METODOS DE ANALISIS DE VITAMINAS

PRESENTADO POR ESPINOSA PEREZ LEYLA MERCADO MONTIELVIVIANA SOFIA

PRESENTADO A ING CARLOS GARCAMOGOLLON

UNIVERSIDAD DE CORDOBA FACULTAD DECIENCIASAGRICOLAS PROGRAMADE INGENIERIA DE ALIMENTOS BERASTEGUI 2010

MTODOS DE ANLISIS DE LAS VITAMINAS Las vitaminas son sustancias orgnicas con actividad biolgica muy elevada que se requieren en pequeas cantidades para el crecimiento y mantenimiento de la salud humana. Como no pueden ser sintetiza en el cuerpo humano en las cantidades requeridas, deben ser suministrados en la dieta. A pesar de las nuevas tendencias en la alimentacin de clasificar vitaminas de acuerdo a su metabolismo y funciones, la clasificacin tradicional, basada en su solubilidad es muy til en la ciencia de los alimentos. En los ltimos 20 aos se ha prestado mucha atencin a la determinacin de vitaminas en los productos alimenticios, debido a sus implicaciones nutricionales y la necesidad de un adecuado control de los productos alimenticios. El anlisis de las vitaminas en alimentos es difcil debido a la alta variabilidad en su

composicin y el gran nmero de componentes, lo cual implica el riesgo de interferencia y un contenido bajo de vitaminas. Otros problemas son la existencia de diferentes compuestos qumicos con efectos sobre las vitaminas y su estabilidad puesto que estas son sensibles a la luz y algunas se oxidan muy rpidamente. Por lo tanto, debe evitarse la luz solar directa y la luz brillante. La iluminacin artificial es mejor proporcionada por tubos fluorescentes dorados. En ciertos casos, las diferentes etapas en el procedimiento deberan realizarse en material de vidrio mbar para prevenir la degradacin. Dado que el calor tambin puede aumentar la velocidad de oxidacin y puede provocar la isomerizacin a formas inactivas, debera evitarse el calor innecesario, adems de estos factores como el oxgeno y condiciones de pH afectan tambin el anlisis de las vitaminas. En el siguiente cuadro se muestran los factores que afectan a cada una de las vitaminas

Vitamina

Oxigeno Oxidantes

Luz

Calor

Alcalinidad

Acidez

A D E K B1 B2 B3 B5 B6 B8 B9 B12 C

++ +++ ++ +

++ + +++ +++

+ +

++ ++

+++ + ++ + + +++ +++ + + + ++ +++

++ + + ++ + +

++

++ +

Tabla 1 sensibilidad de las vitaminas a diversos factores durante los procesos tecnolgicos de la industria alimentara El desarrollo de nuevas tcnicas de anlisis ha llevado en los ltimos aos a mtodos de anlisis que son ms rpidos, precisos y sensibles. Sin embargo a pesar de la diferentes mtodos que existen es muy importante prestar especial atencin al momento de la toma de la muestra pues esta debe ser representativa y homognea, adems se deben mantener las condiciones de estabilidad ptima para cada vitamina lo cual garantiza pocas prdidas durante el procedimiento analtico.

Los mtodos de anlisis de las vitaminas se pueden clasificar en tres grupos

MTODOS FSICO-QUMICOS son los ms comnmente empleados e incluyen las fases de extraccin, purificacin y anlisis final. Todos estos pasos son crticos en la evaluacin de la vitamina. Las operaciones de extraccin pueden incluir varios tratamientos, como el calor, cidos o condiciones alcalinas, las enzimas, y los solventes, estos y estos tratamientos tienen varios propsitos, tales como la estabilizacin de la vitamina y su liberacin de otros componentes alimenticios. La determinacin y cuantificacin final puede ser realizada principalmente por cromatografa.

MTODOS MICROBIOLGICOS Se basan en cultivos de cepas cuyo desarrollo depende especficamente de una determinada vitaminas usan bsicamente en vitaminas hidrosolubles. El medio de cultivo donde se realiza la siembre carece de la vitamina en cuestin y esta es aportada por extractos del alimento donde se quiere evaluar la presencia de la vitamina. Paralelamente se realiza un control donde sembramos el microorganismo sin vitaminas y tambin se siembra el microorganismo en diferentes medios con contenido vitamnico diverso y se mide la turbidez y otros parmetros tales como la gravimetra, la produccin de cido, o la produccin de gas en general para evaluar el crecimiento. Se utiliza microorganismos de prueba, tales como bacterias, protozoos, hongos. Estos ensayos microbiolgicos tienen la ventaja de especificidad y sensibilidad, pero son muy lentos si se compara con los mtodos fisicoqumicos y el protocolo de anlisis debe ser seguido estrictamente debido a la variabilidad en las tcnicas microbiolgicas.

MTODOS BIOLGICOS Utilizan animales de laboratorio. Un grupo de control se alimenta con una dieta carente de la vitamina estudiado y un segundo grupo se alimenta con la comida en el que la vitamina se est evaluando, o un extracto de los alimentos. El contenido de vitaminas es medido por la supervisin de un efecto fisiolgico relacionado con la ingesta de la vitamina.. Los problemas ticos relacionados con la experimentacin con animales y la variabilidad de estos estudios de limita el uso de mtodos biolgicos para los casos donde no hay otro mtodo con resultados satisfactorios.

VITAMINAS HIDROSLUBLES Comprenden varias vitaminas de grupo B y la vitamina C VITAMINAS B Este grupo comprende varias vitaminas de estructura distinta que se agruparon en un principio debido a que eran hidrosolubles. El sistema inicial de medicin de estas vitaminas, algunas de las cuales estn presentes en concentraciones muy bajas, consista en mtodos microbiolgicos selectivos (Bell, 1974; Ball, 1994), y para algunas vitaminas, los folatos totales y la vitamina B12 los ensayos microbiolgicos siguen siendo los nicos mtodos practicables. Para el resto de las vitaminas B se han puesto a punto y ensayados procedimientos qumicos ms especficos, especialmente la HPLC.

TIAMINA La tiamina o vitamina B1 es sensible al calor y a las condiciones alcalinas y hay que tomar las precauciones apropiadas durante su anlisis. La tiamina se puede medir microbiolgicamente utilizando Lactobacillus viridescens o L. fermentum, pero la mayor parte de los anlisis se basan en su oxidacin a tiocromo, que se puede medir directamente por fluorimetria. La mejor manera de hacer esto es conjuntamente con la separacin mediante HPLC de las sustancias que interfieren. La tiamina, la riboflavina y la vitamina B6 estn presentes en los alimentos como cofactores enzimticos combinados con fosfatos, por lo que se deben hidrolizar y tratar con fosfatasa antes del anlisis. La muestra de alimento se hidroliza con cido y luego se trata con takadiastasa o con una fosfatasa. Algunos autores utilizan una precolumna de intercambio inico (Bognar, 1981).Luego se oxida el extracto con ferricianato potsico para formar el tiocromo; a continuacin se analiza este utilizando una columna de HPLC de fase inversa y se mide el tiocromo por fluorimetria. Los anlisis se controlan utilizando un estndar externo. Tambin se puede utilizar una oxidacin postcolumna.

RIBOFLAVINA La riboflavina o vitamina B2 est presente en los alimentos como riboflavina libre oriboflavin-5fosfato (flavina mononucleotico, FMN) o como flavina adenina dinucleotido (FAD).la vitamina es muy sensible a la luz y a la radiacin UV, pero relativamente estable al calor y al oxigeno atmosfrico. Por consiguiente, las operaciones analticas deben llevarse a cabo en condiciones que reduzcan al mnimo la exposicin a la luz. La vitamina se debe extraer de los alimentos mediante tratamiento con cidoy una enzima fosfatasa apropiada. La riboflavina puede medirse directamente utilizando mtodos fluorimetricos, aunque muchos alimentos contienen sustancias que interfieren y para su separacin se prefiere el sistema HPLC (Wimalasiri y Will, 1985; Schuep ySteiner, 1988; Arella et al., 1996).el mtodoms utilizado es la separacin mediante HPLC de fase inversa que utiliza la deteccin por fluorescencia.

NIACINA La actividad de la niacina se debe al acido nicotnico y la nicotinamida. Ambas formas sonestables al oxigeno atmosfrico, la luz y el calor en estado seco y en solucin acuosa. La niacina puede medirse microbiolgicamente con Lactobacillusplantarum(mtodos n 960.46, 944.13 y 985.34 de la AOAC [Sullivan y Carpenter,1993]).Tambin se han utilizado mtodos colorimtricos basados en la reaccin de Konig, utilizando la oxidacin con bromuro de ciangeno y la reaccin con p-amino-benzoil-dietilaminoetanol (mtodos n 961.14, 981.16 y 975.41 de la AOAC [Sullivan y Carpenter,1993]), pero el carcter toxico del bromuro de ciangeno hace que sea difcil utilizar estos mtodos para su uso ordinario.

Se ha propuesto un mtodo de HPLC que parece funcionar razonablemente bien (Finglas y Faulks, 1987).Tras una hidrlisis acida, la muestra de alimento se filtra, se trata con un lcali, se pasa por el autoclave y se microfiltra antes de aplicar HPLC de fase inversa y la deteccin por fluorescencia.

VITAMINA B6 Hay cinco sustancias que muestran actividad de vitamina B6 (la piridoxamina, la piridoxina, el piridoxal y los esteres fosfatados correspondientes), por consiguiente , la actividad de la vitamina B6 no se puede medir por medio de un mtodo para una sola sustancia. El ensayo microbiolgico utilizando Saccharomyces carlsbergensis da una medida de la actividad total (mtodos n 960.46, 961.15 y 985.32 de la AOAC [Sullivan y Carpenter, 1993]). El ensayo se lleva acabo despus de una hidrlisis acida y una hidrlisis enzimtica de los fosfatos, pudindose utilizar los mismo procedimientos de extraccin que para la tiamina y riboflavina (van den Berg et al., 1996;Ndaw et al., 2000).la hidrlisis acida tambin hidroliza los glcidos, que estn presentes en los alimentos vegetales y que pueden estar biodisponibles o no para las personas.

VITAMINA B12 Hay un grupo de estructuras complejas con actividad de vitamina de vitamina B12.El sistema clsico de medicin ha sido el microbiolgico con Lactobacillus leichmanii. Los niveles de vitamina en los alimentos son muy bajos y se extrae conagua caliente o un tampn en presencia de cianuro potsico, que convierte la vitamina en la forma ciano- (mtodos n 960.46, 952.20 y 986.23 de la AOAC [Sullivan y Carpenter, 1993])

FOLATOS Los folatos comprenden un grupo de sustancias relacionadas con el cido flico (cido pteroilglutamico). El cido flico no est presente en forma natural en los alimentos, pero se utiliza en gran medida en su enriquecimiento o como complemento. La mayor parte de los folatos presentes en la naturaleza son derivados de los cidos 5,6,7-tetrahidrofolicos y existen en la forma de monoglutamato y poliglutamanto. La actividad biolgica delas diversas formas difiere, por lo que el procedimiento nutricional analtico debera incluir la medicin de los distintos vitameros. La mejor manera de medir los valores de los folatos totales es mediante ensayo microbiolgico utilizando Lactobacillus rhamnosis. La mayor parte de los organismos no pueden utilizar las formas de poliglutamato, siendo una etapa preliminar en el anlisis la desconjugacion con una enzima apropiada (de rin de cerdo, pncreas de pollo, plasma humano).la extraccin se realiza en presencia de cido ascrbico para reducir al mnimo la oxidacin. El extracto se trata con

una combinacin de proteasa, lipasa y enzimas amiloliticas, que mejoran la eficacia de la extraccin. Otra mtodo muy extendido es la separacin delos distintos vitmeros de los folatos mediante tcnicas de HPLC (Fingas et al., 1999).

ACIDO PANTOTENICO El cido patotnico en su forma libre es inestable y extraordinariamente higroscpico. Suele estar presente unido a protenas o en forma de sales. La nica forma activa es la dextro-.El mtodo clsico es el microbiolgico utilizando Lactobacillus plantarumcomo microorganismo de prueba (Bell, 1974; mtodos n 960.46 y 945.74 de la AOAC [Sullivan y Carpenter, 1993]).El alimento se extrae con agua y cuando es rico en grasa conviene eliminarlas antes del anlisis. El extracto acuoso se suele pasar por el autoclave y se ajusta el pH con cido y lcali alrededor de 6.8.la mezcla se incuba durante una noche y luego se somete a tratamiento trmico para detener el crecimiento, que se mide mediante turbimetra.

BIOTINA La biotina est presente en los alimentos como vitamina libre y unida a protenas. El mtodo clsico es el microbiolgico utilizando Lactobacillus plantarum (Bell, 1974; mtodo n960.46 de la AOAC [Sullivan y Carpenter, 1993]). Tambin sea descrito un mtodo de HPLC (Lahely et al., 1999).Para obtener la vitamina del alimento es necesaria una extraccin preliminar con cido seguida de tratamiento con papana. En el mtodo de HPLC se utiliza la separacin de fase inversa, la derivacin postcolumna con avidina-5-isocianato de fluorescena y la deteccin mediante fluorescencia. Tambin se ha descrito radioensayos utilizando la protena de unin especifica (Bares, 2000).

VITAMINA C Hay dos sustancias que muestran actividad de vitamina C: el cido ascrbico y el primer producto de su oxidacin el cido L-dehidroascorbico.El ismero D (cido eritrbico) que se utiliza como aditivo alimentario antioxidante, no es activo. El cido ascrbico es un potente reductor que se oxida con mucha rapidez, especialmente a temperaturas elevadas y en soluciones alcalinas. Durante la preparacin de muestras de alimentos para el anlisis es especialmente importante reducir al mnimo las perdidas debido a la oxidacin (Brubacher, Mller Mulot y Southgate,1985).

EXTRACCION DE VITAMINA C Es necesario adoptar numerosas precauciones para no modificar el contenido vitamnico de la muestra, especialmente la proporcin entre las formas oxidada y reducida.el cido fosforito a una concentracin del 3 al 5% es el reactivo ms apropiado para la extraccin.la muestra en suspensin en el reactivo y con adicin de EDTA, se homogeniza en la oscuridad y en atmsfera inerte. Inmediatamente se centrifuga y se procede inmediatamente a la determinacin para evitar riesgos de oxidacin.con esta metodologa es posible cuantificar la vitamina oxidada y la reducida. Segn el objetivo del anlisis, ase puede convertir la totalidad de vitamina C en forma reducida o en forma oxidada durante la extraccin .en el primer caso, el medio de extraccin se enriquece en un reductor (cisterna, ditioeritrol u otros), y en el segundo, se utiliza una enzima especfico (ascorbato oxidasa) o un oxidante qumico.

Dentro de los mtodos para la determinacin de vitamina C encontramos:

TITULACIN CON COLORANTE (AOAC 1984)

Fundamento Reduccin del colorante 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP) con cido ascrbico en una solucin cida.

Reactivos Acido oxlico al 0.4% p/v Colorante indofenol al 0.4%.pesar 0.2 g de sodio,2.6 g de diclorofenol indofenol. Disolver en 200 cm3 de agua, filtrar si es necesario, recibiendo el filtrado en un matraz de 500 cm3.completar el volumen y almacenar en refrigeracin.

Estandarizacin del colorante. Los miligramos de acido ascrbico correspondientes a 1 cm3 d colorante se determinan as: Pesar exactamente 2 a 3 gramos de yoduro de potasio en 5 cm3 de agua en un erlenmeyer de 50 cm3.aadir una alcuota de 15 cm3 de solucin de colorante y 10 cm3 HCL 1 Mezclar y dejar en reposo por dos minutos. Titular con solucin de tiosulfato de sodio 0.01 N recientemente preparada.utilizando una microbureta y aadiendo 1 o 2 cm3 de solucin indicadora de almidn. Completar la titulacin antes de 1 minuto. El colorante debe estandarizarse cada 48 horas y solo es estable por 2 semanas, guardado en refrigerador

Procedimiento Tomar una alcuota de 10 cm3 para jugos ricos en vitamina C o de 25 cm3 para jugos pobres en esta vitamina, en un matraz volumtrico de 100 cm3. Completar el volumen con la solucin de cido oxlico. Agitar y filtrar si es necesario. Tomar una alcuota de 5 a 10 cm3 para la titulacion, dependiendo del contenido de cido ascrbico, en un erlenmeyer de 50 cm3.diluir con 15 cm3 de la solucin de cido oxlico y titular con la solucin de colorante hasta que el color rosado permanezca de 5 a 10 segundos. La titulacion debe completarse antes de 1 minuto y debe utilizarse una microbureta, pues el volumen de colorante utilizado no debe ser mayor de 1.5 cm3.

Clculos El peso equivalente de del cido ascrbico en esta reaccin es 88 1 cm3 colorante = (cm3 tiosulfato*N*Eq. cido ascrbico) / (volumen muestra cm3) = mg de cido ascrbico Calcular el contenido de cido ascrbico en mg por 100 cm3 de jugo

METODO FLUORIMETRICO (AOAC)

Fundamento El mtodo consiste en la oxidacin de cido ascrbico en cido dehidroascrbico con carbn activo, seguido por la reaccin de cido dehidroascrbico con 1,2-fenilendiamina dihidrocloruro (OPDA) para formar el derivado fluorescente quinoxalina 3 - (1,2-dihidroxietil) Furol [3,4-b] quinoxalina-1-ona (DFQ)

El

mtodo

fluorimtrico se adopt

para

la

determinacin accin final

de por

vitamina la

en en

vitamina 1968.

preparaciones

como

AOAC

El mtodo muestra un alto grado de especificidad. Algunos autores han afirmado que una sustancia slo puede interferir en el ensayo si cumple con las siguientes

condiciones: la sustancia debe tener grupos diceto-, que reaccionan con OPDA en las condiciones del ensayo la excitacin y longitudes de onda de emisin de la derivada quinoxalina debe ser dentro de las regiones prescrito para el ensayo debe contener adyacentes cis grupos hidroxilo, que reaccionan con la solucin de cido brico para formar un complejos. Adems, la sustancia debe estar presente en la muestra solucin de ensayo en cantidad suficiente para tener un efecto. De un gran nmero de la posibilidad de interferir las sustancias probadas, no compuesto aislado se encontr que cumpla todos los criterios anteriores. El procedimiento fue por lo tanto considerado apto para muestras que contienen grandes cantidades de la reduccin de las sustancias. Una ventaja adicional es la capacidad del mtodo para hacer frente a materiales muy coloreadas.

ESPECTROFOTOMETRIA DIRECTA

La aplicacin de la espectrofotometra directa a la determinacin de vitaminas solubles en agua en los extractos de alimentos est sujeta a interferencias espectrales de muchas sustancias. El alcance de la interferencia depende de la intensidad de la absorcin de la vitamina en relacin con las absorbancias de sustancias que acompaan a las longitudes de onda seleccionada. La espectrofotometra directa no ha encontrado aplicacin rutinaria generalizada en la determinacin de las vitaminas solubles en agua en los alimentos, debido a la rigurosa preparacin de la muestra que se requiere para obtener una solucin suficientemente pura para

el anlisis. Adems, para algunas vitaminas, el sensibilidad y selectividad.

ensayo fluoromtricos ofrece

mayor

La espectrofotometra directa se ha aplicado a la determinacin de cido ascrbico en los refrescos, los zumos de frutas, jarabes y despus de la correccin de absorcin del fondo, en la regin UV. La Correccin de fondo se hizo mediante la medicin de la absorbancia de la solucin de la muestra antes y despus de la oxidacin cataltica de cido ascrbico con cobre (II) sulfato, y a continuacin, se calcul la concentracin de cido ascrbico de la diferencia. El blanco de la muestra fue preparada por la adicin de cobre (II) sulfato a una alcuota de la muestra diluida y calentamiento a 508C durante 15 minutos. El calentamiento era necesario para superar el efecto inhibidor de citrato en la la oxidacin del cobre-catalizada. Para corregir la absorcin por Cu (II), fue agregado despus de la oxidacin cido etilendiaminotetraactico (EDTA). Las muestras y soluciones estndar fueron preparadas para contener la misma concentracin de Cu (II) del complejo EDTA, que no catalizar la oxidacin del cido ascrbico en la temperatura ambiente. La absorcin por el Cu (II)-EDTA complejo formaba parte del blanco de reactivo contra la que las soluciones estndar de cido ascrbico se leyeron. Absorbancia las mediciones se realizaron a 267 nm y con un pH 6. La curva de calibracin fue lineal en el rango de 00-20 mg de cido ascrbico / ml. La precisin fue 0,1-0,5% para el cido ascrbico en el rango de concentracin de 5-13 g / ml..

VITAMINAS LIPOSOLUBLES

Son las vitaminas A, D, E y K y los carotenoides con actividad de provitamina A; debido a que el inters nutricional tambin se concentra ahora en los carotenoides no provitamina A.

VITAMINA A: El termino vitamina A es genrico e incluye el retinol, sus esteres y algunos ismeros. Se encuentra principalmente en productos animales tales como leche, crema, mantequilla, queso, huevos, carne, hgado, rin y aceite de hgado de bacalao. Los procedimientos ms antiguos se basan en la reaccin colorimtrica de Carr Price de separacin en columnas de intercambio inico. Esta reaccin esta muy expuesta a

interferencias y el mtodo preferido ahora es la separacin mediante HPLC con medicin espectrofotomtrica. La vitamina A es muy sensible a la luz, el oxgeno y los cidos por tanto, deben almacenarse en frascos mbar sellados con gas inerte; y todas las porciones analticas deben prepararse con luz difusa, preferiblemente amarilla. Las muestras de alimentos se saponifican en hidrxido de potasio alcohlico con la adicin de un

antioxidante, cido ascrbico, butilhidroxidotolueno (BHT) o pirogalol. Las vitaminas se extraen con un disolvente orgnico adecuado. El extracto se evapora con mas BHT a temperatura controlada. Para la separacin se puede usar la HPLC tanto en fase normal como en fase inversa. Las operaciones en fase normal la medicin se suele hacer fluorescencia; en las separaciones en fase inversa es preferible la detencin y medicin UV. Durante todo el proceso de preparacin y anlisis de muestra deben cumplirse las normas y hay que controlar peridicamente la pureza (brubacher, muller mulot y southgate, 1985). El inters nutricional se concentraba al principio en los carotenoides que mostraban actividad de provitamina A, es decir, que en el organismo se convertan en vitamina A. son el -caroteno, el - caroteno, el -caroteno, y la -criptoxantina (figura).

Durante los aos noventa se reconoci que haba otros muchos carotenos con actividad biolgicas como antioxidantes, por lo que el presente examen se ocupa de los mtodos que permiten la medicin de una gama ms amplia de carotenoides. Hay alrededor de 600

ismeros de carotenoides (Bauernefeind, 1972) pero muchos de ellos tienen una presencia limitada o aparecen en cantidades pequeas en los alimentos mas comunes. Sigue siendo objeto de debate la manera de presentar los distintos carotenos y su actividad relativa en las bases de datos. El mtodo clsico consista en realizar una separacin cromatografa sencilla de los carotenos como grupo y medirlos mediantes espectrofotometra frente un patrn de caroteno comn(brubacher, muller-mulot y southgate, 1985). Este sistema se ha sustituido por una separacin mas detallada utilizando columnas de intercambio ionico y HPLC. Las condiciones aplicadas en la saponificacin son desicivas y tienen que estar cuidadosamente controlada, utilizando mezclas estndar. Si se hace esto, se pueden obtener valores comparables(mangels et al., 1993) consufisiente confianza para crear una base de datos de los carotenoides provitaminicos (chug-ahuja et al.,1993). La HPLC es ahora el mtodo ms utilizado y preferido. Escott(1992) y sus colegas (escott y hart, 1993; y escott et al.,1996), como parte de un proyecto de la Unin Europea cuyo objetivo era obtener una mezcla de MRN de corotenoides, llevaron acabo una amplia serie de estudios sobre las diversas etapas de extraccin por saponificacin y los anlisis mediante HPLC. Otros anlisis tambin han realizados estudios de tallados del mtodo (wills y Rangaa,1996; Taungbodhitham et al., 1998). Estos estudios constituyen la base para obtener valores analticos validos de los carotenoides mas importantes. Se ha propuesto un sistema revisado de evaluacin de los valores publicados para los carotenos teniendo en cuenta estos estudios y en la actualidad se esta evaluando la preparacin de cdigos de calidad.

VITAMINA D: La vitamina D de efecto antirraqutico se encuentra en diversas forma: la vitamina D2, ergocalciferol, previamente conocida como calciferol: se encuentra en pequeas cantidades en los aceites de hgado de pescado y algunas esponjas . la vitamina D3, colecalciferol: est ms ampliamente distribuida en la naturaleza: se encuentra en los aceites de hgado de pescado, y en cantidades ms pequeas en pescados tales como arenque, caballa, salmones y sardinas, en huevos, mantequilla y queso crema.

Las estimaciones de la actividad relativa de colecalciferol, ergocalciferol. Y sus metabolitos presentan variaciones. Lo convenido parece ser atribuir al 25-

hidroxicolecalciferol un factor de cinco veces la actividad de colecalciferol (chan et al., 1995, 1996). Por consiguiente los valores para las distintas formas se deben presentar siempre por separados en los informes analticos y las bases de datos de referencia. La vitamina D esta presente en lo alimentos en concentraciones muy bajas, por lo que su anlisis resulta difcil. Los mtodos originales eran mtodos biolgicos en los que se utilizaban pollo o as jvenes (por ejemplo, el mtodo n. 936.14 [AOAC internacional 1995]. Estos mtodos difcil de aplicar y en general su precisin era escasa. El principal problema con el anlisis de vitamina D que casi que todas las fuentes de alimentos contienen otros lpidos que tienden a interferir (BALL 1998). Koshy (1992) examino la cromatografa de gases (GC), pero la tcnica preferida ahora es la HPLC y se han publicados varios mtodos (colecalciferol y 25 hidroxicolecalciferol en la yema de huevo [mattila et al., 1993], ergocalciferol 25 hidroxiergocalciferol en hongos comestible [mattila et al., 1994] y colecalciferol, ergocalciferol y sus metabolitos 25hidroxi en la leche y en las carnes[mattila et al.,1995]). En las tablas de composicin de alimento del reino unido de gran Bretaa e Irlanda del norte se utilizaron mtodos anlogo (no publicados) para las carnes (chan et al., 1995, 1996) (V. grace, UK food standards agency, comunicacin personal). El mtodo mas til disponible consta de una etapa semipreparativa preliminar de la HPLC que elimina gran parte de las interferencias de otros lpidos. La muestra de alimento se saponifica en hidrxido de potasio alcoholico en atmosfera de nitrgeno con la adicion de un antioxidante, cido ascrbico, hidro quinona, pirogalol o BHT antes de la solucin de saponificacin. Los lpidos no saponificacin se extraen con un disolvente organico apropiado. Se utiliza en estndar interno de la forma de la vitamina D no presente en la muestra los lpidos no saponificados se concentran mediante evaporacin rotatoria a baja temperatura. El extracto se disuelve en la fase mvil de la HPLC, semipreparativa. Las condiciones se controlan cuidadosamente para conseguir recoger compresicion la vitamina D. la separacin analtica puede llevarse a cabo mediante HPLC de fase normal o inversa con deteccin. UV se recomienda la fase inversa para la separacin analtica des pues de la fase normal para la etapa semipreparativa. El 25-hidroxicolecalciferol puede medirse por medio de la HPLC, como se a mencionado ms arriba (MAFF 1995), pero en el momento presente probablemente el

mejor sistema sea el radioinmunoensayo, cuando se disponga de los fondos y el equipo necesarios (bates 200). Vitamina E. la actividad de la vitamina E se manifiesta de manera natural en ocho sustancia cuya estructura se basa en los tocoferoles y los tocotrienoles (vase en la figura).

Cada vitamero tiene una actividad vitamnica diferente en comparacin con el tocoferol que se considera la estructura primaria. Por con siguiente el mtodo analtico preferido es el que separa y mide todos los distintos vitameros. Las muestra de alimentos se saponifican utilizando hidrxido de potasio alcohlico. Los vitameros de la vitamina E son susceptibles ala oxidacin a temperaturas mas elevadas en

condiciones alcalinas y deben protegerse realizando la saponificacin en atmosfera de nitrgeno con la adicin de antioxidantes las condiciones de saponificacin son semejantes a las utilizadas a la vitamina A Y D. Tambin existe un mtodo colorimtrico la reaccin de emmerie engel con la reduccin de cloruro frrico y la reaccin con , - dipiridina o 4,7-difenantrolina. Los complejos

son bastante inestables y dan un valor total de tocoferol. El mtodo colorimtrico fue sustituido en primer lugar por la GLC y luego por la HPLC, que es ahora el mtodo preferido. Puede utilizarse la HPLC tanto de fase normal como inversa, aunque la primera es un mejor sistema y separa a todos los vitameros, para la deteccin se aplica fluorescencia (piironen et al., 1984, 1987). Se utlizan patrones externos, es necesario someter a una verificacin espectrofotomtrica.

VITAMINA K: tiene efecto antihemorrgico, que tiene un rol importante en regular la coagulacin sangunea. La vitamina Est presente en plantas verdes, vegetales verdes (repollo, espinaca), papas, frutas (tomates, frutillas), escaramujos y tambin en aceites de hgado. Poseen actividad de vitamina k la filoquinona (K1) las menaquinonas (grupo K2) y la menadiona (K3 sintetica). La vitamina K es sensible a los lcalis y a la radiacin de UV y es preciso tomar la precauciones apropiadas durante las operaciones analticas. Hay procedimientos analticos colorimtrico, pero carecen de especificidad y han sido sustituidos, dando preferencia a otros mtodos. La mayor atencin analtica se ha concentrado en la medicin de vitamina K1. Un problema importante en el anlisis es la presencia de lpidos, que hay que eliminar mediante digestin con lipasas antes de la extraccin con hexano (Indyk y woollard). El disolvente se evapora bajo una corriente de nitrgeno y el residuo se disuelve en metanol, que se aplica a una columna de HPLC de fase inversa. El eulato se reduce con cinc despus de la columna de HPLC y luego se mide la fluorescencia. Se han utilizado separaciones semipreparativas despus de la digestin (Cook et al., 1999) y tambin se han propuesto sistemas de deteccin dual de electrodos (Piironen y Koivu, 2000).la mayora de los autores sealan la gran variabiabilidad de los resultados

obtenidos e insisten en la necesidad de un muestreo repetido apropiado y de replicacin de los anlisis (Piironen et al., 1997; Jakob y Elmadfa, 1996).

MTODOS DE ANLISIS DE VITAMINAS LIPOSOLUBLES VITAMINAS MTODO CROMATOGRAFA VITAMINA A Y CAROTENOIDES HPLC COSTO DE CAPITAL Escasa recuperacin de Bajos retinoles sobreestimacin; de los carotenoides. Identificacin de los De medios a carotenoides. altos. LIMITACIONES ALGUNAS REFERENCIAS AOAC, 1984; CARR Y PRICE, 1926. SCOTT, 1992; SCOTT HART, 1993; SCOTT et al., 1996; wills y rangga,1996; taungbodhitham et al., 1998 Kodicek y lawson, 1967; AOAC international, 1995 Nield Russell y zimmerli, 1940; eisses y de vries, 1969 Bell Christie, 1974; koshy, 1982 Mattiala et al., 1993, 1994, 1995; MAFF, 1997.

BIOENSAYO

COLORIMETRIA

Solo para niveles bajos; se De bajos a requieren instalaciones de medios. animales. Falta de precisin y Bajos. sensibilidad Medios.

VITAMINA D

GC HPLC

VITAMINAE

Interferencia de lpidos; Altos. dos fases (preparatoria seguida de separacin analtica) necesarias para la mayora de los alimentos. RADIOINMUNOENSAYO Altos. COLORIMETRIA Interferencia de sustancias Bajos. compuestas. GC De medios a altos. HPLC Tcnicas de extraccin. Altos. COLORIMETRIA Falta de especificidad. Bajos.

VITAMINA K

CROMATOGRAFA DE COLUMNA GC

Bajos. De medios a altos. Interferencia de lpidos. Altos.

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HPLC

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