BIOLOGIA MOLECULAR

EXTRACCION DE ADN Y SUS APLICACIONES

Blgo. Gustavo Escobar Universidad Catlica de Santiago de Guayaquil 2012

COMPOSICIN DEL CIDO NUCLEICO

El cido nucleico. Unidades de nucletidos que se repiten. Cada
nucletido contiene 3 componentes caractersticos: Una base nitrogenada heterocclica (derivada de la purina o pirimidina). Una pentosa o azcar. Una molcula de cido fosfrico. Nucletido base + azcar + grupo fosfato Nuclesido: Base + azcar

COMPOSICIN DEL CIDO NUCLEICO

cido nucleico Azcar (pentosa) Bases nitrogenadas
purinas cido desoxiribonucleico cido ribonucleico 2-desoxi-D-ribosa D-ribosa Adenina (A) Guanina (G) Adenina (A) Guanina (G) pirimidinas Citosina (C) Timina (T) Citosina (C) Uracilo (U)

NUCLETIDOS
AC FOSFRICO (sin-nuclesido) AZCAR (DESOXIRRIBOSA) BASE PRICA O PIRIMDICA

BASES NITROGENADAS

ACIDOS NUCLEICOS

MODELO Y CONFORMACIN DEL ADN

Watson y Crick 1953 plantean un

modelo de estructura
Estructura tridimensional en forma de doble hlice Dos cadenas polipeptdicas
de polaridades opuestas

que se unen por puentes de hidrgeno entre las bases

nitrogenadas para dar la doble hlice.

Existe una complementaridad entre las bases, de

modo que A siempre se aparea con T y G siempre con

C.

Existe
hacia

un ordenamiento regular de azcar fosfato exterior y uno irregular de bases

el

nitrogenadas hacia el interior.

ESTRUCTURA EN DOBLE HLICE DEL DNA

RNA

ESTRUCTURA DEL DNA

ORIENTACIN 3 Y 5 DE ACUERDO A POSICIN DEL TOMO DE CARBONO DE LA DESOXIRRIBOSA

DOBLE HLICE
Basada en Cadena de polinucletidos Reglas de Chargaff (cantidad de purinas=pirimidinas) Estructura helicoidal (Franklin y Wilkins)

Tipos de enlace entre las bases

FUNCIONES DEL DNA

Almacenar

Replicar
Expresar Transmitir Cambiar

 CUANTOS TIPOS DE DNA TENEMOS DENTRO DE LA CLULA?

Niveles de Compactacin del DNA

1.-Nucleosoma (200pb e histonas) 2.-Solenoide (con forma de tubo) 30nm 3.-Asas 4.-Dominios o bucles - Se acoplan al andamio 5.-Cromosomas

Organizacin de los seres vivos

Aplicaciones del ADN

Diagnstico de emfermedades producidas por agrentes infecciosos ( Virus, Bacterias y Parasistos) Caracterisacin de Especies ( Animales, Vegetales etc.) Detecciones de anomalas genticas Casos forenses: comparacin del sospechoso con la evidencia Paternidad: identificacin de progenitores biolgicos Investigaciones histricas Investigaciones de personas perdidas Desastres en masa Bases de secuencias de ADN de delicuentes

LAS FUENTES DE EVIDENCIA BIOLGICA

De sangre
De semen De saliva

De orina
De pelo De los dientes

De los tejidos de los huesos

Tiempo de recoleccin de la muestra Tipo de muestra en relacin a la enfermedad Transporte apropiado Deteccin de virus generalmente requiere que la muestra se tome durante los primeros das de iniciado el proceso, y que se maneje en cadena de fro Anticoagulante apropiado, uso de medios de transporte, temperatura de almacenaje

METODOS DE EXTRACCION DE AN
Extraccin del cido Nucleico ADN Molde

QIAamp DNA Minikit Proteinasa K y B. Lisis. Fenol-Cloroformo

ARN Molde
CASEROS - KIT

Trizol QIAamp Viral RNA minikit

Inhibidores de los Mtodos Moleculares Hemoglobina Nitratos Heparina

Extraccin de ADN mediante kits diagnsticos comerciales (QIAmp DNA Minikit, Blood minikit, etc). Manual o automatizada

EXTRACCIN DE ACIDOS

NUCLEICOS
mediante columnas

EXTRACCION DE AN MEDIANTE COLUMNAS

200 l Tampn AL + 200l de la Muestra

200L Etanol Absoluto

500 l 500 l Tampn AW2 Tampn AW1

56C 10 min 95C /10 min

Proteinasa K 20l

60L ADN -20C

EXTRACCIN DE ADN EN SANGRE PERIFRICA (CASERO)

Tomar de 5 ml de sangre perifrica con EDTA

(cido etilen-diamino-tetra-actico)

lisis de eritrocitos
Glbulos blancos Resuspender el tapn de clulas blancas en : 500 ul de buffer de lisis de leucocitos 10 ul de Proteinasa K (PK) 10mg/ml 50 ul de DUODECIL sulfato de sodio (SDS) al 10 %
37 C o a 56 C

1. Toma de muestra

FLUJO DE TRABAJO

2. Separacin de plasma 3. Centrifugacin y eliminacin de hemates 4. Incubacin de la muestra con SDS y proteinasa K

5. Purificacin del ADN por fenol cloroformo

Al da siguiente Re purificacin de ADN (CLNa), 5 M fenol cloroformo Cloroformo ISO propanol (helado) Invertir la muestra suavemente hasta que la medusa del ADN se observe

Cuantificar la muestra en el espectrofotmetro y dejarla en una concentracin final de 100 ng/ul. Congelar la muestra a -20C.

Medusa de ADN

Actualidad y futuro

MEJOR CONOCIMIENTO DE ENFERMEDADES

INFECCIOSAS IDENTIFICACION DE GENES CANCER MULTIFACTORIALES

FARMACOGENTICA

DIAGNOSTICO PRENATAL
TODA MUJER TIENE DERECHO AL DX PRENATAL

GENTICA DE POBLACIONES

ALIMENTOS TRANSGNICOS

BIOTICA
GENTICA TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR