INFORME SEMINARIO BIOQUMICA 2013 Identificacin de un candidato teraputico capaz de inducir a la autofagia Sanae Shoji-Kawata y colegas La autofagia es un mecanismo

mediante el cual la clula degrada componentes que se encuentran al interior de ella. Algunas de las funciones que cumple la autofagia son: Actuar en situaciones donde la clula se encuentra privada de nutrientes, degradando, protenas, aminocidos, cidos grasos, etc, para obtener energa de estos. Degradar componentes celulares daados, por ejemplo organelos, protenas, membranas, etc. Intervenir en procesos infecciones, destruyendo patgenos intracelulares. Apoptosis Dadas las importantes funciones que cumple la autofagia, y su implicancia en el control de infecciones, enfermedades neurodegenerativas, cncer y el envejecimiento; los investigadores han intentado hallar y desarrollar agentes inductores de la autofagia para una posible aplicacin teraputica. Para ello comenzaron a mapear el dominio de la protena beclin-1 (protena que se sabe que tiene un rol inductor en la formacin de autofagosomas) que interacta con la protena Nef del VIH (protena que inhibe la autofagia al interactuar con beclin-1), con el fin de poder identificar la secuencia necesaria y especifica que induce la autofagia. A travs de tcnicas de transfeccin e inmunoprecipitacin llegaron a una secuencia de 18 aa (267284 de beclin1) que es la esencial para inducir la autofagia, y fue corroborado ya que en presencia de este pptido el marcador de membrana de autofagosomas (GFP-LC3) aumentaba, y por tanto la autofagia. Una vez creado este pptido de 18 aa, se le hicieron modificaciones para mejorar su solubilidad, sin perjudicar su interaccin con Nef. Entre estas modificaciones est la adicin del dominio transductor de protena Tat (VIH), adicin de un ligando de diglicina y 3 sustituciones a los 18 aa. Este pptido ahora es Tat-beclin. Adems se creo un Tat-scrambled que tiene los 18 aa revueltos de forma aleatoria, para usarlo como control, ya que se demostr que el pptido de esta manera no funciona induciendo la autofagia. En la investigacin tambin buscaron identificar a una protena celular que se una a Tat-beclin1, pero no a Tatscrambled, y encontraron a Gapr-1. Mediante experimentacin se dieron cuenta que Gapr-1 es una protena propia de Golgi y que fisiolgicamente inhibe a beclin-1 secuestrndola del citoplasma y llevndola al interior de Golgi, y de esta forma inhibe la autofagia. Mediante estudios por western blot se pudo ver que la protena gapr-1 se uni en su mayora a Tat-beclin1, se uni muy poco a Tat-scrambled, y nada a Tat-beclin 1 que tiene los aminocidos 270 y 274 mutados a serina. Lo que indica la alta especificidad entre la unin de Tat-beclin 1 y Gapr-1. Tambin examinaron la localizacin de beclin1 endgeno, en presencia de Tat-scrambled y Tat-beclin1, cuando haba una sobrexpresin de Gapr-1 y cuando se silencian los genes que codifican gapr-1. Y lo que se observo fue lo siguiente: Con Gapr-1 en niveles normales Adicionando tat-scrambled: beclin1 se encuentra mayoritariamente en Golgi debido a que gapr-1 lo secuestra. Adicionando tat-beclin1: beclin1 se encuentra mayoritariamente fuera de Golgi ya que gapr-1 est secuestrando a tat-beclin1 en lugar de beclin1 Adicionando tat-scrambled: beclin1 se encuentra casi por completo en Golgi Adicionando tat-beclin1: beclin1 se encuentra en poca cantidad fuera de Golgi Beclin 1 se encuentra fuera de Golgi, debido a que no hay (o hay muy poco) gapr-1 para que la secuestre.

Con Gapr-1 sobrexpresado Sin gapr-1 (silenciado por siRNA)

Mas tarde hicieron pruebas con el pptido tat-beclin1 in vitro. Lo aplicaron primero en clulas con agregados proteicos de la protena modelo htt103Q (protena de la enfermedad de Huntington, en donde hay un gen mutado que provoca que la protena huntingtina tenga una expansin de poliglutamina, y se aglutinen entre s). Compararon la capacidad de tat-beclin1 para reducir los agregados proteicos en comparacin con la doxiciclina,

y los resultados fueron que tat-beclin1 reduce los agregados pequeos y los solubles (pre-agregados proteicos), en un nivel similar al de la doxiciclina, pero ni la doxiciclina ni tat-beclin1 son capaces de reducir los grandes agregados de protena. Tambin aplicaron tat-beclin1 como tratamiento a clulas HeLa infectadas con tres virus distintos (virus Sindbis, virus Chicungunya y virus del Nilo occidental) y en los tres casos la dosis de tat-beclin1 redujo 10 a 50 veces la concentracin de los virus. Luego infectaron clulas (macrfagos) con VIH, y al someterlas al tratamiento con tat-becln-1, se observ una disminucin dosis dependiente del antgeno p24 (del VIH), como se aprecia en el grfico. Pero en los casos que se ven afectados o anulados los genes esenciales (Atg) para la autofagia, todos los efectos antivirales de tat-beclin1 se ven derogados, ya que tatbeclin1 acta por la va cannica de la autofagia. Despus pusieron a prueba tat-beclin1 in vivo, en ratones a los cuales se les realizo un conteo de autofagosomas (marcados por GFP-LC3) luego de aplicarles las formas L-aminocido y D-aminocidos de tatbeclin1 (pruebas), y la forma L-aa de tat-scrambled y D-aa de tat (controles). Y como se ve en la figura, la forma tat-scrambled (L-aa) gener un poco mas de autofagosomas (D-aa) que tat, pero lo ms relevante es que la forma D-aa de tat-beclin1 caus un mayor aumento de autofagosomas que la forma L-aa del mismo. Esto se ve en los tres tipos de tejidos del grfico. Incluso se pudo ver que tat-beclin tambin aumenta la autofagia en cerebro de ratones neonatales, ya que luego de una dosis, se vio una disminucin de los niveles de p62 (sustrato necesario para la formacin de autofagosomas). Adems tratamiento con el pptido tat-beclin1 fue bien tolerado por los ratones (tanto adultos como neonatales). Por otra parte investigaron los efectos de Tat-beclin 1 en ratones neonatales infectados con Chicungunya y Virus del Nilo occidental. Observaron que con el tratamiento con Tat-beclin1, en ambos casos aument el nmero de autofagosomas (marcados por GFP-LC3), al sexto da de tratamiento ya haba una disminucin significativa de las concentraciones de virus, y adems hubo una disminucin de la mortalidad de los ratones infectados en cada uno de los casos. Como conclusin podemos decir que el objetivo de la investigacin se ha cumplido, ya que se logr desarrollar un agente inductor de la autofagia con fines teraputicos, pero an queda bastante por investigar y avanzar en esta materia. Queda an sin resolver si es posible aplicarlo en humanos, si es que tendr efectos secundarios o a largo plazo, adems de que el producto no ha sido del todo efectivo en tratar todas las infecciones, especialmente el VIH. Pero si cabe destacar el gran paso que se ha dado, y lo que queda es continuar en la bsqueda de ms conocimiento de estas vas y su funcionamiento, de modo que se puedan desarrollar formas para fortalecerlas, y as encontrar curas a enfermedades y mejorar la calidad de vida de las personas.