Evaluacin histoqumica preliminar para determinar la presencia de algunos glucocomponentes de la mucosa de las bolsas guturales de los equinos* Preliminary

histochemical evaluation to determine the presence of some glycosaminoglycanes of the equine guttural pouches mucosa
Mara Patricia Arias Gutirrez1*, MV, MSc, PhD; Diego Alonso Zuluaga Araque1, MV, cEsp.
1*

Grupo de investigacin INCA-CES, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad CES. Calle 10 No 22-04, Medelln, Colombia. E-mail: marias@ces.edu.co (Recibido: 30 de abril, 2010; aceptado: 17 de noviembre, 2010)

Resumen
Las bolsas guturales (BG) del equino son divertculos de las trompas de Eustaquio cuya funcin no ha sido establecida an. Por su gran capacidad de albergar un volumen considerable de aire, la teora de Keith Baptiste, quien postula que las BG participan en la termorregulacin, es la ms aceptada. La caracterizacin de los componentes oligosacardicos que tapizan la mucosa de un rgano ayuda a determinar su funcionamiento, por lo cual, se caracterizaron los gluco-componentes de su mucosa mediante histioqumica convencional, con las tinciones de Periodic Acid Shift (PAS), Alcian Blue (AB) a pH 1,0 y AB a pH 2,5, para determinar la presencia de glicanos cidos, neutros y sulfatados en la mucosa. Se encontr una gran cantidad de mucosubstancias con componentes carboxilo en su vecindad atribuido al cido silico. Adicionalmente, se encontr que las clulas de la mucosa produjeron gluco-componentes sulfatados atribuidos a material glucdico carboxilado. Debido a la capacidad del cido silico de retener agua, al formar una capa higrfoba en la superficie de la mucosa que tapiza, es probable que una de las funciones de las BG sea participar en la termorregulacin, enfriando la sangre que pasa por la arteria cartida interna y que va al cerebro, especialmente durante el ejercicio.

Palabras clave
cido silico, bolsas guturales, gluco-componentes, oligosacridos, termorregulacin.

Abstract
Equine guttural pouches (GP) are diverticula from the Eustaquian tube and their function has not been established yet. Because of their capacity to contain a considerable amount of air, the theory of Babtiste who postulates that GP

*Para citar este artculo: Arias MP, Zuluaga DA. 2010. Evaluacin histoqumica preliminar para determinar la presencia de algunos glucocompone ntes de la mucosa de las bolsas guturales de los equinos. Rev CES Med Vet Zootec; Vol 5 (2):37-43.

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participate in thermoregulation is the most accepted. The ultra structure of an organ can determine its functioning, therefore, to look for explain the main function of GP, the glycocomponets of the GP mucosa were characterized by conventional histochemestry, by de Periodic Acid Shift (PAS) staining, and Alcian Blue (AB) at pH 1,0 and AB at pH 2,5 staining methods. It was found a great amount of mucosubstances with vicinal carboxyl components attributed to sialic acid. In addition, it was found that mucosal cells produced sulphated glycocomponets attributable to carboxylic glucidic material. Because of the sialic acid capacity of retaining water, forming a hydrophobic layer on the mucosa, probably one of the functions of GP is to participate in thermoregulation, cooling the blood of the internal carotid artery which goes to the brain, especially during exercise.

Key words
Glyco-components, guttural pouches, oligosacharides, sialic acid, thermoregulation.

Introduccin
Las bolsas guturales (BG) son divertculos ventrales de las trompas de Eustaquio que comunican el odo medio con la nasofaringe y se ubican en la regin parotidea, y que estn presentes todos los animales perisodctilos 3. Esta conexin est cerrada normalmente, excepto durante la deglucin, cuando el orificio salpingo-farngeo se abre (Figura 1). Los equinos poseen las BG ms grandes entre las especies en las cuales estn presentes, ocupando una amplia rea en la porcin caudal de la cabeza; en caballos adultos cada una tiene una capacidad de volumen entre 300 a 600 mL 7. Cada bolsa gutural se comunica con la faringe a travs de un orificio de salida ubicado rostro-ventral al la hendidura farngea. Las secreciones mucosas producidas normalmente drenan hacia la faringe, a travs de los orificios faringotubricos, que son las partes ms declives cuando la cabeza del caballo esta relajada o descendida. Los orificios slo se abren cuando el caballo deglute, as pues que el consumo de pasto favorece el drenaje de las secreciones de las bolsas 8. sabe que si la entrada a las BG est obstruida los sonidos emitidos por el animal se replican de la misma manera 11. Carter et al . (1978), propusieron que las BG ayudan a equilibrar presiones entre el odo medio y la faringe, pero esta funcin no explica su gran tamao 7. Rooney et al. (1997), proponen que las BG facilitan la fisiologa de la deglucin, debido a su flexibilidad y posicin estratgica, expandindose y aumentando la capacidad de la faringe especialmente cuando el animal come pasto, pero esta teora no ha sido experimentalmente comprobada an 14. Keith Baptiste (1998) propone que las BG participan en la termorregulacin, y mediante un modelo experimental en cadveres y posteriormente en caballos anestesiados demostr que la ventilacin de las BG permite enfriar la sangre que pasa por la arteria cartida interna por debajo de la temperatura central.

Segn esta teora, el intercambio normal de aire durante la respiracin puede ser un mecanismo de enfriamiento cerebral para disipar el calor generado por el metabolismo, especialmente durante el ejercicio, permitiendo que el aire que La funcin de las BG en equinos no es clara entra a las BG enfren la sangre que pasa por la todava, pues la dificultad de crear un modelo arteria cartida interna, que en su recorrido pasa experimental que permita explicar su funcin en por la delgada pared de las BG 8,11, sin embargo, las animales vivos no ha permitido que se explique conclusiones de sus estudios son discutidas aun satisfactoriamente su funcin 7,8. La primera funcin (Figura 2). que se le atribuy a estos rganos es que actuaran como una caja de resonancia, sin embargo, hoy se 38
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respiratorias superiores 12. La caracterizacin de los glicanos de la mucosa de las bolsas guturales podra arrojar indicios que ayuden a apoyar alguna de las teoras existentes en cuanto al papel de las bolsas guturales, pues es reconocida la importancia que tienen las glicoprotenas y en particular, los glucosaminoglucanos en la determinacin de la funcin de diversos rganos1. La superficie del epitelio respiratorio en equinos est tapizado por una capa de moco que se renueva constantemente formando un moco visco elstico 4,10. Figura 1. Endoscopia de las bolsas guturales: entrada del Las propiedades visco elsticas del moco protegen las endoscopio a una de las BG a travs del orificio farngeo. clulas epiteliales de la mucosa. Las glicoprotenas y La flecha seala el pliegue salpingofarngeo. los gluco-componentes forman las mucinas que son abundantes componentes de las secreciones del tracto (Fotografa tomada en el Centro de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la respiratorio11. Los gluco-componentes interactan con Universidad CES con un endoscopio Pentax FG 29x, con fines ilustrativos) gran variedad de pptidos y hormonas, y se ha postulado que pueden estar involucrados en mecanismos inmunes, formando una barrera que atrapa agentes patgenos y partculas oxidativas 6,15. Aunque parece contrario a lo anterior, mltiples estudios has descrito una interaccin entre los gluco-componentes de la mucosa con microorganismos, principalmente bacterias, que las utilizan como receptores para colonizar los tejidos10. En el presente estudio se evalu la secrecin de gluco-componentes por parte de la mucosa de las BG por histoqumica convencional, con el fin de reunir ms elementos que permitan aclarar el papel principal de estos rganos en los equinos. Figura 2. Endoscopia de las bolsas guturales: Se Materiales y mtodos observa el paso de la arteria cartida interna (a) en su recorrido bajo la delgada pared de compartimento medial de la BG, y el hueso estilohiodeo (b) que separa los Tipo de estudio compartimentos medial y lateral. Estudio de tipo descriptivo.
(Fotografa tomada en el Centro de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad CES con un endoscopio Pentax FG 29x, con fines ilustrativos).

Histolgicamente, las BG estn cubiertas por una mucosa compuesta por un epitelio columnar pseudo-stratificado ciliado con abundantes clulas caliciformes localizadas principalmente en los pliegues; son evidentes las micro vellosidades de la mucosa 14. El grosor de la lmina propia es variable, y all se encuentran numerosas glndulas mucosas, serosas y mixtas. Las glndulas tubuloacinares agrupadas en la lamina propia submucosa y sus conductos excretores estn delineados por un epitelio cbico simple o columnar caracterstico de las vas 39

Recoleccin del tejido Se tomaron muestras de 1cm de dimetro de la pared de las BG de los compartimientos medial y lateral de 6 caballos sanos, machos castrados, pertenecientes a las razas de engorde: Caballo Agrcola Italiano, Avelignese, Franches Montagnes, Tolfetano y Murgese; estos caballos fueron sacrificados en la planta municipal de sacrificio de Sefro, regin Le Marche, Italia. Las muestras fueron fijadas inmediatamente en

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Carnoj por 24 horas y posfijadas en una solucin de acetato de calcio al 2% y paraformaldehido al 4% (1:1 v/v) por 3 horas a temperatura ambiente. Luego, las muestras fueron deshidratadas en escala gradiente de alcohol, aclaradas en xileno y embebidas en parafina. Se realizaron 10 secciones por animal de 5 m, (5 del compartimiento medial y 5 del compartimiento lateral), para un total de 60 secciones a ser analizadas. Las secciones se montaron en portaobjetos ( Superfrost Plus slides, Bio-Optica, Milano ), y luego las muestras se sometieron a la tinciones de AB y PAS a pH 1,0 y 2,5. Histoqumica convencional Para evaluar la produccin de glicanos, se prepararon 5 secciones por muestra. Una de las secciones se colore con Hematoxilina Eosina como control, para observar la integridad y normalidad del tejido; en cada una de las muestras de observ el grosor del epitelio, el grosor de la submucosa, la presencia de glndulas y sus conductos en la submucosa, la vascularizacin del tejido, la presencia de clulas caliciformes y de cilias en el epitelio, y la ausencia de clulas inflamatorias para determinar que no hubo cambios en la arquitectura del tejido. Los tejidos se compararon con placas histolgicas de coleccin. Las 4 secciones restantes se tieron usando las tcnicas de histoqumica convencional: AB y PAS, segn el protocolo propuesto por Spicer S y Schulte A (1992) 18, como se describe a continuacin:

sulfatados en la mucosa de las BG, observados en 10 campos de 400X, para cada una de las secciones.

Resultados
Los hallazgos histolgicos de las muestras sometidas a Hematoxilina-Eosina revelaron la normalidad el tejido (Figura 3). En ninguna de las secciones se encontraron alteraciones histopatolgicas en la mucosa de las BG. No se observ diferencia significativa en cuanto a la composicin tisular ni en cuanto a la distribucin de las glndulas de la submucosa entre las muestras obtenidas de los compartimentos medial y lateral. La naturaleza bioqumica de los oligosacridos de la mucosa de las BG fue evidenciada por histoqumica convencional, permitiendo obtener conclusiones ms relevantes sobre los glicanos secretados por los diferentes tipos de clulas de la mucosa. Se encontr que las clulas secretoras producen una gran cantidad de glicocomponentes. En particular, se observ una importante produccin de material glucdico neutro con hidroxilos vecinos, la mayora de ellos conteniendo mucosustancias cidas, en especial, condroitin sulfato B, heparina y heparan sulfato (Figura 4).

Adicionalmente, se encontraron mucosubstancias con componentes carboxilo en su vecindad atribuido al cido silico (Figura 5). Las clulas de la mucosa produjeron gluco-componentes sulfatados atribuidos al material glucdico 1. PAS: para detectar azcares neutros con carboxilado (Figura 6). En las clulas acinares se residuos de cido silico. encontr una gran produccin de sialomucinas, sulfomucinas, glucanos neutros, y cido silico con 2. PAS pH 1,0: para detectar azcares neutros y grupos O- acetil en el C4 (Figura 7). En las clulas steres O-sulfatados. ductales se encontraron glucanos escencialmente sulfatados, y en menor cantidad, residuos de 3. AB a pH 1,0: para detectar steres O-sulfatados. cido silico. La mayora de estas molculas fueron identificadas como mucosubstancias con 4. AB a pH 2,5: para detectar steres O-sulfatados, componentes cidos y neutros. cido silico, y grupos carboxilos con cido urnico o glucurnico. En las secciones sometidas a la tincin de PAS y AB se determin la positividad como indicador de la presencia de GAGs cidos y neutros y steres 40
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la presencia de azcares neutros y steres O-sulfatados en el epitelio.

Figura 3. La tincin con H-E muestra la normalidad del tejido. No se observaron cambios histopatolgicos del epitelio o de la submucosa.

Figura 6. La positividad al AB pH a 1.0 muestra la presencia de steres O-sulfatados en las glndulas submucosas.

Figura 4. La tincin con PAS evidencia la presencia de azcares neutros con gran cantidad de residuos de cido silico el epitelio y en las glndulas de la submucosa.

Figura 7. La tincin con Alcian Blue a pH 2.5 evidencia steres O-sulfatados, cido silico, y grupos carboxilos con cido urnico o glucurnico.

Discusin
La diversidad de los gluco-componentes de la mucosa de las BG sugiere que estas molculas estn involucradas en diversas funciones, como participar en la respuesta inmunolgica y de sealizacin intracelular. Los hallazgos del presente estudio estn de acuerdo con la teora de Baptiste (2001), quien sugiere que las BG participan en la termorregulacin 10 . La gran cantidad de cido silico amerita considerar su papel como micro molcula en la mucosa.

Figura 5. La tincin con PAS a pH 1.0 muestra

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Con base en los resultados obtenidos en el presente estudio se concluye que por la naturaleza de los gluco-componentes observados en la mucosa de las BG es posible que una funcin importante de estas molculas en la superficie de la mucosa de las BG sea protegerla de la deshidratacin a la cual est expuesta continuamente, especialmente durante el ejercicio, debido principalmente a la gran cantidad de cido silico y glicanos sulfatados Adicionalmente, es probable que la presencia de presentes en la mucosa de estos rganos. componentes sulfatados, evidenciada por la fuerte positividad a la tincin con AB a diferentes pH, Es importante estudiar ms detalladamente los ayuden al cido silico a mantener el estado de gluco-componentes de la mucosa de las BG en hidratacin en la mucosa, dado que la afinidad equinos, pues en la medida que se conozca su qumica de estos glicanos por las molculas de composicin bioqumica, se podr entender mejor agua es bien conocida 5 , de tal manera que todos el papel de estas molculas en la superficie de estos componentes encontrados en la mucosa estos rganos, y estudiar las interacciones entre constituyan un posible mecanismo de defensa estas molculas y diversos microorganismos para disipar calor, especialmente durante la patgenos. actividad fsica, cuando aumenta la ventilacin y el movimiento de aire hacia las BG. Agradecimientos Se sabe que por su naturaleza qumica, el cido silico se rodea de molculas de agua en medios solubles, ejerciendo un efecto higroscpico en la mucosa 15,17 , lo cual permite pensar que este componente es esencial para mantener hidratada la superficie de las BG, las cuales estn sometidas a deshidratacin por la entrada continua de aire a las BG. La presencia de estas sustancias en la mucosa, Al personal auxiliar del laboratorio de entonces, podra retardar la desecacin de dicha histopatologa de la Universidad de Camerino-Italia, superficie no slo durante el ejercicio sino tambin y al grupo EQUICES por su valiosa colaboracin. cuando la temperatura corporal aumenta por diversas causas, contribuyendo a los mecanismos Referencias de enfriamiento de aire y evaporacin. De otra parte, se ha descrito que los glicanos de la mucosa de diversos rganos participan en la respuesta inmune 2. Se ha reportado que el cido silico es un receptor importante para microorganismos, en particular, bacterias de la especie Streptococcus tienen una alta afinidad por los glicocomponentes de la mucosa respiratoria 5. En humanos se han realizado estudios sobre la adherencia de Streptococcus pyogenes a los glicosamionoglicanos de la mucosa de las trompas de Eustaquio 13, tambin en suinos se ha descrito la colonizacin temprana de Streptococcus suis a la mucosa del tracto respiratorio, especficamente de la orofaringe mediante adherencia a glicanos 9. 1. Accili D, Menghi G, Gabrielli MG. Lectin histochemistry for in situ profiling of rat colon sialoglycoconjugates. Histol Histopathol. 2008. 23:863-875. 2. Anders K. Meaning and therapeutic potential of microbial recognition of host glycoconjugates. Molecular Microbiology. 1998. 29(1): 1-11. 3. Baptiste KE. A preliminary study on the role of the equine guttural pouches in selective brain cooling. The Veterinary Journal. 1998. 155:115117.

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