CARACTERIZACIN DE LAS COMUNIDADES DE LEVADURAS DEL MEZCAL DE TAMAULIPAS EMPLEANDO LAS

SECUENCIAS DE LOS ESPACIADORES DEL rDNA Cuauhtmoc Jacques H.1, Asnett I. Lpez H. L. 1, Carmina L. Anaya G. 1, Ana Mara Sifuentes R.1, Patricia Taillandier 2, Felipe Ramn P.2 (1) IPN Centro de Biotecnologa Genmica. Reynosa, Tamps. Tel. 52-899-9243627. aguilaquecae@yahoo.com (2) INPT-ENSIACET, Toulouse, Fr. Palabras clave: Mezcal, Levaduras, Secuenciacin Introduccin. El crecimiento del sector del mercado conquistado por el mezcal se ha incrementado sustancialmente en los recientes aos. Un factor importante para lo anterior es que la percepcin de los consumidores sobre la calidad ha tomado otros matices al contar la denominacin de origen (DO). La estandarizacin de la calidad en productos con DO es de suma importancia y para esto la informacin tcnico-cientfica sobre la materia prima y las etapas de fabricacin es elemental. La fermentacin es una etapa que en el mezcal de Tamps. aun se realiza con la microbiota nativa. Identificar las especies de levadura es un paso obligado para entender la dinmica de la fermentacin y la su influencia sobre la calidad, ya hay especies que tienen un impacto perjudicial o benfico el rendimiento y/o el sabor. Ya se han identificado las especies que participan en fermentaciones naturales de tequila (4) y ms reciente en mezcal (2). En este trabajo se muestran los resultados de identificacin de las levaduras de los mostos de mezcal de cuatro fbricas de Tamps., empleando pruebas bioqumicas y las secuencias de los espaciadores intergnicos transcritos y el gen 5.8S (ITS1-5.8S-ITS2) del rDNA como ha sido reportado en ecosistemas similares (1). Metodologa. Se aislaron las levaduras empleado YEPD como medio de cultivo y tomando muestras a diferentes tiempos en el curso de la fermentacin de mostos de cuatro fbricas de mezcal de Tamaulipas. Las levaduras se agruparon por similitud en su morfologa colonial y microscpica, y de cada grupo se tom una cepa representativa para su ID. La identificacin con las galeras bioqumicas y los ITS1-5.8S-ITS2 se realiz de acuerdo al procedimiento descrito por Jacques et al. (2005). Resultados y discusin. Se obtuvieron 116 cepas que dieron lugar a 13 grupos (claves: T1 a la T14). En el cuadro 1 y en la figura 1 se muestra la asignacin de especie con los mtodos bioqumico (MB) y molecular (MM).
Cuadro 1.Identificacin con API 20C Aux (Biomerieux).
Grupo T1 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 Especie tipo Kluyveromyces marxianus Candida guilliermondii Rhodotorula glutinis Kluyveromyces marxianus Candida colliculosa Candida inconspicua/krusei Saccharomyces cerevisiae Candida norvegensis Geotrichum klebahnii Candida lusitaniae Candida inconspicua/krusei Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae % ID 89.7 22.8 99.9 98.7 96.7 95.8 99.5 45.8 79.2 93.3 98.9 100 100

T8 S.cerevisiae D89886 99 F1 S.bouladii AY428861 99 T13 S.cerevisiae AY525600 98 T14 S.cerevisiae AY525600 96 T6 C.fukuyamaensis AM158923 99 T3 P.mexicana AB054110 98 T4 P.mexicana AB054110 98 T1 K.marxianus AF543841 94 T7 K.marxianus AF543841 98 T9 P.hubeiensis DQ008954 90 T5 I.orientalis AY939808 99 T12 Pichia.sp. DQ104718 97 T10 G.klebahnii AJ279445 90 T11 C.lusitaniae AY174089 96
0.1

Fig. 1. Filograma de las comunidades de levaduras del mezcal de Tamps.

La asignacin de especie con una similitud (S) > 97% fue para siete grupos con el MB (4, 5, 6, 8, 12, 13 y 14) y ocho con el MM (4, 5, 6, 7, 8, 12, 13 y 14). La coincidencia entre tcnicas fue solo con los grupos 8, 13, 14 (identificados los tres como S. cerevisiae), 1 y 11, estos dos con una S < 97%, en ambos mtodos. Durante la fase activa de la fermentacin, la flora dominante fueron las cepas de S. cerevisiae (grupos 8, 13 y 14) diferenciadas macroscpicamente por el tamao de colonia. Conclusiones. Se requiere realizar ensayos adicionales para identificar mejor las especies, como corte de enzimas de restriccin para comparar con la informacin publicada. Un resultado interesante es la diversidad de cepas de S. cerevisiae encontradas (Fig. 1) ya que coexisten en los mostos incluso de fbricas distintas, esto abri la posibilidad de estudiar molecularmente la diversidad de estas cepas (que se reporta en otro trabajo), as como sus capacidades productivas, determinantes para encontrar inculos destacados. Agradecimiento. Agradecemos el apoyo de la Fundacin Produce Tamaulipas, del FOMIX Tamaulipas (proyecto clave TAMPS-2003C02-13 mod. E) y de la SIP del IPN (proyectos: 20050354 y 20060848). Bibliografa.

En la figura 1, se ilustra un filograma construido con las secuencias, el mtodo neigborjoining y el software Mega 3.1. La clave del grupo esta precedida de la especie ms cercana y el % de similitud de acuerdo al BLAST con el GenBank del NCBI.

1. Clemente-Jimenez, J.M., Mingorance-Cazorla, L., Martnez-Rodrguez, S., Las Heras-Vzquez, F.J. and Rodrguez-Vico, F. (2004). Molecular characterization and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must. Food Microbiol. 21: 149155. 2. Durn, D., Ruiz, A., Rodrguez, L.P. (2002). Aislamiento e identificacin de especies microbianas aisladas del mosto de fermentacin del mezcal. II Encuentro Internacional de Biotecnologa UPIBI 2002. 3. Jacques H. C., Asnett I. Lpez H., Carmina L. Anaya G., Ana M. Sifuentes R., Patricia Taillandier, Felipe Ramn P. (2005). Identificacin (ID) de Levaduras Aisladas de Mostos de Mezcal: ID Morfolgica-Bioqumica (M-B) vs Molecular (Mol). Congreso Ibero-Americano de Ingeniera de Alimentos. CYTED-IPN-UA. Puerto Vallarta, Jal, Mex. 4 al 7 de Septiembre de 2005. 4. Lachance, M. (1998). Yeast community in a natural tequila fermentation. Antonie Leeuwnhoek. 68, 151-160.