Lima 1 de Agosto, 2013

Sres. ECOANDES S.A.C. Presente.Por medio de la presente les envio los resultados del Anlisis Molecular de 24 Ecotipos de Organo, realizados en nuestro Laboratorio de Biologa Molecular del Instituto de Biotecnologa (IBT). Cordialmente,

Ral Blas Sevillano Instituto de biotecnologa, UNALM Departamento de Fitotecnia

ANLISIS MOLECULAR DE 24 ECOTIPOS DE OREGANO

1. OBJETIVOS:

Determinar el perfil de amplificaciones y diferenciar veinticuatro ecotipos de organo, mediante la tcnica de marcadores moleculares (AFLP).

2. MATERIALES Y MTODOS: 2.1 Material gentico Se utilizaron de 24 ecotipos de organo enviados por la empresa ECOANDES S.A.C. En la Tabla 1, se muestra el orden y la denominacin de los individuos.

Tabla 1. Material gentico utilizado en la caracterizacin .

ORDEN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 INDIVIDUOS TICACO - NIGRA "A" TICACO - NIGRA "B" TICACO - MEJORADA "C" TARATA - COCOTEA TARATA - MEJORADA TARATA - NIGRA OREJA DE ELEFANTE TEMPRANA F2 MEJORANA CHINITO OREGANO COMUN TUTUPACA TEMPRANA ITALIANO NIGRA - LADERA VILALACA NIGRA - BOROGUEA COMUN (N) SECROR TOMA - BOROGUEA CHINITO - SECTOR TOMA - BOROGUEA OREJA ELEFANTE - CORAGUAYA CHINITO - CORAGUAYA MEJORANA - CORAGUAYA NIGRA - CORAGUAYA ZAMBITO TALLO MORADO ZAMBITO TALLO BLANCO

2.2 Extraccin de ADN La extraccin de ADN fue a partir de hojas frescas. Se realiz mediante la tcnica de CTAB 2% desarrollada con la metodologa de Doyle and Doyle (1990). La

cuantificacin y calidad del ADN extrado se realiz en un gel de agarosa al 1% comparando las muestras obtenidas con un marcador de peso molecular conocido como fago lambda digerido con la enzima PstI (Figura1).

Figura 1. Calidad de ADN extrado de los 24 individuos de organo. (M: Peso Molecular)

2.3 Anlisis AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Para la caracterizacin molecular de estos individuos se utiliz la tcnica de AFLP, realizndose segn el manual de protocolos de Biologa Molecular del Instituto de Biotecnologa (IBT), adaptado del mtodo desarrollado por Vos et al. (1995). Previo a la caracterizacin molecular, se realiz la seleccin de las 7 mejores combinaciones de iniciadores AFLP (Tabla 2), con las cuales se realiz la caracterizacin de los 24 ecotipos de organo.

Tabla 2. Pares de iniciadores (Primer) seleccionados para realizar la caracterizacin del Organo.

Nombre
E38M41 E38M61 E45M41 E13M49 E13M59 E41M49 E45M40

PRIMER -ECO

PRIMER-MSE

5 GAC TGC GTA CCA ATT C ACT 3 5 GAT GAG TCC TGA GTA A AGG 3 5 GAC TGC GTA CCA ATT C ACT 3 5 GAT GAG TCC TGA GTA A CTG 3 5 GAC TGC GTA CCA ATT C ATG 3 5 GAT GAG TCC TGA GTA A AGG 3 5 GAC TGC GTA CCA ATT C AG 5 GAC TGC GTA CCA ATT C AG 3 5 GAT GAG TCC TGA GTA A CAG 3 3 5 GAT GAG TCC TGA GTA A| CTA 3

5 GAC TGC GTA CCA ATT C AGG 3 5 GAT GAG TCC TGA GTA A CAG 3 5 GAC TGC GTA CCA ATT C ATG 3 5 GAT GAG TCC TGA GTA A AGC 3

3. RESULTADOS En las figuras 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 se muestran los perfiles de las amplificaciones de los 24 ecotipos de organo en estudio, con cada uno de las combinaciones de los

iniciadores seleccionados. Con las 7 combinaciones analizadas, se han registrado 50 marcadores que representan el 18% de un total 277 bandas amplificadas de ADN. Sin embargo, ninguno de los marcadores fue asociado exclusivamente a un grupo de ecotipos de nombre similar o nombre de zona en comn. Figura 2. Perfil de amplificacin de 24 individuos de Organo con la combinacin de iniciadores E41 M49

Figura 3. Perfil de amplificacin de 24 ecotipos de Organo con la combinacin de iniciadores E13/M49.

Figura 4. Perfil de amplificacin de 24 ecotipos de Organo con la combinacin de Iniciadores E45/40

Figura 5. Perfil de amplificacin de 24 ecotipos de Organo con la combinacin de iniciadores E45/M41

45/41

1 2

3 4

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Figura 6. Perfil de amplificacin de 24 ecotipos de Organo con la combinacin de

38/41

1 2

4 5

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

38/61

iniciadores E38/M61

Figura 7. Perfil de amplificacin de 24 ecotipos de Oregano con la combinacin de iniciadores E38/M41.

Figura 8. Perfil de amplificacin de 24 ecotipos de Organo con la combinacin de iniciadores E13/M59.

13/59

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

El anlisis de agrupamiento se realizado con 23 ecotipos (no se consider a la muestra de cdigo 20- CHINITO-CORAGUAYA por que no se puede definir bien sus bandas en tres perfiles de amplificacin), segn los 50 marcadores AFLP evaluados forman tres grupos a

un coeficiente de similitud de 0.8. En el primer grupo forman los ecotipos 9 y 21. En el segundo grupo formado por ecotipos 4,18, 23 y 24. El tercer grupo est formado por el resto de ecotipos, en este grupo se observa 4 sub-grupos a un coef. de similirud de 0.9. El primer sub-grupo agrupa los ecotipos 1, 5,13,14,16,6,17 y 8. El segundo subgrupo formado por los ecotipos 2, 12, 11 y15. El tercer sub-grupo formado por los ecotipos 3,10, 22 y19. Finalmente el cuarto sub-grupo formado por el ecotipo 7.
1-TICACO-NIGRA"A 5-TARATA-MEJORAD 13-TEMPRANA 14-ITALIANO 16-NIGRA-BOROGUE 6-TARATA-NIGRA 17-COMUN(N)SECRO 8-TEMPRANAF2 2-TICACO-NIGRA"B 12-TUTUPACA 11-OREGANOCOMUN 1-TICACO-NIGRA"AMW 15-NIGRA-LADERAV 3-TICACO-MEJORAD 10-CHINITO 22-NIGRA-CORAGUA 19-OREJAELEFANTE 7-OREJADEELEFANT 4-TARATA-COCOTEA 18-CHINITO-SECTO 23-ZAMBITOTALLOM 24-ZAMBITOTALLOB 9-MEJORANA 21-MEJORANA-CORA
0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00

Coefficient

Figura 8. Dendograma que agrupa los 23 ecotipos de Oregano.

En general se observa segn los marcadores analizados baja variabilidad entre los ecotipos de organo analizados por presentar solo el 18% de marcadores polimrficos. La diferenciacin entre diferentes ecotipos no fue posible con este grupo de marcadores

utilizados, ya que no se ha asociado marcadores exclusivos a cada uno de los ecotipos estudiados. Sin embargo, existen grupos de ecotipos muy similares, tal como se indica en los sub-grupos. Por otro lado, no hay alta similitud entre ecotipos que tienen el mismo nombre comn, a pesar de que la propagacin es vegetativa, esto probablemente corresponde a clones de diferente origen. Sin embargo, con algunos ecotipos del mismo nombre hay una similitud muy cercana como de los MEJORANA y de SAMBITO, aunque algunos clones de estos ecotipos se asocian con otros ecotipos. Estos resultados deben ser complementados con las observaciones morfolgicas de los ecotipos para una mejor valoracin en la diferenciacin de los ecotipos.

4. CONCLUSIN Los ecotipos estudiados presentan variacin dentro de ellas y entre ellas, aunque no se muestra una alta variabilidad. Adems, no se ha asociado marcadores especficos para diferenciar los distintos ecotipos existentes.