PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTANDARES

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MTODOS ESPECFICOS PARA DETECCIN DE MICROORGANISMOS: Clostridium perfringes

1. ANTECEDENTES
Clostridium perfringes es una especie bacteriana perteneciente a la familia Bacillaceae y al gnero Clostridium. Est integrada por bacilos rectos, gruesos, de extremos rectos y, a veces, redondeados que miden 0.3 1.5 de dimetro y 4-8 de largo. Observados en el microscopio, se presentan solos o en parejas. Son Gram positivos, inmviles y esporulados. Sus esporas son grandes y ovales, deformantes y de posicin central o subterminal. Requieren condiciones anaerobias para su desarrollo, aunque con variaciones, de tal forma que algunas cepas pueden multiplicarse con una cifra aproximada al 5% de oxgeno mientras que otras son ms estrictas. Existen cinco tipos de Clostridium perfringes (A, B, C, D y E) que se diferencian entre s por las distintas toxinas letales que producen. Los tipos A, C, y D son patgenos para el hombre: los tipos B, C, D, E y posiblemente el tipo A afecta a los animales (Pascual, 2005). Clostridium perfringes enterotxico tipo A es un importante agente productor de una intoxicacin de origen alimentario, adems del causante de algunas enfermedades extraintestinales del hombre, entre las que se encuentra la gangrena gaseosa que no se multiplica en tejidos sanos, pero crece rpidamente en tejidos lesionados, donde encuentra un ambiente de anaerobiosis perfecto. El tipo de C de C. perfringes es la causa de una grave enfermedad de origen alimentario llamado enteritis necrosante, que, afortunadamente es poco comn (Pascual, 2005). Un factor muy importante que afecta el crecimiento y la supervivencia de C. perfringes es la temperatura, sobre todo para su control. Se trata de un gen termfilo que se puede desarrollar entre amplios lmites de temperatura. Se crecimiento se restringe considerablemente por debajo de los 15C y, a temperatura inferior a 10C se logra controlar su desarrollo. El crecimiento ptimo de este microorganismo se obtiene entre 43-47C. Su tiempo generacional es muy corto, de unos 10 minutos a temperatura de 45C aunque, a veces, puede ser menor. No hay crecimiento del germen durante las dos horas posteriores al cocinado del alimento, pero lo hace de forma activa pasado ese tiempo, circunstancia por la cual, el alimento preparado no se debe dejar enfriar a temperatura ambiente una vez transcurridas ms de dos horas si se quiere asegurar la inocuidad del producto. La temperatura mnima de crecimiento de ciertas formas vegetativas es de 5C con excepciones (Pascual, 2005).

AUTORES Marisol Santizo Emilsa Esturban 200116751 200617945

REVISADO POR Nadia Hornquist

EDICIN 2012

Pamela Lam 200723302 Fernanda Barrios 200817097

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Las esporas de C. perfringes se dividen en dos categoras en cuanto a su resistencia trmica, teniendo como referencia temperaturas inferiores o superiores a inferiores a 100C algunas esporas resisten el calor utilizado en la mayora de los procedimientos de cocinado a que se someten los alimentos. Los ms resistentes son los que predisponen a padecer la intoxicacin alimentaria. La temperatura ptima de esporulacin de Cl. perfringes est entre 32 y 40 C, segn cepas. Respecto al pH, la esporulacin de esta especie bacteriana se sita en una escala ms limitada que en el crecimiento de las formas vegetativas y est comprendido entre los valores de 6 y 8, segn las cepas (Pascual, 2005). La intoxicacin alimentaria por Clostridium perfringes es un trastorno intestinal caracterizado por la aparicin repentina de clicos, seguidos de diarrea; la nusea es comn, pero por lo regular no hay vmito ni fiebre. Generalmente es una enfermedad benigna de corta duracin, un da o menos, y rara vez causa la muerte en las personas sanas. En la Alemania de la posguerra y en Papua Nueva Guinea se demostr la aparicin de brotes de una afeccin grave acompaada de enteritis necrosante, con una tasa de letalidad elevada (Organizacin Panamericana de la Salud, 2005). En caso de un brote, el diagnstico se confirma por la demostracin de Clostridium perfringes en cultivos anaerobios semicuantitativos de los alimentos (105 microorganismos por gramo o ms) o de las heces de los pacientes (106 microorganismos por gramo o ms), adems de la informacin clnica y epidemiolgica. La deteccin de la enterotoxina en las heces de los enfermos tambin confirma el diagnstico. Cuando es posible hacer estudios de serotipificacin, por lo comn se demuestra el mismo serotipo en muestras diferentes; solo en Japn y en el Reino Unido se realizan pruebas de serotipificacin (Organizacin Panamericana de la Salud, 2005). El tratamiento de gangrena gaseosa se basa en tres actuaciones: reseccin quirrgica de la zona afecta, tratamiento antibitico y, en ocasiones, tratamiento con oxgeno hiperbrico. La reseccin quirrgica se deba realizar lo ms rpidamente posible y asegurar la eliminacin de todo el tejido afectado. En los casos de afectacin importante de un miembro o de un tejido no vital, ste debe amputar o extraer. El tratamiento de eleccin sigue siendo la penicilina G, 10-24 milllones de UL diarias. Otras alternativas son metronidazol, imipenem, rinfanpicina, clindamicina. En caso de infeccin polomicrobiana debe aadirse un antibitico efectivo que cubra los restantes microorganismos. El uso del tratamiento con oxgeno hiberbrico es muy controvertido, por una parte, ste delimita mejor la zona afectada, disminuyendo as la zona de reseccin y sus posteriores secuelas, ya que inhibe la produccin de toxinas. Por otra parte, no existen ensayos clnicos que demuestren que ste tratamiento aumente la supervivencia de los pacientes afectados. Se AUTORES Marisol Santizo Emilsa Esturban 200116751 200617945 REVISADO POR Nadia Hornquist EDICIN 2012

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recomienda aplicar 5 dosis de oxgeno a 3 atm de presin en las primeras 48 horas de la infeccin. En el caso del uso de oxgeno pueda retrasar la reseccin quirrgica, siempre se desestimar su uso. Entre los alimentos implicados en este tipo de especie bacteriana se encuentran sobre todo las carnes que no estn bien cocinadas, incluyendo las de aves, frijoles refritos, salsas con jugo de carne (Ruiz, A. Moreno, S., 2006).

2. MATERIALES
225 ml de caldo SPS (sulfadiacina y sulfato de polimixina) 25g de alimento (pollo) 6 cajas de Agar SPS solidificado en placa de Petri Caldo nitratado, gelatina, caldo tioglicolato Asas bacteriolgicas Esparcidores Papel aluminio, tabla , tenedor y cuchillo estril Pipetas de 1mL Jarra Gas-Pack Balanza

3. PROCEDIMIENTO
1. Agregar 25g de muestra en 225 ml de Caldo para Clostridium (1:10) 2. Para dilucin utilizar tres cajas de agar SPS, (duplicado), distribuyendo 1 ml a tres cajas, a dos agregar 0.3ml y a una 0.4ml. 3. Incubar las cajas de agar a 37C por 24 horas, en condiciones anaerbicas. 4. Observar colonias sospechosas y proceder a contar, reportar como unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL) 5. Tomar una colonia sospechosa y sembrar en gelatina, caldo nitratado y tioglicolato para confirmar presencia de Clostridium a 37C por 24 hrs.

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4. DIAGRAMA DE FLUJO

25 g muestra + 225 ml de caldo para Clostridium

Agregar 0.3 ml de solucin en placa con agar SPS (duplicado) Agregar 0.3 ml de solucin en placa con agar SPS (duplicado) Agregar 0.4 ml de solucin en placa con agar SPS (duplicado)

1:10

Incubar a o 37 C por 24 Hrs, condiciones anaerobias.

Contar colonias, reportar UFC/ml.

Reportar ausencia o presencia.

- Caldo nitrado
- Gelatina - Tioglicolato

Tomar 1 colonia sospechosa y sembrar en:

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5. INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Observar morfologa de las colonias y hacer recuento (UFC/mL). Tomar una colonia sospechosa y sembrar en: gelatina, nitratos, tioglicolato. Agar SPS (sulfadiacina y sulfato de polimixina): El crecimiento en medio SPS, evidencia colonias negras positivas para Clostridium. Caldo Nitratado: El cambio de coloracin del caldo nitratado da a conocer la reduccin de los nitratos por parte de la bacteria. Gelatina: Permanece lquido despus de estar durante 1 hora en refrigeracin, por hidrlisis de la gelatina. Tioglicolato: Se consideran positivos para C. perfringens los tubos que presenten turbidez, ms de de gas en la campanilla de Durham y que tengan precipitado negro.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Organizacin Panamericana de la Salud. (2005). El Control de las Enfermedades Transmisibles. (18ava. Edicin). Washington: Heymann, David L. ediciones. Pascual, M. (2005). Enfermedades De Origen Alimentario. Su Prevencin. (1ra. Edicin). Espaa: Ediciones Daz de Santos, S.A. Ruiz, A. Moreno, S. (2006). Tratado SEIMC de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica. (1ra Edicin). Espaa: Editorial Mdica Panamericana.

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