Deconvolucin

Si la convolucin implica reemplazar cada fuente luminosa puntual original por su correspondiente PSF para producir una imagen borrosa, el proceso de restauracin sigue el camino inverso, recolectando toda la luz dispersa y ponindola en su sitio de nuevo. Esto produce una mejor representacin del objeto real, ms clara a nuestros ojos. (El brillo de la imagen parece disminuir mientras que aumenta el contraste entre objetos y fondo, y el rango dinmico se agranda). En trminos matemticos, la deconvolucin es simplemente la resolucin de la ecuacin 1 mostrada ms arriba, donde conocidas la imagen convuelta g y la PSF h, se obtendra la distribucin de luz original f: una representacin del objeto "real". La relacin de la ecuacin 3 parece conducirnos a que es posible obtener la funcin del objeto F mediante inversin del filtro H, simplemente dividiendo F = G/H. Pero debido al carcter pasa-banda de H, esta funcin tiene ceros ms all de una cierta regin central (ver "the Cookie Cutter"), lo que conducira a una divisin entre cero de muchas frecuencias espaciales. Adems, en un caso real general el ruido fotnico debe ser tenido en cuenta, as que la ecuacin que en realidad debemos resolver no es la 1, sino sta, (Ec. 4)

(Fig. 2)
donde la imagen registrada k proviene de la convolucin de las fuentes reales f y la PSF h, ms el ruido fotnico . La divisin de entre H conducira a una amplificacin extrema del ruido y a la aparicin de artefactos, debido a las regiones de H en que sta tiene valores prximos a cero. (Por otra parte, no podemos sustraer de k, porque no conocemos cul es la distribucin exacta del ruido). En conclusin, la inversin del filtro no nos permite recuperar la funcin del objeto real f. En vez de esto debemos encontrar una estimacin de f que satisfaga algn criterio racional preestablecido, y que sea estable en presencia de ruido. Algunos mtodos de deconvolucin (como la deconvolucin ciega) intentan resolver la ecuacin 4 sin conocer la PSFh. Aunque siempre se pueden aplicar ciertas restricciones, este procedimiento es arriesgado, porque introduce mucha indeterminacin en la solucin de la ecuacin. Como analoga, pensemos en cuntas soluciones x, y se pueden encontrar para una ecuacin algebraica como x y = 5. Se puede hacer x tan pequea como se desee incrementando el valor de y, y viceversa. Se puede obtener una imagen tan "limpia" como se desee, incluso totalmente vaca, haciendo la PSF ms y ms

intensa, pero eso no implica que as se obtenga una buena representacin del objeto real. La deconvolucin ciega se desarroll para imgenes astronmicas, donde la mayora de los objetos tienen formas puntuales, lo que permite aplicar fuertes restricciones, pero hasta el momento carece de validacin cientfica cuando se aplica a objetos complejos en microscopa. Tenemos que buscar otra solucin.

Cmo funciona Huygens

Los programas Huygens de Scientific Volume Imaging le permiten obtener una PSF de dos maneras:

calculando una PSF terica, obtenida de los parmetros microscpicos, un modelo del microscopio, y las ecuaciones de electromagnetismo aplicadas a la difraccin, o "destilando" una PSF experimental a partir de medidas de calibracin de cuentas fluorescentes, como se explica en Recording Beads.

El primer caso sucede automticamente siempre que no se provea al programa de una PSF de alguna otra forma, por lo que el usuario puede proceder a la deconvolucin sin preocuparse ms que de describir apropiadamente el microscopio con los parmetros adecuados. En el segundo caso, tras calcular automticamente un modelo de la forma real de la cuenta, la PSF se calcula iterativamente de manera que su convolucin con dicho modelo coincida con la imagen registrada. Esto se puede entender mejor volviendo a la figura 1 y a la ecuacin 1. En este caso conocemos el objeto f (debemos saber el tamao preciso de la cuenta esfrica) y la imagen registrada g, as que podemos "destilar" la incgnita h de la ecuacin. Una vez que Huygens tiene una PSF, puede usar diferentes algoritmos matemticos para resolver la ecuacin 4 y hacer la deconvolucin:

Estimacin de mxima verosimilitud clsica (Classic Maximum Likelihood Estimation) Estimacin de mxima verosimilitud rpida (Quick Maximum Likelihood Estimation) Tikhonov-Miller restringido e iterativo (Iterative Constrained Tikhonov-Miller) Tikhonov-Miller rpido (Quick Tikhonov-Miller)

La estimacin de mxima verosimilitud clsica (CMLE) es el mtodo de restauracin ms verstil disponible, vlido para casi todo tipo de imgenes. Se basa en la idea de optimizar iterativamente la verosimilitud de una estimacin del objeto, dadas la imagen y la PSF. El objeto estimado es una imagen 3D estndar. La verosimilitud en este procedimiento se computa mediante un criterio de calidad bajo el supuesto de que el ruido fotnico est determinado por una distribucin de Poisson. Por esta razn es especialmente apropiado para imgenes de baja seal, con mucho ruido fotnico. Adems es muy bueno restaurando imgenes de objetos con forma puntual, lineal o plana. Ver Maximum Likelihood Estimation para ms informacin. En cualquier caso hay a veces situaciones en que otros algoritmos toman protagonismo, por ejemplo

cuando hay que deconvolver series temporales tridimensionales, lo que requiere mucha capacidad de clculo. En estos casos el algoritmo Quick Maximum Likelihood Estimation (QMLE) resulta mucho ms rpido que el CMLE, y tambin proporciona excelentes resultados, sobre todo en imgenes con mucha seal y poco ruido como las de microscopios de campo ancho. Una ventaja de emplear PSF experimentales como hacen los programas Huygens es que en esencia esto requiere del usuario que calibre su microscopio, y estimula el uso de protocolos estndar para la adquisicin de imgenes. Ambas cosas aseguran el correcto funcionamiento del microscopio e incrementan enormemente la calidad y fiabilidad de los datos, y con ellas tambin las de los resultados de la deconvolucin. Por ltimo, la ventaja de emplear PSF ya sea experimentales o tericos es que permiten la programacin de algoritmos muy rpidos y eficientes como el QMLE disponible en Huygens Professional o el Batch Processor. Las iteraciones en el QMLE son unas cinco veces ms efectivas que las del CMLE, y se requiere menos tiempo por iteracin. Las imgenes afectadas de aberracin esfrica debido a un desajuste de ndices de refraccin se restauran mejor empleando las PSF dependientes de la posicin que Huygens puede calcular automticamente (ver Parameter Variation). Vea cmo la deconvolucin Huygens se aplica a imgenes de carcter divulgativo en Convolving Trains.

Validacin
El mtodo CMLE empleado en Huygens est respaldado por una larga lista de publicaciones cientficas . Por citar algunos ejemplos (siga el enlace anterior para una lista ms completa):

Verschure P.J., van der Kraan I., Manders E.M.M. and van Driel R. Spatial relationship between transcription sites and chromosome territories. J. Cell Biology (1999) 147, 1, pp 13-24 (descargar pdf ). Visser A.E. and Aten J.A. Chromosomes as well as chromosomal subdomains constitute distinct units in interphase nuclei. J. Cell Science (1999) 112, pp 3353-3360 (descargar pdf ). Hell S.W., Schrader M. and Van Der Voort H.T.M. Far-Field fluorescence microscopy with three-dimensional resolution in the 100-nm Range. J. of Microscopy (1997) 187 Pt1, pp 1-7 (descargar pdf ).

Ejemplos

Clula humana en metafase, teidos con marcadores fluorescentes el ADN (rojo), los centrmeros (azul) y el ciclosoma/complejo promotor de la anafase (verde). Parte superior: datos originales, Parte inferior: deconvolucin con Huygens Professional. Imagen adquirida por la Dra. Claire Acquaviva, Dr. Pines Lab.

1 equivale a 111,319 km latitud 1 de dicha circunferencia equivale a 111,131 km longitud