UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FACULTAD DE QUMICA

Prctica No.7: CROMATOGRAFA EN COLUMNA

Alumna: Profesor: Agustn Palmas Laboratorio de Orgnica1 Clave: 25 / Grupo: 26

Fecha de entrega: 11/04/13

MXICO D.F

UNAM

11/04/13

Prctica No.7: Cromatografa en columna

OBJETIVO: Comprender la tcnica de cromatografa en columna, sus caractersticas y los factores que en ella intervienen. Emplear la tcnica de cromatografa en columna para la separacin de un compuesto orgnico. A travs de cromatografa en capa fina controlar la cromatografa en columna.

ANTECEDENTES: La Cromatografa es quiz el medio ms til de la separacin de los compuestos para purificar e identificar. Para llevar a cabo una purificacin de un compuesto sea slido o lquido, es necesario aplicar la tcnica de cromatografa en columna puesto que es fcil, se puede llevar a cabo a temperatura ambiente y pueden separase grandes cantidades de una mezcla de compuesto. La cromatografa en capa fina (CCP) es una tcnica que ayuda a determinar el nmero de componentes de una mezcla y como una prueba preliminar para realizar una cromatografa en columna, entre otras aplicaciones. En la Cromatografa en columna, la fase estacionaria se dispone como el relleno de un recipiente cilndrico de vidrio, plstico o metal, abierto por ambos extremos, se denomina columna. Dicho relleno, tambin llamado leche cromatogrfico, debe tener una estructura porosa a fin de que pueda fluir la fase mvil. El flujo estar propiciado por la accin de la gravedad (cromatografa convencional) o por sistemas de bombeos de alta presin (cromatografa lquida de alta resolucin). La cromatografa en columna, sirve para la separacin de grandes cantidades de material (por ejemplo, >100 mg). En este tipo de cromatografa, lo normal es llevar a cabo una aplicacin zonal de la muestra, esto de consigue depositando la disolucin problema sobre la parte superior de lecho cromatogrfico. Una vez aplicada la muestra, se abre la columna por el extremo puesto y se deja que la disolucin problema vaya fluyendo hacia el interior del lecho. Antes de que la parte superior de ste se seque, se aporta nueva fase mvil, y as se sigue de modo continuado hasta el fin del proceso. El ir pasando fase mvil hasta la salida de los solutos se llama elucin, y el trmino eluido hace referencia a la fase mvil que se recoge desde la aplicacin de la muestra hasta la salida de todos los solutos. Con este carcter general, a la fase mvil se le suele llamar tambin eluyente. En su viaje a travs de la fase estacionaria, los solutos no slo se irn separando cromatogrficamente sino que tambin difundirn, por lo que la zona en la que viaja cada uno se ir ensanchando y sus lmites difuminando. De este modo, la distribucin de cada soluto en el eluido de la columna ser tipo gaussiano. El perfil de elucin, perfil cromatogrfico o cromatograma es la sucesin de curvas gaussianas que informa sobre la salida de los diferentes solutos. La Cromatografa de absorcin, de reparto o de particin; se emplea cuando se trata de sustancias de propiedades fsicas y qumicas muy semejantes. Se basa en las diferencias de polaridades existentes entre los diferentes productos que componen una mezcla.

Existen 2 tcnicas de cromatografa de absorcin, general o bsica, de las que se derivan todas las existentes en la actualidad: cromatografa en columna y en capa fina. Es una tcnica de separacin por particin slido-lquido, donde la fase slida, es la fase estacionaria, corresponde al absorbente de debe ser un material, que no se disuelva en la fase lquida, los materiales ms comunes son: celulosa, silicato de magnesio, sulfato de calcio, cido silcico, gel slice, almina, oxido de magnesio y carbn activado. Estos absorbentes son usados en finos granos, usualmente de un tamao de malla de 100 a 200 para capa fina y de 200 a 400por columna. Los factores que influyen en una separacin por cromatografa en columna son: -No permitir que la columna se seque. -La temperatura en el entorno de la columna debe mantenerse aproximadamente constante. -Una corrida cromatogrfica debe llevarse a cabo sin interrupcin. -Cuando se usa almina, no utilizar acetona como eluyente, ya que, se pueden encontrar productos de condensacin entre los constituyentes principales del producto de la elucin. -Cuando se utilizan eluyentes con un punto de ebullicin bajo (ter, pentano, diclorometano), especialmente cuando se combinan los disolventes, a menudo se forman burbujas en la columna y ests, por lo general, evitan que se obtenga una separacin satisfactoria. El uso de columnas en fro puede prevenir este calentamiento. - Es preferible utilizar una mezcla de eluyentes ligeramente menos polar que la que mostro ser la mejor para la C.C.F. La eleccin del eluyente depende de la polaridad de las substancias que van a ser separadas, frecuentemente es necesario usar mezclas de disolventes. En general, se empieza, con ter de petrleo, diclorometano, acetato de etilo y mezclas de estos. El diclorometano y el acetato de etilo tambin son buenos disolventes para muchas sustancias.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: -MATERIAL: 1 Agitador de vidrio 1 Colector 1 Columna para cromatografa 1 Embudo de vidrio 2 Frascos para cromatografa 8 Vasos viales 1 Matraz redondo de fondo plano de 50m l 1 Pipeta de 5m L 4 Portaobjetos 1 Probeta de 25m L -MATERIAL ADICIONAL: 1 Lmpara de UV, onda larga y onda corta 1 Cmara oscura para lmpara de luz UV

1 Piseta de 125m L con eluyente 1 Refrigerante para agua con manguera 1 T de destilacin 1 Tapn esmerilado 1 Tubo capilar 2 Vasos de precipitados de 100m L 1 Vidrio de reloj 1 Esptula 2 Pinzas de tres dedos con nuez 1 Recipiente elctrico para Bao Mara

1 Cmara de yodo

-SUSTANCIAS Y REACTIVOS: Hexano: -Frmula molecular C6H14 -Apariencia: -Densidad: 654.8 g/cm3 -Masa molar: 86.16 g/mol -Insoluble en agua -Punto de ebullicin: 68.85C -Punto de fusin: -95.15 C Acetato de Etilo -Formula molecular CH3-COO-CH2-CH3 -Apariencia: Liquido incoloro -Masa molar: 88,11 g/mol -Soluble en alcohol y ter -Punto de ebullicin: 77C -Punto de fusin: -83C Azul de metileno -Frmula molecular: C16H18N3ClS -Densidad: 1.757g/cm -Masa molar: 319,85 g/mol -Punto de ebullicin: Se descompone -Punto de fusin: 100 C Acido benzoico -Frmula molecular C6H5-COOH -Densidad: 1320 kg/m3; 1,32 g/cm3 -Masa molar: 122,12 g/mol -Punto de ebullicin: 522 K (248,85 C -Punto de fusin: 395 K (121,85 C Gel de silice -Frmula molecular: m SI O2 n H2 O -Densidad: 22 g/cm -Punto de ebullicin: No aplicable -Punto de fusin: 1.713 + 5 C

-SOLUBILIDAD (EN EL AGUA) 20 C

Yodo: -Masa atmica (g/mol): 126,904 -Densidad (g/ml): 4,94 -Punto de ebullicin (C): 183 -Punto de fusin (C): 113,7

-PROCEDIMIENTO : 1. Purificacin de cido Benzoico: -Se proporcionaran 0.4g de una mezcla slida de cido Benzoico contaminada con azul de metileno. -Se coloca la columna de cromatografa en un soporte con ayuda de unas pinzas de tres dedos, de tal forma que se encuentre totalmente vertical y con una altura al tamao de los frascos viales. -Para empacar la columna, se coloca la llave de la columna en posicin de cerrado (si la llave es de vidrio, se deber engrasar ligeramente). Se introduce hasta el fondo un pequeo pedazo de algodn con ayuda de una varilla de vidrio o de metal, se agregan 5 mL del eluyente (AcOEt) y se presiona suavemente el algodn para eliminar las burbujas. -Se prepara una suspensin de slica gel para columna, 6g en 30mL de eluyente y se agita la suspensin hasta que no se observen burbujas de aire. Con ayuda de un embudo de vidrio se vierte la suspensin en la columna lo ms rpido posible y se golpea ligeramente la columna con los dedos para que el empaquetamiento sea uniforme. Se abre la llave para eliminar el exceso de disolvente cuidando de no dejar secar silica gel, se debe mantener el eluyente aproximadamente a 0.5 cm arriba de la silica. - En un vaso de precipitado de 100mL se disuelve la mezcla problema (cido Benzoico) con la mnima cantidad de eluyente de (2 a 3m L), con ayuda del agitador, se vierte lo ms rpido posible y con cuidado para no mover la superficie de la silica en la columna. Se abre la llave para colectar el eluyente y que se absorba la muestra aplicada, se debe tener cuidado de que la columna no se seque. -Se marcan los frascos viales a 6mL y se colectan las fracciones (eluatos), se verifica la separacin realizando cromatoplacas (se preparan cromatoplacas y capilares previamente como en la prctica Cromatografa en capa fina). En cada cromatoplaca se aplican 4 de sus fracciones y un testigo. -Se eluyen las cromatoplacas en una mezcla de hexano- acetato de etilo (2:1) y se observa en cuales fracciones hay presencia del compuesto separado revelando con una cmara de UV o cmara de yodo. En cada cromatoplaca se debe observar el cambio de coloracin de la mancha del producto principal ( a menor concentracin menor intensidad de color). -Para recuperar el cido Benzoico se destila el disolvente por medio de una destilacin simple usando como fuente de calentamiento un bao Mara, se deja un residuo de 5mL aproximadamente y se vierte en un vidrio de reloj para que termine de evaporarse en la campana. Finalmente se pesa el producto recuperado y se calcula el rendimiento.

RESULTADOS: -Cromatografa en columna: *Eluatos:

-Cromatografa en capa fina:

ANALISIS DE RESULTADOS: Al aadir la disolucin (cido benzoico contaminada con azul de metileno y acetato de etilo), con la muestra a la columna a la que previamente aadimos el gel de slice con el eluyente para evitar que se secara, el cido benzoico se pudo separar del azul de metileno porque este ltimo se adsorbi al gel de slice (fase estacionaria) debido a la similitud en sus polaridades y el cido benzoico al al eluyente se pudo colectar, es muy importante que la fase mvil se elija correctamente pues de ello depender que la tcnica proporcione buenos resultados. Una vez que tuvimos los 8 frascos viales (colectores) en los que se supona estara el cido benzoico, procedimos a preparar cromatoplacas para hacer cromatografa en capa fina con una muestra de cada frasco (numeradas del 1 al 8), gracias a la cmara de yodo observamos que en las muestras de los dos primeros frascos viales (nuestra primera cromatoplaca, si corrio), los resultados sealan que solo la muestra 2 contena cido benzoico, en nuestra segunda cromatoplaca (frascos viales 3 y 4), tambin corrieron ambos tenan acido benzoico, nuestra tercer cromatoplaca (muestras 5 y 6) tambin corrieron, por lo tanto tambin tenan cido benzoico y en la tercera y cuarta cromatoplacas no encontramos nada de la muestra. Todos corrieron ms o menos a la misma distancia segn lo observado al revelar las cromatoplacas (cmara UV), lo cual indica que la muestra recuperada de cido benzoico si es pura. La destilacin del disolvente fue rpida puesto que el acetato de etilo tiene un punto de ebullicin ms bajo que el agua (77C), y como se observa a continuacin despus de dejar secar la muestra observamos que el rendimiento de cido benzoico fue bueno.

Cristalizacin: Clculo de rendimiento SUSTANCIA 0.4046g. 0.34

Masa inicial Masa final Rendimiento

84.03%

CONCLUSIN: Se utiliz la tcnica de cromatografa en columna para separar individualmente al cido benzoico de el azul de metileno con el que se encontraba mezclado, identificndolo comparando su comportamiento cromatogrfico con el de la sustancia patrn de cido benzoico puro eluido en AcOet.Despus fueron analizarlas por medio de cromatografa en capa fina, y las comparamos con una muestra testigo para poder identificar los eluatos que contena cido benzoico y se uso la tcnica de destilacin simple para obtener el cido benzoico purificado Obtuvimos muy buen rendimiento de la muestra inicial pero obviamente no se recuperaron los 0.4046g iniciales, lo cual puede ser multifactorial, ya que cmo sabemos el cido benzoico estaba contaminado con azul de metileno y en la columna se observ que gran cantidad de este ltimo se adsorbi al gel de slice. Consideramos que realizamos cuidadosamente la cromatografa por lo cual quizs las nicas prdidas se hicieron en la adicin de muestra a las cromatoplacas; por lo tanto consideramos que la cromatografa de columna es una excelente mtodo para la purificacin de sustancias, debido a que se basa en la diferencia de polaridades que tiene una papel imprescindible ya que como se observa la impureza se adsorber a la sustancia a la cual sea afn y lo que se desea recuperar debe ser afn al eluyente. Esto nos indica que est tcnica es muy eficiente siempre y cuando se elija el eluyente adecuado, ya que esto determinar la eficacia de la purificacin.

En esta prctica a comparacin de la anterior tipo se utiliza para determinar la cantidad de ste cuantitativamente, contrario a la cromatografa por capa fina donde slo se puede hacer un anlisis cuantitativo.