adyacentes al transposn nicamente
en las lneas MGT208, MGT221 y MGT643.

7. No se logro obtener la secuencia adyacente al transposn en las lneas
MGT24, MGT209, MGT210, MGT327 y MGT699,

8. Los resultados obtenidos en la validacin con las lneas transposantes
demuestran que la tcnica es altamente eficiente para inocular DNA
geminiviral en Arabidopsis thaliana .

54
VII REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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VIII. LISTA DE ABREVIATURAS
ARN cido ribonucleico
ADN cido desoxiribonucleico
DNAcd DNA de cadena doble
DNAsd DNA de cadena sencilla
MCR mecanismo de crculo rodante
CaLCuV virus del enrollamiento de la hoja de la col
RC regin comn
58
RI regin intergnica
MLA marcos de lectura abierta
Rep protena iniciadora de la replicacin
REn protena potenciadota e la replicacin
TrAP protena activadora de la transcripcin
CP protena de la cpside
AR1 protena codificadora de la protena de la cpside
BR1 protena que permite el transporte del genoma viral
BL1 protena encargada del movimiento clula-clula
PCNA antgeno nuclear de proliferacin celular
PCR reaccin en cadena de la polimerasa
NPTII gen de resistencia a kanamicina
ET enhancer trap
GT gene trap
35S promotor derivado del virus del mosaico de la coliflor
AD primer degenerado
DS primer especfico
Kb kilobases
pb pares de bases
cm centmetro
g microgramo
l microlitro

IX. ANEXOS

Protocolo 1
Desinfeccin de semilla de Arabidopsis
PROCEDIMIENTO

1. Colocar las semillas en tubos eppendorf
59
2. Agregar 200 l de etanol 70%
3. Mezclar durante dos minutos
4. Retirar sobrenadante
5. Agregar 500 l de cloro al 10%
6. Mezclar durante 10 min
7. Enjuagar con agua desionizada estril 3 veces
Nota: El proceso de desinfeccin se realiz bajo condiciones aspticas y en
campana de flujo laminar.

Protocolo 2
Preparacin de partculas de oro y tungsteno
PROCEDIMIENTO

1. Pesar 60 mg de partculas de tungsteno M10 (BioRAD)
2. Agregar las partculas en un tubo corex de cristal de 15 ml
3. Agregar 2 ml de HNO3
4. Resuspender
5. Centrifugar por 30 seg a 12 K
6. Eliminar con micropipeta el HNO3
7. Agregar 1 ml de agua desionizada estril y transferir a un tubo eppendorf
de 2 ml
8. Centrifugar de 10 a 30 segundos a 10 K
9. Eliminar el agua con micropipeta y agregar 1 ml de etanol absoluto
10. Resuspender brevemente
11. Centrifugar d 10 a 30 segundos a 10 K
12. Eliminar el etanol con pipeta y agregar 1 ml de agua desionizada estril
13. Resuspender brevemente
14. Colocar 250 l de la suspensin en cuatro tubos eppendorf y agregar
750 l de agua desionizada estril a cada tubo
Nota: Resuspender con un sonicador de partculas

Protocolo 3
60
Preparacin de partculas de tungsteno con el ADN viral para ensayos
de biobalstica
PROCEDIMIENTO
1. Sonicar y vortexear el tungsteno preparado
2. Colocar 50 l de partculas de tungsteno resuspendidas en agua
destilada
3. Adicionar lentamente DNA viral (dependiendo de la concentracin
requerida)
4. Adicionar 50 l de CaCl2 5M
5. Adicionar 20 l de espermidina 0.1M
6. Vortexear y sonicar hasta homogeneizar
7. Centrifugar de 10 a 15 segundos
8. Eliminar el sobrenadante
9. Adicionar 500 l de etanol absoluto
10. Vortexear y Sonicar
11. Centrifugar 10 segundos
12. Eliminar sobrenadante
13. Adicionar 60 l de etanol absoluto (para 6 disparos)
14. Sonicar cada vez que se tome muestra para bombardear
Nota:
a) Las partculas no pueden ser utilizadas cuando haya transcurrido ms
de 3 horas despus de su preparacin con el DNA viral
b) Los componentes deben adicionarse en estricto orden y con agitacin
constante para evitar su aglutinacin
c) En cada paso resuspender usando un sonicador

Protocolo 4
Anlisis histoquimico de la -glucoronidasa

1. Las hojas o en su caso toda la planta se colocan directamente con el
sustrato (solucin X-GLUC, anexo, cuadro 1), en cajas de titulacin y
mantenidas durante toda la noche a 37 C con agitacin constante.
61
2. Desteir el tejido con metanol-acetona 3:1 para hacer ms evidente
la expresin o la no expresin de GUS.
3. Por ltimo se mantienen almacenadas en glicerol 50%.
4. El material es visualizado con un estereoscopio (Nikon).

Protocolo 5
Extraccin de DNA genmico de Arabidopsis

Mtodo de extraccin de DNA CTAB
1. Tomar de 4 a 5 hojas o la planta completa si es muy pequea
2. Colocar el tejido en tubos eppendorf y congelas las muestras en
nitrgeno lquido
3. Moler las muestras congeladas abriendo el tubo eppendorf y macerar el
tejido con la punta metlica del homogenizador
4. Adicionar 500 l de CTAB
5. Incubar las muestras a 65 C por 30 minutos. Dejar enfriar
6. Adicionar 500 l de cloroformo isoamlico. Agitar en vortex
7. Centrifugar por 10 minutos a 12500 rpm
8. Pasar el sobrenadante a otro tubo
9. Adicionar 400 l de isopropanol fro. Agitar invirtiendo el tubo
10. Centrifugar inmediatamente por 5 minutos a 12500 rpm
11. Tirar sobrenadante y lavar la pastilla con 300 l de etanol al 70%
12. agitar manualmente y centrifugar 5 minutos a 12500 rpm
13. Tirar sobrenadante y dejar secar la pastilla
14. Disolver la pastilla en 60 l de agua estril

Protocolo 6
Protocolo de preparacin de las muestras para tcnica de Tail-PCR

Primera Reaccin (Volumen final 20 l totales)
1. En un tubo de PCR poner 5 l mezcla de PCR 1X
2. Agregar 2 l de los oligos especficos DS3-1 (2 pmol/ l)
62
3. Agregar 3 l de los oligos degenerados AD1 y AD2 (20 pmol/l)
4. Agregar 1 l de DNA
5. Agregar 9 l de Agua estril

Segunda reaccin (Volumen final 20 l totales)
2. Agregar 2 l de los oligos especficos DS3-2 (pmol/ l )
3. Agregar 2 l de los oligos degenerados AD1 y AD2 (20 pmol/l )
4. Agregar 1 l de DNA (dilucin 1:50 del primer producto de PCR)

Tercera reaccin (Volumen final 20 l totales)
7. Agregar 2 l de los oligos especficos DS3-3 (2 pmol/ l )
8. Agregar 2 l de los oligos degenerados AD1 y AD2 (20 pmol/l)
9. Agregar 1 l de DNA (dilucin 1:50 del segundo producto de PCR)

Protocolo 7
Ligacin en un vector de pGEM (Kit)

1. En un tubo eppendorf agregar 5 l de Buffer de ligacin 2X
2. Adicionar 1 l de T4 DNA ligasa
3. Adicionar 1 l del vector T- Easy pGEM
4. Adicionar 2 l del producto del Tail- PCR seleccionado
5. Adicionar 1 l de agua estril
6. Mezclar muy bien el volumen final (10 l) e incubar a 4 C toda la noche

Protocolo 8

Produccin de clulas competentes de Escherichia coli (clulas de
rubidio)
PROCEDIMIENTO
63
Este protocolo es usado para las cepas de E.coli MC1061/P3, HB101, XS127,
Top10, Top10F y Top10F/P3
1. Incubar toda la noche a 37 C un tubo con 25 l de medio SOB lquido y
25 l de la cepa de inters
2. Agregar las bacterias crecidas a 1 litro de medio SOB lquido en un
matraz de 2 litros, incubar en agitacin a 37 C (200 rpm) hasta que la
densidad ptica 550, este dentro de 0.500 y 0.550
3. Transferir las clulas a una botella de centrfuga de 500 ml e incubar en
hielo por 30 minutos aproximadamente
4. Centrifugar a 2500 rpm a 4 C durante 12 a 15 minutos
5. Retirar el sobrenadante cuidadosamente a cada botella y resuspender
la pastilla en 40 ml de la solucin RF1 fra (ver cuadro 5)
6. Dejar reposar por 15 minutos a 4 C
7. Centrifugar a 2500 rpm a 4 C por 9 minutos
8. retirar el sobrenadante cuidadosamente a cada botella y resuspender la
pastilla en 3.5 ml de la solucin RF2 fra (ver cuadro 6)
9. Reunir las clulas en una botella
10. Dejar reposar por 15 minutos a 4 C
11. Preparar alcuotas de 80 l de clulas en tubos de 1.5 ml
12. Congelar inmediatamente en hielo seco
13. Almacene las clulas a -70 C
Nota:
a) En los pasos del 3 al 6 se debe mantener el mayor tiempo posible las
clulas en hielo. Para clulas HB101 dejar reposar en hielo por 2 horas
b) Poner a enfriar los tubos de 500 ml
c) Para no variarles la T a las clulas
d) Todos los pasos hacerlos bajo condiciones aspticas
e) Al alicuotar pasar directamente a nitrgeno lquido

Protocolo 9

Transformacin de clulas competentes por choque trmico
1. Descongelar las clulas competentes en hielo (alcuota 50 l)
2. Adicionar la cantidad de DNA requerido (10 l ligacin)
64
3. Dejar reposar en hielo 20 minutos
4. Dar un choque trmico a las clulas incubndolas a 42 C por 45
segundos
5. Aadir 1 ml de medio Lb sin antibitico
6. Incubar a 37 C por 1 hora
7. Centrifugar 2 min. A 1000 rpm
8. Tirar sobrenadante
9. Plaquear en medio Lb con Carbenicilina, X-Gal e IPTG
10. Incubar a 37 C toda la noche

Protocolo 10

Aislamiento de ADN plasmdico (miniprep Birboim)
PROCEDIMIENTO
1. Inocular un medio LB con el antibitico apropiado en tubos eppendorf
la noche anterior a 37 C de temperatura y en agitacin constante (16
horas)
2. Centrifugar (centrifuga marca Sorvall modelo 40175948) a 10000 rpm
durante 1 minuto
3. Descartar el sobrenadante y resuspender la pastilla en 100 l de la
solucin I de Birboim
4. Resuspender con un agitador tipo vortex
5. Adicionar 200 l de la solucin II de Birboim
6. Mezclar suavemente (10 inversiones mximo)
7. Adicionar 150 l de la solucin III de Birboim
8. Adicionar 1 volumen de cloroformo isoamlico
9. Centrifugar 5 minutos a 13000 rpm
10. Pasar la fase de arriba a un tubo nuevo
11. Adicionar un volumen de isopropanol
13. Desechar sobrenadante
14. Lavar con 300 l de etanol al 70%
15. Vortexear
65
17. Desechar sobrenadante
18. Secar la pastilla
19. Adicionar 20 l de agua estril
20. Analizar por electroforesis en gel de agarosa 1%

PROTOCOLO 11
Digestin
1. A un tubo eppendorf adicionar 5 l del DNA plasmdico (miniprep)
2. Adicionar 0.5 l de la enzima EcoR I
3. Adicionar 1 l del buffer correspondiente
4. Adicionar 3.5 l de agua estril
5. Mezclar muy bien el volumen final (10 l) e incubar a 37 C por 4 horas.

Cuadro 1
Compuestos de la solucin X-GLUC

Solucin de tincin Concentracin final

Buffer de fosfatos Na pH 7.0 50 mM
EDTA 10 mM

Tritn x-10 0.1 %
Ferrocianuro K 2 mM
Ferricianuro K 2 mM
Cloranfenicol 100 mg/ml
X-Gluc 1 mg/ml
_______________________________________________________________

Cuadro 2
Preparacin de agarosa
_______________________________________________________________
Compuesto
66

1 gr de Agarosa por cada 100 ml de TAE 1X
2.5 l de Bromuro de Etidio por cada 100 ml de TAE 1X

Cuadro 3
Mezcla del Tail-PCR

Compuesto Concentracin

Buffer 1 X Tris HCl pH 8.3 10 mM
KCl 50 mM
MgCl 2 0.001% gelatin
dNTPs 200 M c/u
Taq 0.8 u
_______________________________________________________________

Cuadro 4
Condiciones de Temperatura del Tail-PCR

Primera reaccin

Paso: 1
No. de ciclos: 1
Temperaturas: 93 C 1 min, 95 C 1 min.
Paso: 2
No. ciclos: 5
Temperaturas: 94 C 30 seg, 62 C 1 min, 72 C 2.5 min.
Paso: 3
No. ciclos: 1
Paso: 4
67
No. ciclos: 15
Paso: 5
No. ciclos: 1
Temperaturas: 72 C 5 min.
_______________________________________________________________

Segunda reaccin

Paso: 1
No. de ciclos: 12
Temperaturas: 94 C 10 seg, 64 C 1 min, 72 C 2.5 min, 94 C 10 seg, 64 C 1
min, 72 C 2.5 min, 94 C 10 seg, 44 C 1 min, 72 C 2.5 min,
Paso: 2
No. ciclos: 1
_______________________________________________________________

Tercera reaccin

Paso: 1
No. de ciclos: 5
Paso: 2
No. ciclos: 1
_______________________________________________________________

Cuadro 5

Soluciones para la Produccin de clulas competentes de E.coli (clulas
de rubidio)
RF1 RF2
68
RbCl 100 mM
MnCl 4H20 50 mM
Acetato de Potasio 30 mM
CaCl2 H20 10 mM
Glicerol redestilado 15% (w/v)
Ajustar pH a 5.8 con cido actico 0.2 M
Esterilizar por filtracin con filtros de 0.2
RbCl 100 mM
MOPS 10 mM
CaCl2 H20 75 mM
Glicerol redestilado 15% (w/v)

Ajustar pH a 5.8 con cido actico 0.2 M
Esterilizar por filtracin con filtros de 0.2

Cuadro 6
Medio de cultivo Luria-Broth (LB)
_______________________________________________________________
Compuesto %

Hidrolizado enzimtico de casena 1%
Cloruro de sodio 0.5 %
Extracto de levadura 0.5 %
_______________________________________________________________

Ajustado el pH a 7.2-7.4 y esterilizado a 121 C por 25 minutos y en caso de
ser necesario solificado con Bactoagar Oxoid 1.2%, adems de los
antibiticos necesarios para la seleccin de la bacteria, estos se adicionan una
vez que haya reducido la temperatura. Se seleccionaron con Kanamicina (100
mg/ml) Xgal (100 ml/ml) e IPTG (1 M)

Cuadro 7
Selecciones para extraccin de ADN plasmdico por medio de minipreps
birboim

69
Solucin de lisis
Birboim I
Solucin alcalina
Birboim II
Solucin salina
Birboim III
Tris HCl 1M pH8
EDTA 0.25M pH8
Glucosa 1M

Volumen final y aforar con
agua desionisada
NaOH 2N
SDS 10%

Volumen final y aforar con agua
desionisada
Acetato de Potasio 5M
Acido actico glacial

Volumen final y aforar con
agua desionisada

70

Trabajo Cientifico 3

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