"El diagnstico de las enfermedades hereditarias.

Joan Fibla Octubre, 2001

"El

diagnstico de las enfermedades hereditarias

Dr. Joan Fibla Palazn Departament de Cincies Mdicas Bsiques Facultat de Medicina Universitat de Lleida
Introduccin El diagnstico de las enfermedades hereditarias consiste en la deteccin de las alteraciones o variaciones de la constitucin gentica de un individuo que estn directa o indirectamente relacionadas con estados patolgicos. El diagnstico basado en el estudio del ADN ha experimentado un avance considerable en el ltimo decenio fruto de la identificacin, caracterizacin y cartografiado de un elevado nmero de genes implicados en patologas humanas. En la actualidad, el anlisis de numerosas patologas genticas puede ser abordado en los laboratorios de gentica molecular humana, tanto con una finalidad clnica como de investigacin bsica. Las estrategias para el diagnstico gentico las podemos clasificar como directas o indirectas en funcin de si se detecta o no el gen implicado. En el primer caso podremos realizar el diagnstico identificando en los pacientes las diferentes mutaciones del gen en cuestin. Desafortunadamente el nmero de enfermedades producidas por ms de un tipo de mutacin en un mismo o diferentes genes supera a aquellas que son consecuencia de una nica mutacin. Ello hace que el diagnstico directo presente en muchas ocasiones problemas prcticos. La segunda estrategia es independiente del conocimiento del gen implicado, pues se fundamenta en el estudio de la herencia conjunta de marcadores annimos y el locus de la enfermedad estudiada. Para este fin, es preciso que el marcador utilizado presente un fuerte ligamento con el locus de inters, adems de otras caractersticas que lo harn ms o menos adecuado para el diagnstico. Respecto a otros tipos de diagnstico mdico, el diagnstico gentico presenta caractersticas diferenciadoras muy significativas como son: El resultado de un diagnstico gentico tiene no solo efectos sobre el paciente (al que denominamos propositus) sino que todos los individuos emparentados con este se ven afectados. As, la unidad de estudio en el diagnstico gentico es la familia y todo proceso de diagnstico implica un estudio familiar. El diagnstico gentico debe dar respuesta a situaciones con dimensin tico-social importante. Su aplicacin durante los perodos prenatal o neonatal tiene como objetivo el facilitar a los padres una informacin completa y fiable que les permita la toma de decisiones durante las primeras semanas de gestacin o para poder dar una rpida respuesta teraputica al recin nacido. Una parte importante de las estrategias diagnsticas tienen una mayor o menor componente probabilstica. Por ello, los resultados obtenidos y la calidad de la informacin facilitada al paciente y a su familia deben ser matizadas en este sentido.

Estrategia y mtodos de diagnstico

La estrategia y mtodos de diagnstico ms apropiados dependern del tipo de alteracin gentica que presente la patologa estudiada, del periodo vital en el que es analizado el propositus y del colectivo estudiado (Figura 1). Atendiendo al tipo de alteracin gentica Un nmero importante de patologas genticas estn asociadas a alteraciones en el complemento cromosmico, sobre todo aquellas que se manifiestan de forma sindrmica. La estrategia diagnstica ms adecuada en este caso ser la caracterizacin cromosmica del propositus y de su familia. Dicha caracterizacin consistir bsicamente en la elaboracin del cariotipo para el estudio de posibles alteraciones cromosmicas estructurales o numricas. De tratarse de una patologa con herencia multifactorial, como es el caso de numerosas enfermedades con una alta frecuencia en la poblacin como la hipertensin, la diabetes, las enfermedades cardiovasculares u otras, la aproximacin diagnstica consistir en la determinacin de factores de riesgo mediante estudios de asociacin. Si se trata de una enfermedad monognica con herencia mendeliana definida, la estrategia diagnstica depender de si se ha localizado o no al locus implicado, de si se conoce o no al gen y de si este presenta una o mltiples mutaciones que causen la patologa en estudio. Segn sea el caso podremos aplicar un diagnstico probabilstico basado en el patrn de herencia de la enfermedad, un diagnostico probabilistico basado en la utilizacin de polimorfismos genticos o un diagnstico de certeza fruto de la deteccin de la mutacin en el paciente. Atendiendo a la etapa del ciclo vital del paciente La aplicacin de las distintas estrategias antes mencionadas se podr realizar en distintas etapas del desarrollo del individuo afectado definiendo distintos tipos de diagnstico gentico (Figura 1). El diagnstico preimplantacional, cuando se analiza el genotipo en las primeras etapas del desarrollo embrionario de vulos fecundados mediante fertilizacin in vitro . El diagnstico prenatal cuando el genotipo es analizado durante las primeras semanas de desarrollo fetal. 1

Figura 1. El diagnstico gentico segn la etapa del desarrollo y el colectivo analizado.

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El diagnstico postnatal cuando el genotipo se determina despus del nacimiento, normalmente durante los primeros das despus del parto (neonatal) o en perodos posteriores de la infancia o de adulto. Atendiendo al colectivo estudiado Segn sea el colectivo de estudio podremos referirnos a un diagnstico individual, familiar o poblacional.

alteraciones en distintos genes (heterogeneidad de locus o gnica) o distintas mutaciones de un mismo gen (heterogeneidad allica). Ambas situaciones dificultan el establecimiento de un patrn de herencia. Variabilidad en la expresin gnica. Diversos procesos epigenticos pueden alterar la expresin de un carcter y por ello modificar el patrn de herencia observado. El modelo mendeliano asume que la manifestacin fenotpica de un carcter autosmico es independiente del origen materno o paterno del alelo heredado. Dicho principio, como tantos otros, no puede generalizarse de acuerdo con la informacin actualmente disponible sobre la impronta del genoma. Dicho fenmeno se refiere al hecho de que en determinados genes un mismo alelo presenta una actividad gnica distinta segn sea heredado por la lnea materna o paterna. La naturaleza molecular de la impronta es en muchos aspectos desconocida, aunque parece estar relacionada con el grado de metilacin del ADN.

Anlisis del patrn de segregacin

La aproximacin ms simple que podemos hacer en el diagnstico de una enfermedad hereditaria es el estudio de su patrn de herencia. Esta ser la nica aproximacin diagnstica en muchas de las enfermedades hereditarias todava no caracterizadas. El estudio del patrn de herencia es una etapa imprescindible en todo diagnstico gentico, sea cual sea la estrategia utilizada. Los patrones mendelianos clsicamente definidos no son siempre tan difanos y transparentes cuando se analizan en genealogas humanas. Para empezar, el nmero de descendientes que podemos estudiar en una familia es, por lo general, muy reducido y ello dificulta en muchas ocasiones el establecimiento de un patrn de herencia concreto. Por otra parte diversos factores pueden alterar o modificar la presentacin del fenotipo en los miembros de una familia y enmascarar un determinado patrn de herencia. Discutiremos a continuacin algunos de estos factores. Variabilidad en la manifestacin clnica . La manifestacin clnica de una enfermedad hereditaria presenta, en la mayora de los casos, una gran variabilidad que dificulta el establecimiento del patrn de herencia. Un carcter presenta expresividad variable cuando su manifestacin clnica es heterognea entre individuos afectados. Un ejemplo de esta situacin lo tenemos en la neurofibromatosis tipo 1, cuya manifestacin clnica puede ir desde manchas oscuras en la piel (manchas caf-au-lait) o pequeos neurofibromas cutneos hasta enormes deformaciones seas. La expresividad no debe confundirse con la penetrancia del carcter. Un carcter ser penetrante cuando todos los individuos portadores del alelo mutado manifiestan el carcter en uno u otro grado de expresividad. En caso contrario, cuando individuos portadores del alelo mutado no manifiestan el carcter, diremos que este es no penetrante (Figura 2). Las razones que justifican la baja penetrancia de un carcter son en muchas ocasiones desconocidas. Puede tratarse de una caracterizacin clnica incompleta, o bien ser el resultado del efecto de factores ambientales o genticos que impiden la manifestacin del carcter en el individuo en cuestin. As mismo, la penetrancia puede variar en funcin de la edad del individuo portador del alelo mutado. Este es el caso de las enfermedades de manifestacin tarda como la poliquistosis renal del adulto o la enfermedad de Huntington. Variabilidad en la base gentica de la patologa. Cuando se analiza un patrn de herencia, se suele simplificar al considerar el modelo de un gen que causa un efecto fenotpico. Desafortunadamente la situacin real es mucho ms compleja. En numerosas ocasiones la alteracin en un determinado gen produce efectos pleiotrpicos dando lugar a alteraciones fenotpicas en distintos tejidos, rganos o sistemas. As mismo, una determinada manifestacin fenotpica presenta heterogeneidad gentica cuando puede producirse por

Figura 2. Penetrancia y expresividad. En el histograma de la izquierda se representan en el eje de las ordenadas valores arbitrarios de la expresin de distintos caracteres y en las abcisas distintos individuos que presentan el alelo correspondiente al mismo. De arriba a abajo, el primer histograma se corresponde con un carcter que se manifiesta y expresa por igual en todos los individuos, es decir, un carcter penetrante con expresividad constante. El segundo histograma hace referencia a un carcter que se manifiesta en todos los individuos pero su grado de expresin es variable, es decir, un carcter penetrante con expresividad variable. En el tercer histograma se presenta un carcter que no se manifiesta en todos los individuos (en 4 de 10 no hay manifestacin del carcter), pero cuando se expresa lo hace por igual en todos ellos, es decir un carcter con baja penetrancia (60%) y expresividad constante. Finalmente el cuarto histograma se refiere a un carcter que no se manifiesta en todos los individuos (en 3 de 10 no lo hace) y con un grado de expresi n variable, es decir un car cter con baja penetrancia (70%) y expresividad variable. En la genealoga de la derecha se presenta una familia en la que se est heredando un carcter autosmico dominante. El fenotipo normal de los individuos a y b y la aparicin del carcter en la descendencia de ambos, nos indica que se trata de un carcter con baja penetrancia.

Otro proceso capaz de alterar la expresin gnica, en este caso de genes localizados en el cromosoma X, es el fenmeno de inactivacin de dicho cromosoma que se presenta en el sexo femenino. Hombres y mujeres difieren en el nmero de cromosomas X. As, el hombre presenta una sola copia de dicho cromosoma mientras que la mujer presenta dos copias. Con el objeto de compensar la dosis de expresin de los genes localizados en el cromosoma X, durante las primeras fases del desarrollo embrionario de un zigoto femenino se inactiva de forma aleatoria el cromosoma X de origen materno o de origen paterno. Dicha inactivacin no comporta ningn cambio irreversible en el ADN sino que tan solo afecta a la expresin de los genes localizados en dicho cromosoma. El resultado es tal, que la mujer es un mosaico de expresin de los genes localizados en el cromosoma X (Figura 3). Una consecuencia directa del fenmeno de inactivacin del 2

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cromosoma X es que una mujer heterozigota para una mutacin en el cromosoma X, manifestar el alelo

m+ pm- p+ m+ pm- p+ Xm Xp m+ p JFP98 Figura 3. Inactivacin del cromosoma X. Durante las primeras etapas del desarrollo embrionario se inactivan de forma aleatoria el cromosoma X de origen materno (p+m -) o paterno (p - m+). Dicha inactivacin se mantiene en todo el linaje de cada una de las clulas. El resultado final es un mosaico de expresin en el cual cada tejido u rgano expresar los alelos situados en el cromosoma X no inactivado.

mayor de loci polimrficos repartidos a lo largo de todo el genoma humano ha permitido la aplicacin del anlisis gentico en la especie humana y con ello la caracterizacin de un importante nmero de genes implicados en patologas. Gracias a la estrecha relacin entre la ciencia bsica y su aplicacin clnica en el mbito de la gentica humana, dichos avances han sido transferidos de forma casi instantnea de los equipos de investigacin bsica a los servicios de diagnstico gentico. Un claro ejemplo de ello lo tenemos en el diagnstico de las mutaciones por tripletes inestables, en las cuales el tiempo transcurrido desde su caracterizacin hasta su utilizacin prctica puede contarse en semanas. El diagnstico molecular pretende la caracterizacin, con la mayor precisin posible, del genotipo de un individuo. Dicha caracterizacin la podemos realizar mediante dos aproximaciones bsicas, i) el diagnstico directo, mediante la deteccin del cambio producido a nivel del ADN, ii) el diagnstico indirecto, mediante el estudio de la cosegregacin del carcter estudiado y marcadores polimrficos ntimamente ligados a ste.

mutante en aquellas clulas en las que se haya inactivado el cromosoma con el alelo normal, independientemente de que dicho alelo sea dominante o recesivo. Casos espordicos. El nacimiento de un individuo afectado de una patologa hereditaria en una familia en la que dicha patologa no ha sido detectada previamente, genera serias dificultades en el momento de establecer el patrn de herencia. En primer lugar, puede tratarse de un carcter recesivo y que ambos padres sean heterozigotos y por lo tanto asintomticos, o bien, de un caso de mutacin de novo producida en la lnea germinal de uno de los padres que se manifiesta en el hijo afectado. Es obvio que el escenario es distinto en uno u otro caso. En la primera hiptesis se tratara de un carcter con un riesgo de recurrencia del 25%, mientras que en el segundo caso el riesgo de recurrencia dependera del nmero de gametos mutados presentes en el progenitor y por lo general seria mucho menor que el 25%. La mutacin de novo puede afectar a la lnea germinal o a la lnea somtica. En el primer caso, el individuo en cuestin no manifestar la enfermedad pero transmitir a su descendencia el alelo mutado. En el segundo caso, el individuo manifestar la enfermedad pero no la transmitir a su descendencia. En este ltimo caso, el grado de manifestacin depender del nmero de clulas somticas afectadas y del tipo de mutacin. Las mutaciones de novo o espontaneas son eventos poco frecuentes, sin embargo determinados genes presentan frecuencias de mutacin significativamente altas, bien porque se trata de genes grandes que ocupan cientos de kilobases y en los cuales es ms probable un evento mutacional, bien porque estn localizados en regiones hipermutables o puntos calientes del genoma. La incidencia de mutaciones de novo es importante en patologas con una herencia dominante como son la osteognesis imperfecta o la acondroplasia.

El diagnstico molecular directo

El mximo nivel de precisin del diagnstico directo se obtiene con la secuenciacin de los nucletidos correspondientes al locus mutado, sin embargo la aplicacin de esta estrategia diagnstica de forma generalizada es por el momento inviable. Por lo general el diagnstico directo de una mutacin se realiza mediante el estudio de los cambios que sta produce en la estructura primaria (secuencia), en las propiedades fisico-qumicas de la molcula de ADN o bien en los cambios que se presentan en el producto gnico (sea este ARN mensajero o protena). Bsicamente podemos distinguir cuatro tipos de cambios o mutaciones del ADN: a. cambios de nucletidos. Una base es substituida por otra distinta. Existen dos tipos de cambios, las transversiones (una purina (A o G) por una pirimidina (C o T)) y las transiciones (una pirimidina por una pirimidina o una purina por una purina), b. pequeas deleciones o inserciones. Un nmero reducido de nucletidos se pierden o insertan, alterando la secuencia y tamao de la molcula de ADN, c. grandes reorganizaciones . Ganancias, prdidas o reorganizaciones de grandes fragmentos de ADN y d. mutaciones dinmicas. Repeticin inestable de trinucletidos en distintas regiones de un gen. Los cambios de nucletidos y las pequeas deleciones o inserciones alteran la estructura primaria del ADN y pueden dar lugar a variaciones del tamao de la molcula o bien, como veremos ms adelante, prdidas o ganancias de dianas de restriccin. As mismo la molcula mutada puede presentar variaciones en sus propiedades fisico-qumicas que alteren su movilidad electrofortica o sus propiedades de apareamiento complementario. Las grandes reorganizaciones y las mutaciones dinmicas provocan generalmente variaciones en el tamao de la molcula de ADN. Finalmente, las mutaciones pueden ser detectadas en el producto gnico cuando estas dan lugar a mensajeros inestables o de tamao distinto o bien a protenas truncadas. 3

El diagnstico molecular
Sin duda alguna, la aplicacin en gentica humana de la tecnologa del ADN recombinante y de los mtodos de amplificacin enzimtica de cidos nucleicos han supuesto una autntica revolucin metodolgica. Paralelamente a este desarrollo tecnolgico, el aislamiento y la caracterizacin de un nmero cada vez

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Herramientas y metodologas para la deteccin de mutaciones

Las tcnicas y protocolos utilizados en el diagnstico molecular se circunscriben en el mbito de la biologa molecular bsica. No estamos hablando de una tecnologa excesivamente compleja y de hecho cualquier laboratorio de biologa molecular est capacitado tcnicamente para llevar a cabo este tipo de anlisis. Bsicamente las tcnicas comunes a todos los laboratorios de diagnstico molecular son: a. los enzimas de restriccin, b. las tcnicas de separacin electrofortica de cidos nucleicos, c. la hibridacin de cidos nucleicos y d. la amplificacin enzimtica del ADN (PCR) Brevemente discutiremos cada una de esta tcnicas. Los enzimas de restriccin (ER). Los ER son protenas que reconocen secuencias concretas del ADN, denominadas dianas de restriccin y tienen actividad endonucleasas (cortan la doble hlice del ADN). Existen distintos tipos de ER segn sea el tipo de secuencia reconocida y el lugar de corte. Las que tienen una aplicacin ms generalizada en el diagnstico molecular son las de tipo II, que reconocen secuencias palindrmicas de entre 4 y 8 nucletidos (secuencias que se leen igual de izquierda a derecha que de derecha a izquierda) y cortan el ADN en dicha secuencia (Figura 4). Este tipo de enzimas tiene una total especificidad por la secuencia diana y el cambio de un solo nucletido en esta produce la prdida de reconocimiento. Las mutaciones debidas a variaciones nucleotdicas o las pequeas deleciones o inserciones pueden producir la prdida de una diana o la aparicin de una nueva diana donde antes del cambio esta no exista.

Cadena sencilla

Cadena sencilla

RENATURALIZACIN

DESNATURALIZACIN

Cadena doble Concentracin salina

Cadena doble Formamida Temperatura JFP98

Figura 5. Hibridacin de cidos nucleicos. Procesos de desnaturalizacin y renaturalizacin. Vase el texto para explicacin.

negativamente. Para inducir el desplazamiento a travs de la matriz se aplica un campo elctrico y las molculas se desplazan hacia el polo positivo. Dado que la carga neta de cada molcula es la misma, sea cual sea su tamao, el nico parmetro discriminatorio es el tamao del poro de la matriz utilizada. El resultado final es la separacin de las molculas de ADN en funcin de su tamao. Las molculas ms pequeas pasarn ms fcilmente a travs del poro mientras que las grandes quedarn retenidas. Hibridacin y transferencia de cidos nucleicos. Una de las caractersticas ms singulares de la molcula de ADN es la complementariedad de bases. La doble hlice de ADN est formada por dos cadenas antiparalelas en las que las bases nitrogenadas estn apareadas de forma que una adenina (A) est siempre frente a una timina (T) y una citosina (C) est siempre frente a una guanina(G). La unin entre las bases se establece mediante puentes de hidrgeno, dos en el par AT y tres en el par GC que confieren a la doble hlice una alta estabilidad. Experimentalmente podemos separar las dos cadenas, proceso que denominamos desnaturalizacin, aplicando energa en forma de calor, rompiendo los enlaces qumicamente o disminuyendo la concentracin salina (Figura 5). Modificando estos parmetros en sentido opuesto podremos renaturalizar dos molculas de cadena sencilla y obtener una cadena doble. El proceso de renaturalizacin depender fundamentalmente de la complementariedad de bases que presenten las dos cadenas sencillas. La identificacin de secuencias de ADN mediante la tcnica de hibridacin consiste en obtener un fragmento de ADN (sonda) de secuencia complementaria a la regin a identificar y marcarla enzimtica o radioactivamente.

Figura 4. Los enzimas de restriccin (ER). En la figura se presenta la actividad endonucleasa de los ER Taq I (obtenida de la bacteria termfila Thermus aquaticus) y EcoR V (obtenida de la enterobacteria Escherichia coli). Ambos enzimas tienen especificidadpara la secuencia reconocida (diana) y cortan a la misma liberando fragmentos con extremos cohesivos o romos respectivamente.

La hibridacin de ambas molculas, sonda y secuencia a detectar, puede realizarse en solucin o bien con una de ellas fijada a un soporte slido. En ste ltimo caso el soporte suele ser un filtro de nitrocelulosa o nylon. Las molculas de cidos nucleicos se absorben pasivamente al filtro y posteriormente son fijadas mediante luz ultravioleta. Los fragmentos de ADN separados en un gel de agarosa o acrilamida, pueden ser transferidos y fijados a un filtro de nitrocelulosa o nylon para ser detectados mediante una sonda. El sistema de transferencia, conocido como mtodo Southern, permite obtener en el filtro una rplica exacta del gel. Amplificacin enzimtica de ADN . La amplificacin enzimtica del ADN consiste en la obtencin de copias de una secuencia especfica de ADN mediante una reaccin 4

Separacin electrofortica de cidos nucleicos. El mtodo ms comn y eficaz de fraccionar molculas de ADN en funcin de su tamao es la electroforesis en soporte de agarosa o acrilamida. En ambos casos las molculas de ADN (o ARN) se aplican a una matriz semislida, generalmente un polmero de agarosa o acrilamida, que acta como cedazo restringiendo el paso de las molculas en funcin de su tamao. La electroforesis se realiza en un tampn a pH bsico de forma que las molculas de ADN estn cargadas

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en cadena de la ADN polimerasa (PCR). Dicha metodologa ha supuesto una autntica revolucin en el campo de la biologa y gentica molecular y su aplicacin en el diagnstico gentico es en la actualidad imprescindible.

oligonucletidos

Desnaturalizacin

Apareamiento

Extensin
JFP98

Aprovechando esta circunstancia se ha diseado un mtodo muy sencillo para detectar la mutacin. Como se indica en la Figura 7, la secuencia normal del gen de la -globina en los codones 5, 6 y 7 (cct gag gag) incluye la diana para el enzima Mst II (cctgagg). Dicha diana se pierde con la mutacin que causa anemia falciforme al pasar a ser (cctgtgg). Flanqueando a esta diana existen dos dianas para el mismo enzima: una a 1,2 kb y otra a 0,2 kb de distancia. La digestin del ADN genmico de un individuo con el enzima Mst II, dar lugar a miles de fragmentos entre los cuales estarn los correspondientes al locus de la -globina. Podemos ahora separar todos los fragmentos segn su tamao en un gel de agarosa y transferir el resultado a un filtro de nitrocelulosa. Utilizando una sonda complementaria al fragmento de 1,2 kb, podremos detectar aquellos fragmentos de ADN que contengan la secuencia complementaria a la sonda (vase parte inferior de la Figura 7). Si un individuo es homozigoto para el alelo normal de la -globina, el nico fragmento que ser detectado por la sonda ser el de 1,2 kb. Si el individuo es portador del alelo de anemia falciforme detectaremos dos fragmentos: el de 1,2 kb y el de 1,4 kb, uno proveniente del cromosoma que tiene la secuencia normal (con diana) y el otro proveniente del cromosoma con la secuencia de la anemia falciforme (sin diana). Finalmente, en un individuo homozigoto para la anemia falciforme solo detectaremos el fragmento de 1,4 kb.
1,2 kb
cctgAggag ggacTcctc cctgAggag ggacTcctc

Figura 6. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Vase texto para explicacin.

Las ADN polimerasas son los enzimas que llevan a cabo la replicacin del ADN. Para ello precisan de una molcula de ADN de cadena sencilla que acte como molde, un cebador (pequea molcula de cido nuclico de unos 15 a 20 nucletidos) de secuencia complementaria a la cadena a sintetizar y nucletidos activados para ser incorporados en la cadena naciente. Para amplificar cclicamente una determinada secuencia de ADN deberemos disponer de cebadores (tambin denominados oligonucletidos) que flanqueen los extremos de la regin que deseamos amplificar (ver Figura 6). Incrementando la temperatura por encima de los 90 C obtendremos cadenas sencillas de ADN que actuarn como molde en la reaccin de amplificacin. Para favorecer el apareamiento del cebador con su secuencia complementaria bajaremos la temperatura hasta un valor preestablecido y especfico para cada oligonucletido, a la cual el cebador se aparear con su secuencia complementaria. Utilizando como anclaje al cebador apareado, la ADN polimerasa iniciar la extensin de la cadena. El ciclo se iniciar de nuevo con la desnaturalizacin por calor de la molcula recin sintetizada. La repeticin de este proceso entre 20 o 30 veces nos permitir obtener millones de copias de la secuencia inicial. El enzima utilizado para esta reaccin es una ADN polimerasa resistente a temperaturas elevadas obtenida de bacterias termfilas ( Thermus aquaticus).

0,2 kb
cctgAggag ggacTcctc

Mutacin de anemia falciforme

Mst II
cctgAggag ggacTcctc

Mst II
cctgTggag ggacAcctc cctgAggag ggacTcctc

1,4 kb Normal Portador Afectado 1,4 kb 1,2 kb

JFP98

Figura 7. Deteccin de la mutacin que causa anemia falciforme mediante digestin c o n e l e n z i m a Mst I I . V ase texto para explicacin.

Mtodos de deteccin directa de mutaciones

Veremos a continuacin mediante algunos ejemplos como se aplican estas tcnicas bsicas en el diagnstico gentico. Deteccin directa de una mutacin que altera una diana de restriccin. La anemia falciforme es una enfermedad autosmica recesiva con una alta prevalencia en determinadas regiones geogrficas. Los pacientes afectados por esta patologa presentan en homozigosis la substitucin de una glutamina por una valina en el tercer aminocido de la -globina ( S). Dicha mutacin se corresponde con el cambio de una adenina por una timina en el codn 6 de dicho gen que al mismo tiempo altera la diana de restriccin para el enzima MstII.

Una variacin del mtodo anterior se presenta en la Figura 8. La aplicacin de la tcnica de PCR facilita enormemente la deteccin de mutaciones en las que varia una diana de restriccin. El mtodo consiste en obtener oligonucletidos que flanquean la mutacin y mediante PCR obtener millones de copias de dicha regin. Seguidamente los fragmentos amplificados se ponen en presencia del enzima en cuestin, en nuestro caso Mst II. Si el ADN proviene de un individuo normal todos los fragmentos amplificados presentarn la diana para el enzima y por lo tanto despus de la digestin obtendremos dos subfragmentos (en el ejemplo, del fragmento amplificado de 300 pb se obtendrn dos subfragmentos: uno de 200 y otro de 100 pb). Si el ADN proviene de un individuo afectado todos los fragmentos amplificados tendrn la secuencia que no es reconocida por el enzima y por lo tanto la digestin no alterar su tamao (todos continuarn siendo de 300 pb). Finalmente, si el ADN proviene de un individuo 5

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heterozigoto los fragmentos amplificados sern de dos clases, con la secuencia diana o sin dicha secuencia. La digestin de los primeros dar lugar a dos fragmentos de 200 y 100 pb, mientras que los segundos mantendrn el tamao de 300 pb despus de la digestin. La resolucin en un gel de agarosa de cada una de estas muestras se presenta en la parte inferior de la Figura 8.
Secuencia normal
cctgAggag ggacTcctc

Secuencia mutante
cctgTggag ggacAcctc

Reaccin de PCR
A T A T T A T A T A T A

A T

A T

Digestin con enzima Mst II

+
Normal Portador Afectado
300 pb 200 pb 100 pb

JFP98

Figura 8. Deteccin de la mutacin de anemia falciforme mediante PCR y digestin con el enzima Mst II. Vase texto para explicacin.

Deteccin directa de la secuencia mutada.- Cuando la mutacin ha sido caracterizada y se conoce su base molecular es posible disear estrategias diagnsticas basadas en la deteccin de la secuencia mutada. Se han descrito distintos mtodos de deteccin directa, de entre los cuales comentaremos la deteccin mediante oligonucletidos especficos de alelo ( ASO, del ingls alelle specific oligonucleotides ). Un ejemplo de este mtodo lo tenemos en la Figura 9 donde se presenta la deteccin de mutaciones en el gen de la fibrosis qustica. La fibrosis qustica (CF) es una grave enfermedad hereditaria con una alta incidencia en la poblacin caucasiana. En esta enfermedad las funciones de pulmones y pncreas estn alteradas por un aumento en las secreciones de dichos rganos. Los pacientes afectados manifiestan los sntomas propios de la CF, alteraciones en las vas respiratorias e infecciones recurrentes, durante el primer ao de vida vindose muy afectada su calidad y esperanza de vida. Se han descrito numerosas mutaciones del locus CF, siendo la ms frecuente la delecin de tres nucletidos (CTT) que supone la prdida del aminocido 508 de la protena CFTR (mutacin 508). Segn el rea geogrfica un 6570% de los alelos mutados corresponden a 508. El 30% restante corresponde a alelos con una frecuencia no superior al 3%. La problemtica derivada de la existencia de un gran nmero de mutaciones para un determinado locus (heterogeneidad allica) es comn a muchas enfermedades hereditarias. En estos casos puede resultar ms apropiado el diagnstico indirecto mediante polimorfismos annimos (ver ms adelante). Sin embargo, en el caso de la CF, dada su alta incidencia y la prevalencia de la mutacin 508 se han puesto a punto mtodos de deteccin directa como el ASO. El mtodo consiste en el diseo de oligonucletidos con la secuencia correspondiente a cada uno de los alelos descritos para CF, incluyendo como control a la secuencia normal. Cada mutacin puede estar localizada en una regin distinta del gen. En la Figura 9 se

presentan 4 mutaciones situadas en cuatro exones distintos. De cada mutacin se dispone de la secuencia y de cebadores que permiten amplificar el exn correspondiente. Despus de obtener ADN de cada uno de los pacientes, mediante los cebadores apropiados se realiza una PCR para cada exn. Esta reaccin se realiza en un solo tubo de forma que se obtiene una mezcla de todos los exones amplificados. La muestra as obtenida se aplica por duplicado a un filtro de nylon y el ADN se fija mediante luz UV. Seguidamente el filtro se hibrida con el ASO correspondiente a cada mutacin y a su control normal, marcados previamente de forma enzimtica, con fluorescencia o radioactividad. Despus del revelado apropiado obtendremos una seal positiva que nos revelar los alelos presentes en cada paciente. En el ejemplo de la Figura 9, el paciente 1 es heterozigoto para la mutacin 508, pues da positivo para el ASO del alelo normal de todas las mutaciones y tambin para el ASO del alelo 508. El paciente 2 es homozigoto para la mutacin 508, pues en el filtro de dicha mutacin solo obtenemos seal positiva para el ASO del alelo 508. Los pacientes 3, 4 y 5 son heterozigotos compuestos para las mutaciones 508 - W1282X , 508 - R177H y 508 R553X respectivamente. Finalmente el paciente 6 da positivo para todos los ASO normales y negativo para las cuatro mutaciones. Ello nos indica que debe presentar una mutacin distinta a las estudiadas. Ms all del inters acadmico por conocer que mutacin est presente en un paciente, el inters del diagnstico especfico del alelo o alelos mutados reside en la relacin existente entre dicho alelo y la manifestacin clnica de la enfermedad. No son muchas las enfermedades en las cuales se ha podido establecer este tipo de correlacin, pero en el caso de la CF se ha podido demostrar que los pacientes homozigotos para la mutacin 508 presentan insuficiencia pancretica mientras que los heterozigotos compuestos R117H / 508 tienen una funcin pancretica normal.

Figura 9. Detecci n de mutaciones en el gen de la fibrosis qustica mediante oligonucletidos especficos de alelo. Vase texto. ( cebadores).

Deteccin de mutaciones por delecin .- Las mutaciones que suponen una prdida de nucletidos en la secuencia de ADN son fcilmente detectadas mediante PCR. Un ejemplo de aplicacin lo tenemos en la deteccin de mutaciones en el gen de la distrofia muscular de Duchenne (DMD). Esta enfermedad presenta una herencia ligada al cromosoma X por lo que su frecuencia es muy superior en hombres que en mujeres. Se caracteriza por la prdida 6

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progresiva del tono muscular que se manifiesta desde el primer ao de vida. Los nios afectados de DMD tienen problemas para mantenerse derechos y correr. A edades ms avanzadas la musculatura se debilita presentndose paradas cardacas y parlisis. La esperanza de vida no supera los 25 aos. Existe una manifestacin ms benigna conocida como distrofia muscular de Becker. El diagnstico de la enfermedad puede realizarse mediante la determinacin de la actividad creatinin fosfoquinasa, muy elevada en los pacientes con DMD y por biopsia muscular para visualizar al microscopio la estructura degenerativa de las clulas musculares. Cuando se pretende un diagnstico prenatal, no es posible aplicar la estrategia anterior y ste debe realizarse mediante el anlisis del genotipo.

Tabla I. Patologas neurolgicas causadas por mutaciones inestables

Herencia X Frgil Distrofia Miotnica Atrofia muscular espinal Enfermedad de Huntington Atrofia dentatorubral Ataxia espinocerebelosa 1 Enfermedad de Machado-Joseph XD AD XD AD AD AD AD Repeticin Regin CGG CTG CAG CAG CAG CAG CAG 5 nc 3 nc exn 5 nc exn exn exn Normal 6-46 5-40 17-26 13-35 7-23 19-37 13-16 Premutacin Mutacin 50-200 50-80 > 200 > 100 40-52 36-120 49-75 39-63 68-79

Ataxia de Friedreich AR GAA intrn 7-22 200-1200 nc no codificante, XD ligada al X dominante, AD autosmica dominante, AR autosmica recesiva

metodologa diagnstica. Sin embargo, su carcter invasivo y elevado coste econmico hacen que sea substituida por el diagnstico gentico. En la Figura 10 se presenta un esquema de la estrategia de multiplex PCR desarrollada para la deteccin simultnea de distintas deleciones en el gen DMD en varones afectados. Mediante la utilizacin de parejas de cebadores, previamente optimizados, se amplifican de forma simultnea distintos exones del gen DMD. El resultado de cada PCR mltiple se analiza en un gel de agarosa obtenindose un patrn de bandas del cual es posible inferir las regiones delecionadas. Una vez se han determinado cuales son los exones delecionados es posible definir en cada paciente los extremos de la delecin y estimar as el comportamiento clnico esperado de dicho paciente. El mtodo de PCR mltiple tiene una proporcin muy baja de errores de diagnstico, es muy verstil, rpido (en tan solo un da es posible analizar varios individuos) y barato. As mismo, las cantidades de ADN necesarias para el anlisis son muy reducidas por lo que su aplicacin es posible tanto en el diagnstico postnatal como en el prenatal. Deteccin de mutaciones inestables.- A principios de los aos 90 se identific un nuevo tipo de mutacin conocida como mutacin inestable, producida por la expansin de unidades de repeticin de tres nucletidos. En la actualidad, se han identificado ms de 50 genes eucariotas que presentan este tipo de repeticiones, entre los cuales se encuentran genes humanos responsables de un nmero importante de patologas neurolgicas (Tabla I). Este nuevo tipo de mutacin presenta diversas caractersticas: a. la repeticin es polimrfica y se presenta tanto en individuos sanos como en afectados, siendo el nmero de repeticiones como mnimo de entre 2 y 5 veces superior en los afectados que en los sanos. b. el nmero de repeticiones puede variar, expandirse o, en algunos casos contraerse de generacin en generacin. En algunas de las patologas implicadas se observa una progresin partiendo de un nmero de rango normal, pasando por una premutacin de rango intermedio y finalmente una mutacin completa. c. en varias de las patologas se encuentra una fuerte correlacin entre el nmero de repeticiones y distintos parmetros clnicos como la edad de manifestacin (fenmeno conocido como anticipacin) o el tipo de presentacin clnica (gravedad, rganos o tejidos afectados, etc.). d. todas las mutaciones inestables con carcter patolgico identificadas hasta el momento, afectan de forma directa o indirecta al sistema nervioso o 7

Figura 10. Multiplex PCR. Deteccin de mutaciones por delecin en el locus DMD. Utilizando los oligonucletidos indicados en la parte superior de la figura (puntas de flecha) se amplifican, en una sola reaccin, distintos exones del gen DMD. Los primeros carriles corresponden a controles, un estandar d e fragmentos amplificados, un control negativo de la PCR en el cual no se aade ADN y un control positivo de un individuo con el alelo normal. De 1 a 5 son varones afectados de DMD. El paciente 1 presenta una delecin de los exones b y c. El paciente 2 presenta una delecin desde el exn b al exn f. El paciente 3 presenta una delecin de toda la regin analizada. El paciente 4 tiene delecionado el exn a y finalmente el paciente 5 ha perdido los exones d y e.

El gen DMD es el gen humano de mayor tamao hasta ahora caracterizado. El locus DMD ocupa ms de 2 megabases de ADN que dan lugar a un trnscrito de 13 kb. La protena denominada distrofina tiene un total de 3.685 aminocidos y presenta una estructura repetitiva. El anlisis molecular del gen DMD ha revelado que un nmero importante de mutaciones se producen por deleciones distribuidas a lo largo del locus, presentndose tanto pequeas como grandes prdidas de ADN (2/3 de los varones afectados presentan delecin). No se ha detectado ninguna correlacin entre el tamao de la delecin y su manifestacin en forma de distrofia muscular de tipo Duchenne o de tipo Becker. Sin embargo, s que existe una clara correlacin entre la ausencia de distrofina y manifestacin en la forma grave de distrofia muscular de Duchenne. As pues, las deleciones que causan una prdida total del producto gnico presentan una manifestacin clnica mucho ms grave (Duchenne) que aquellas que respetando la pauta de lectura, dan lugar a la sntesis de una protena anmala (Becker). La deteccin de distrofina en biopsia muscular, mediante la utilizacin de anticuerpos especficos, es una buena

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neuromuscular. La mayora comparten el patrn de herencia dominante, salvo la ataxia de Friedriech que lo presenta recesivo. La repeticin puede localizarse tanto en regin codificante (exones) o no codificante (regin 5, regin 3 o intrones), por lo que sus efectos pueden ir desde alteraciones en la expresin del gen hasta la abolicin del producto gnico. El diagnstico molecular de este tipo de mutaciones tiene un alto inters dado que el tamao de la repeticin permite extrapolar una parte importante del comportamiento clnico del paciente. Durante los ltimos aos se han estandarizado diversos mtodos de deteccin basados en las tcnicas de Southern (hibridacin y deteccin mediante una sonda) o PCR (Figura 11). La aplicacin del mtodo Southern (Figura 11, izquierda), la deteccin se realiza mediante una sonda de ADN homloga a una secuencia adyacente a la regin repetida. Se obtiene ADN genmico del paciente y se digiere con un enzima de restriccin con dianas que flanquean al locus inestable. Una vez digerido se fracciona en un gel de agarosa y ste se transfiere a un filtro de nitrocelulosa. El filtro se hibrida con la sonda para detectar los fragmentos que contienen la regin inestable. El tamao de los fragmentos detectados es del orden de kilobases.

heterogeneidad en su definicin. Esto es as debido por una parte al polimorfismo en el nmero de repeticiones y por otra a los errores de la DNA polimerasa. Deteccin de nuevas mutaciones .- Hasta el momento hemos presentado diversas estrategias diagnsticas para la deteccin de mutaciones previamente caracterizadas, sin embargo en la rutina diaria del laboratorio de diagnstico gentico se plantea con frecuencia la identificacin de mutaciones que bien por ser desconocidas o bien por ser poco prevalentes, precisan de una aproximacin diagnstica diferente. Probablemente ste es el mbito del diagnstico gentico que ms vinculacin tiene con la investigacin bsica, confundindose en numerosas ocasiones una con la otra. Las distintas estrategias de deteccin de nuevas mutaciones pueden ser agrupadas en tres grandes apartados: a. deteccin de variaciones en el apareamiento entre las cadenas normal y mutada. b. deteccin de cambios de conformacin y c. deteccin de productos gnicos alterados En el primer grupo se incluyen dos mtodos ampliamente utilizados como son el anlisis de heteroduplex y la digestin qumica de cadenas con apareamientos errneos (CCM, del ingls chemical cleavage of mismatch). En ambos mtodos el cambio o mutacin se detecta mediante la hibridacin en solucin de la cadena normal (N) y la cadena mutada ( m) obtenidas previamente mediante PCR. Molculas de ADN que corresponden a la secuencia de la cadena mutada (mm) se mezclan con molculas de ADN que corresponden a la secuencia de la cadena normal (NN). Despus de la desnaturalizacin por calor de ambas cadenas se permite su renaturalizacin. Si existe alguna diferencia en la secuencia de nucletidos entre ambos tipos de cadenas, adems de los hbridos NN y mm (homoduplex), tambin se formarn hdridos del tipo Nm (heteroduplex) que presentarn errores de apareamiento. En el mtodo de heteroduplex los hbridos se analizan en un gel de acrilamida y las diferencias entre ellos se visualizan por la aparicin de un patrn de bandas anmalo. En el mtodo CCM los hbridos son tratados con un reactivo qumico (por ejemplo tetrxido de osmio) que cortan a la doble cadena de ADN en regiones de apareamiento errneo. La aparicin de fragmentos de degradacin ser indicacin de la existencia de una variacin entre la cadena normal y la mutada. De los mtodos de anlisis de cambios de conformacin, destaca por su versatilidad, economa y aceptacin generalizada el anlisis de conformacin de cadena sencilla ( SSCP, del ingls single-strand conformation polymorphism). El mtodo SSCP se fundamenta en los cambios de conformacin que presentan dos cadenas sencillas de ADN que difieren entre s en un nico nucletido. Dichos cambios de conformacin se pueden poner de manifiesto en un gel de acrilamida por la aparicin de un patrn de bandas diferencial. El mtodo es muy resolutivo y su aplicacin es tcnicamente simple. Algunas de las limitaciones de la tcnica son: a. las condiciones de la electroforesis (temperatura y concentracin de aditivos como glicerol o sacarosa) deben ser determinadas empricamente, b. el tamao de la molcula a analizar no puede exceder los 300-350 pares de bases (pb) y c. presenta una sensibilidad inferior al 100% 8

Figura 11. Deteccin de mutaciones dinmicas mediante PCR o hibridacin. Vese texto para explicacin. N, normal; P, premutacin; M, mutacin.

Para la aplicacin de la tcnica de PCR en el diagnstico de las mutaciones inestables se utilizan cebadores que flanquean la regin amplificada (figura 11, derecha). El producto de la amplificacin, cuyo tamao puede estar en el rango de unos cientos de pares de bases, se aplica a un gel de agarosa o acrilamida con el objeto de determinar el tamao de cada fragmento. Tal y como se presenta en la figura es posible detectar los fragmentos amplificados de individuos normales o en aquellos que presentan premutacin, sin embargo puede suceder que no se detecte el fragmento procedente de un individuo con la mutacin completa. Esto es as debido a que la DNA polimerasa puede tener problemas al intentar amplificar los tamaos del orden de kilobases (Kb) que se presentan en el cromosoma con la mutacin completa. En el esquema tambin puede observarse que las bandas amplificadas mediante PCR tienen una cierta

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A pesar de estas limitaciones es una tcnica ampliamente utilizada como primera aproximacin al estudio y caracterizacin de nuevas mutaciones. Su aplicacin en la deteccin rutinaria de nuevas mutaciones consiste bsicamente en amplificar mediante PCR fragmentos de 200 pb del locus a estudiar. Los productos de amplificacin se desnaturalizan por calor y se analizan en un gel de acrilamida juntamente con un control de secuencia normal. La aparicin de un patrn de bandas anmalo es indicativo de un posible cambio nucleotdico. Dicho cambio ser posteriormente confirmado mediante la secuenciacin del fragmento cuyo patrn se ha visto alterado.

Para finalizar comentaremos el test de protena truncada (PTT, del ingls protein truncation test), como modelo de los mtodos basados en el estudio de modificaciones en el producto gnico. El test PTT es un mtodo de reciente aplicacin diseado de forma especfica para detectar mutaciones que causan la aparicin de un codn de paro prematuro en la molcula de ADN. Es un mtodo tcnicamente complejo, muy sensible para este tipo de mutaciones pero inaplicable para la deteccin de otro tipo de variaciones del ADN. El mtodo consiste en la amplificacin mediante PCR de distintas regiones del locus a analizar, utilizando cebadores que adems de contener la secuencia homloga del fragmento a amplificar contienen en pauta de lectura, la secuencia del lugar de iniciacin de la transcripcin para la RNA polimerasa de T7 y un codn ATG de iniciacin. Los fragmentos amplificados se utilizan como moldes en una reaccin de transcripcin in vitro utilizando la RNA polimerasa de T7. As se obtienen molculas de RNA que son simultneamente traducidas a protena en presencia de un aminocido marcado. Las protenas obtenidas son analizadas en un gel de acrilamida-SDS que permite detectar su tamao. La aparicin de protenas con un tamao inferior al esperado respecto a un control de secuencia normal, ser indicativo de la existencia de una mutacin de codn de paro prematuro en la molcula analizada. Adems de los mtodos aqu descritos, existen innumerables estrategias diseadas para la deteccin de nuevas mutaciones que son el fruto, en muchas ocasiones, de la capacidad imaginativa del investigador. As mismo, numerosas casas comerciales han puesto en el mercado adaptaciones y protocolos estandarizados para la deteccin de mutaciones, basados en algunos de los mtodos aqu comentados.

Figura 12. Deteccin de variantes polimrficas mediante PCR y polimorfismo de cadena sencilla (SSCP). Vase texto para explicacin.

La simplicidad del mtodo permite tambin su aplicacin en la deteccin de variantes polimrficas del tipo SNP (ver ms adelante). En la Figura 12 se presenta un ejemplo de la aplicacin de la tcnica de SSCP en la deteccin de una variacin polimrfica del extremo 3 del locus del receptor de la vitamina D. Dicho polimorfismo altera la diana de restriccin del enzima BsmI, al cambiar la secuencia ACATTC (alelo B) por GCATTC (alelo b). Mediante oligonucletidos sintticos que flanquean el locus polimrfico se obtienen fragmentos de ADN de 192 pb. Los productos de amplificacin se desnaturalizan para obtener cadenas sencillas de ADN y estas se resuelven a temperatura ambiente en un gel de acrilamida. El patrn de bandas obtenido ser distinto en funcin del genotipo del paciente. Si ste es homozigoto para la secuencia correspondiente a la diana (BB), se obtienen tres bandas: dos de cadena sencilla correspondientes a cada una de las cadenas complementarias y una banda, localizada en la parte inferior del gel en la Figura 12, que corresponde a la cadena doble no desnaturalizada. El mismo nmero de bandas aparecern en un paciente homozigoto para el alelo b (ausencia de diana en homozigosis), pero en este caso y dado que cada cadena complementaria difiere de las anteriores en un nucletido, la posicin en el gel es distinta. Finalmente el heterozigoto presentar, como en los casos anteriores, una banda procedente de la cadena doble no desnaturalizada y cuatro bandas correspondientes a las cuatro cadenas sencillas.

El diagnstico indirecto
El diagnstico indirecto es independiente del conocimiento previo de la naturaleza molecular de la mutacin a diagnosticar y para llevarlo a cabo solo es preciso conocer la localizacin cromosmica del locus implicado. Dicha estrategia consiste en estudiar, en la familia del propositus, la segregacin conjunta de la enfermedad y secuencias polimrficas fsicamente prximas (ligadas) al locus de la misma. El ADN es una molcula lineal en la que las secuencias de nucletidos se hallan contiguas y distribuidas a lo largo de la doble hlice en un mundo de una dimensin. Existe pues una relacin fsica de proximidad entre secuencias de ADN. Dicha relacin de continuidad puede alterarse durante el proceso de la divisin meitica que se presenta durante la formacin de las clulas germinales. En la profase de la primera divisin meitica, los cromosomas homlogos (uno proveniente de la lnea paterna y el otro de la lnea materna) intercambian material por el proceso de entrecruzamiento. El resultado final es tal que los cromosomas de la clula germinal madura (espermatozoide u vulo) presentan nuevas combinaciones de las secuencias existentes en la clula original (nuevos recombinantes). Dada la relacin fsica existente entre secuencias adyacentes en un mismo cromosoma, la frecuencia en que dos de estas secuencias se transmiten (segregan) juntas de una generacin a la siguiente es inversamente proporcional a 9

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la distancia que las separa. Es decir, cuanto menor es la distancia que separa a dos secuencias de ADN, menos probable es el entrecruzamiento entre ellas y por lo tanto segregan juntas con una mayor frecuencia. Cuando se da esta situacin decimos que ambas secuencias estn ligadas.

hablar de los alelos de loci implicados en enfermedades (el alelo 508 de la fibrosis qustica o el alelo S de la anemia falciforme). Sin embargo, este tipo de alelos son, afortunadamente, muy poco frecuentes y no nos seran tiles en los estudios de ligamiento. Por el contrario las secuencias annimas o loci polimrficos presentan por definicin varios alelos con una frecuencia significativamente alta en la poblacin (superior al 1% para el menos frecuente). Supongamos que queremos saber si el locus a, que est implicado en una enfermedad hereditaria, esta ligado al locus b, que es una secuencia annima de ADN. Lo primero que necesitaremos ser identificar las variantes de la secuencia annima en cada uno de los miembros de la familia y estudiar su segregacin juntamente con la de la enfermedad. La aplicacin de diversos mtodos estadsticos nos permitir establecer la existencia o no de ligamiento entre los dos loci investigados y estimar la distancia que los separa. En los estudios de ligamiento la distancia que separa a dos loci se mide en funcin de la frecuencia en que ambos recombinan. La unidad de distancia es el centimorgan (cM) . Si dos loci recombinan en el 1% de las meiosis, decimos que les separa una distancia de 1 cM. La frecuencia de recombinacin entre dos loci puede variar desde 0 (decimos entonces que dichos loci estn ntimamente ligados) hasta el 50% y decimos entonces que son independientes. Aunque no nos podemos extender aqu sobre este aspecto, no existe siempre una relacin lineal entre distancia gentica (frecuencia de recombinacin medida en cM) y distancia fsica (nmero de nucletidos que las separan, medida en pares de bases). Para frecuencias de recombinacin inferiores al 20% se puede establecer una relacin de 106 pares de bases por cada 1% de recombinacin. Tipos de annimas variacin polimrfica en secuencias

Figura 13 .- Polimorfismosdel tama o de fragmentosde restriccin (RFLP). La prdida o ganancia de una diana de restriccin por efecto de la substitucin de un nucletido (A), o la insercin o delecin de un fragmento de ADN (B), pueden ser detectados por las variaciones en los tamaos de los fragmentos de restriccin. En la figura se presenta el resultado esperado de este tipo de polimorfismos en individuos homozigotos para la presencia de la diana o la delecin (+ +), los homozigotos para la ausencia de diana o la insercin (- -) y los heterozigotos (+ -). El mtodo de detecci n puede ser tanto hibridaci n y southern (esquematizado en la figura) como mediante PCR.

El ligamiento entre secuencias de ADN se establece mediante el estudio de la segregacin de los alelos de dichas secuencias en genealogas. Este tipo de estudios permiten la obtencin del mapa gentico de una determinada regin cromosmica. Dicho mapa contendr puntos de referencia al estilo de un mapa de carreteras. As, mientras que el mapa de carreteras nos informa de la posicin de pueblos y ciudades, el mapa gentico contendr informacin sobre la posicin de los genes. Adems de pueblos y ciudades el mapa de carreteras contiene otros puntos de referencia orientativos como pueden ser un cruce de carreteras, un puerto de montaa o una vista panormica. Dichos puntos de referencia son fundamentales para orientarse a lo largo de la carretera. Su equivalente en el mapa gentico sern por ejemplo los puntos de rotura de una determinada translocacin o las secuencias polimrficas repartidas a lo largo de la molcula de ADN..

Hemos indicado que la caracterstica primordial de las secuencias annimas es su variabilidad, veamos ahora en que consiste dicha variabilidad. Bsicamente existen dos tipos de polimorfismos, los que derivan de la substitucin de un nucletido por otro (polimorfismos SNP, del ingls single nucleotide polymorphism) y los que derivan de la insercin o delecin de secuencias de ADN. En estos ltimos distinguimos dos subtipos: las inserciones o deleciones de fragmentos de ADN y las repeticiones de secuencias de entre dos y cientos de nucletidos. Polimorfismos del tamao de los fragmentos de restriccin (RFLP del ingls restriction fragment length polymorphism).- Cuando el cambio de un nucletido altera la diana para un determinado ER o la insercin o delecin de un fragmento de ADN se localiza entre dos dianas de un ER, podemos detectar el polimorfismo en funcin de la variacin que ste genera en el patrn de restriccin (Figura 13). Los RFLP son polimorfismos que presentan normalmente un nmero bajo de alelos y por lo tanto su utilizacin en el diagnstico indirecto es limitada. Polimorfismos de repeticin.- Existen dos tipos de polimorfismos de repeticin de uso en diagnstico gentico, los VNTR-minisatlites y los VNTRmicrosatlites. En ambos casos presentan un nmero variable de repeticiones en tndem (VNTR del ingls variable number of tandem repeats). Los minisatlites son loci que corresponden a secuencias de ADN de unas pocas decenas de nucletidos repetidas 10

Secuencias polimrficas
Como su nombre indica, las secuencias polimrficas (tambin conocidas como secuencias annimas, loci annimos, loci polimrficos, marcadores annimos o marcadores polimrficos) son secuencias de ADN que, normalmente, no codifican para un producto gnico, se distribuyen de forma ms o menos aleatoria a lo largo del genoma y presentan como caracterstica singular el hecho de ser polimrficas. Este ltimo hecho es de suma importancia pues confiere a este tipo de secuencias la caracterstica primordial del anlisis gentico, la variabilidad. Las variantes de un locus es lo que conocemos como alelos. Ya hemos utilizado este concepto anteriormente al

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en tndem. El nmero de dichas repeticiones varia de cromosoma a cromosoma, de forma que en un cromosoma el nmero de repeticiones en tndem puede ser de 10, en otro de 15 en otro de 22, etc, etc. La singularidad ms especial de este tipo de polimorfismos est en que cada loci puede presentar muchos alelos distintos (tantos como repeticiones), sin embargo presentan el inconveniente que no estn distribuidos por todo el genoma y por lo tanto solo pueden ser utilizados en el diagnostico de un nmero muy reducido de enfermedades. Los VNTR-minisatlites han encontrado su mxima aplicacin en la determinacin de la paternidad y en los protocolos de identificacin gentica en el mbito judicial. Cuando se habla de huellas dactilares del ADN se est hablando de este tipo de polimorfismo.

familia en cuestin ha nacido un varn afectado de una enfermedad hereditaria ligada al cromosoma X. De acuerdo con el patrn de herencia, su padre presentar el alelo normal de la enfermedad, mientras que su madre ser portadora, es decir heterozigota. El varn afectado habr heredado de su madre el cromosoma con el alelo de la enfermedad y dada su condicin de hemizigoto, manifestar el fenotipo correspondiente a la misma. Sin embargo no podemos predecir, ms all del modelo mendeliano, el genotipo de la hermana ni el del feto que se est desarrollando. Supongamos que existe un locus polimrfico, tipo microsatlite, prximo al locus de la enfermedad, ntimamente ligado (frecuencia de recombinacin igual a 0). Si identificamos los alelos de dicho polimorfismo en cada uno de los miembros de la familia podremos inferir el alelo del locus de la enfermedad que porta cada individuo. En la parte inferior de la figura se presenta, de forma simplificada, el resultado obtenido al caracterizar mediante PCR el locus polimrfico. En el margen izquierdo se presenta un patrn correspondiente al nmero de repeticiones del dinucletido CA (de 1 a 6) y perpendicularmente a cada individuo el alelo correspondiente a cada uno de ellos. Podemos ver que el varn afectado ha heredado de su madre el alelo de 2 repeticiones, por lo que podemos inferir que dicho alelo est junto al alelo de la enfermedad. Segn ello, la hermana habr heredado de su padre el alelo 4 del polimorfismo junto con el alelo normal de la enfermedad y de su madre el alelo 6 que tambin en este caso ir junto al alelo normal. Por lo tanto la hermana ser homozigota para el alelo normal de la enfermedad. Siguiendo un razonamiento similar podemos inferir que el feto ser una nia (presenta dos alelos del polimorfismo) y heterozigota para la enfermedad, pues ha heredado de su madre el alelo 2 del polimorfismo que como hemos indicado anteriormente est acompaado por el alelo que causa la enfermedad. En el ejemplo anterior hemos utilizado como marcador del locus de la enfermedad a un locus altamente polimrfico, los cromosomas paternos presentan alelos distintos y por lo tanto los podemos identificar sin ambigedad alguna, y ntimamente ligado, es decir no existe recombinacin entre ambos loci y por lo tanto el alelo del polimorfismo que en la madre va junto al alelo de la enfermedad

Figura 14.- Deteccin mediante PCR de distintos alelos de un polimorfismo microsatlite. En el ejemplo se presentan dos individuos heterozigotos p a r a l o s alelos d e 6 y 7 repeticiones y de 4 y 8 repeticiones del dinucletido (CA)n. La detecci n se realiza mediante PCR utilizando como cebadores oligonucletidos que flanquean a la regin que contiene la repetici n (flechas). De cada individuo se amplifican fragmentos de ADN que difieren entre si por el nmero de repeticiones. El resultado de la amplificacin se fracciona en un gel de acrilamida-urea para determinar el genotipo de cada individuo.

Los VNTR-microsatlites son por excelencia los polimorfismos annimos utilizados en el diagnstico gentico. Corresponden a la repeticin en tndem de secuencias de entre 2 y 5 nucletidos. Los microsatlites presentan dos caractersticas que los hacen ideales para su uso. En primer lugar, estn distribuidos de forma casi homognea por todo el genoma y en segundo lugar, presentan un nmero elevado de alelos con frecuencias similares entre s, de forma que la probabilidad de que un individuo sea heterozigoto es muy elevada (presentan una alta heterozigosidad). Su deteccin se realiza normalmente mediante la tcnica de PCR (Figura 14). Aplicacin en el diagnstico enfermedades hereditarias indirecto de las

?
6 5 4 3 2 1

st

2 -

26

46

4 -

24

El ejemplo ms sencillo de aplicacin de los polimorfismos annimos en el diagnstico indirecto lo tenemos en el caso de enfermedades ligadas al cromosoma X. Veamos el ejemplo de la Figura 15. En la

Figura 15.- Genealoga de una familia en la que se hereda una enfermedad ligada al cromosoma X. Vase texto para explicacin.

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continuar junto a ste en los cromosomas de la descendencia. Estas dos caractersticas son fundamentales en el momento de escoger un determinado polimorfismo en el desarrollo de una estrategia de diagnstico indirecto. Si el marcador utilizado no presenta muchos alelos entonces pueden darse situaciones de ambigedad cuando uno o ambos padres sean homozigotos para un determinado alelo del marcador. En este caso diremos que la familia es no informativa para dicho marcador y por lo tanto deberemos utilizar otro polimorfismo en el diagnstico de dicha familia. Por otra parte, si el marcador no esta ntimamente ligado, es decir existe recombinacin entre el locus de la enfermedad y el locus del marcador, el diagnstico deber tener en cuenta dicha posibilidad. Veamos el siguiente ejemplo. En la Figura 16 se presenta la genealoga correspondiente a una familia en la que se hereda una enfermedad con una herencia autosmica dominante. Con una probabilidad del 50% la madre afectada transmitir a sus descendientes el carcter. La utilizacin de un locus polimrfico ligado al carcter en cuestin nos permitir establecer un diagnstico ms ajustado para el feto en desarrollo. En la Figura 16(A) se muestra el resultado obtenido al analizar un polimorfismo microsatlite (repeticin del dinucletido CA). Vemos que la madre esta afectada de la enfermedad y presenta los alelos 2 y 6 del polimorfismo. El padre esta sano y tiene los alelos 4 y 7. Por su parte el hijo afectado es portador de los alelos 6 y 7, el primero procedente de la madre y el segundo del padre. Segn este resultado, podemos considerar que el alelo 6 en la madre est junto al alelo mutado del locus de la enfermedad. Por lo tanto, dado que el feto presenta el alelo 2 del polimorfismo podremos inferir que este lo ha heredado de la madre junto al alelo normal. Sin embargo, tal y como se presenta en la Figura 16(B), si la distancia que separa a ambos loci es suficientemente grande como para que se produzca recombinacin entre ellos, es posible que el feto haya heredado de su madre el alelo 2 del polimorfismo junto con el alelo de la enfermedad. La recombinacin de ambos loci en la meiosis de la madre dara este resultado. La frecuencia con la que se presentar este segundo caso ser la frecuencia de recombinacin entre los loci implicados. As, si la distancia que les separa es de 5 cM, es decir su frecuencia de recombinacin es del 5%, el diagnstico que daremos en el caso presentado en la Figura 16 ser de un 95% de probabilidad de que el feto sea normal (apartado A) y de un 5% de que el feto haya heredado el alelo de la enfermedad junto con el alelo 2 del polimorfismo (apartado B). Para obtener una mayor fiabilidad en el diagnstico se utilizan varios loci polimrficos localizados a ambos lados del locus de la enfermedad. Con ello se consiguen evitar las ambigedades generadas por el entrecruzamiento. El diagnstico citogentico Un nmero importante de las anomalas congnitas y alteraciones del desarrollo embrionario y neonatal son debidas a cambios numricos o estructurales de los cromosomas. El complemento cromosmico de la especie humana consiste en 23 pares de cromosomas. Un miembro de cada par lo hemos heredado de nuestro padre y el otro miembro de nuestra madre. Los cromosomas 1 al 22 se identifican con un nmero y se conocen como autosomas . Del par 23 existen dos cromosomas distintos identificados con las letras X e Y y
Figura 16.- Diagn stico indirecto de una enfermedad autosmica dominante. En A el locus del polimorfismo y el de la enfermedad no presentan recombinacin. En B, el feto en desarrollo presenta un cromosoma materno en el cual se ha dado un evento de recombinaci n (flechas) durante la meiosis de la madre.

que denominamos gonosomas o cromosomas sexuales. De cada autosoma tenemos dos copias, mientras que de los gonosomas las mujeres poseen dos copias del cromosoma X y los hombres poseen una copia del cromosoma X y otra del cromosoma Y. El complemento cromosmico masculino se simboliza como 46, XY y el femenino como 46, XX. Alteraciones numricas de los cromosomas . La presencia por exceso o defecto de uno o varios cromosomas tiene graves consecuencias en la viabilidad y calidad de vida de un individuo. Las clulas somticas presentan un complemento diploide, es decir dos copias de cada cromosoma, mientras que las clulas germinales presentan un complemento haploide, es decir una sola copia de cada cromosoma. El exceso de todo el complemento cromosmico o poliploida es incompatible con la vida y los casos documentados provienen del estudio de abortos en primeras etapas del desarrollo. Se han documentado poliploidas en mosaico , individuos con clulas diploides y clulas poliploides. La extensin del mosaico poliploide determinar la viabilidad o no del individuo. Mucho ms frecuentes son las anomalas numricas que afectan a uno o pocos cromosomas. En este caso hablamos de somas cuando existe un exceso o defecto de un determinado cromosoma. Las gonosomas, es decir la presencia en exceso o defecto de un cromosoma sexual (cromosomas X o Y), suelen ser la causa ms frecuente de abortos espontneos. Sin embargo, su viabilidad post-parto es significativamente alta. Son ejemplos de gonosomas la monosoma (una sola copia) del cromosoma X conocida como Sndrome de Turner , (cuyo complemento cromosmico es 45, X) y la disoma (dos copias) del cromosoma X con presencia del Y o Sndrome de Klinefelter (cuyo complemento cromosmico es 47, XXY). La viabilidad de los individuos con autosomas (presencia en exceso o defecto de un determinado autosoma) es muy baja y para determinados cromosomas tan solo se han descrito en tejidos extraembrionarios o abortos espontneos. Solo para algunos de los cromosomas de pequeo tamao la incidencia de dicha alteracin es significativa. Son ejemplos de ello las trisomas (presencia de tres copias) de los cromosomas 13 ( Sndrome de Patau ), 18 ( Sndrome de Edwards ) y 21 12

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(Sndrome de Down). La trisoma 21 es una de las alteraciones cromosmicas ms frecuentes en recin nacidos. La causa ms frecuente de las somas son los errores en la distribucin de los cromosomas durante la divisin celular ( meiosis) que da lugar a los gametos masculino (espermatozoide) y femenino (vulo).

obtienen los ncleos que se depositan en un portaobjetos para su posterior tincin y observacin al microscopio. Existen distintos protocolos de tincin de cromosomas. El colorante ms utilizado es el GIEMSA , que permite obtener una tincin azulada y homognea de los cromosomas. En combinacin con otros reactivos como por ejemplo la tripsina (enzima proteoltico) la coloracin con GIEMSA permite la observacin de patrones de bandas definidos y caractersticos de cada cromosoma (Bandas G ). La tincin homognea solo es til para determinar el nmero total de cromosomas sin que sea posible la identificacin de cada uno de ellos. Con la tincin mediante bandas es posible tanto el recuento como la identificacin inequvoca de los cromosomas. As mismo, la tcnica de bandas permite identificar reorganizaciones cromosmicas como las translocaciones o las inversiones. La preparacin de cromosomas observada en el microscopio recibe el nombre de cariotipo. En la Figura 17 se muestra el cariotipo de un paciente obtenido mediante la tincin de Bandas G. Tras el recuento cromosmico de varias preparaciones de cromosomas de dicho paciente se observa la falta de un cromosoma. La observacin del patrn especifico de bandas G permiten concluir que el cromosoma en defecto es el X. El diagnstico ser pues de monosomia para el cromosoma X o Sndrome de Turner. El diagnstico molecular en citogntica El campo de la citogentica ha experimentado un avance espectacular con la aplicacin de tcnicas de anlisis molecular a la observacin de cariotipos. La utilizacin de sondas (secuencias de ADN) marcadas con fluorescencia (Tcnica FISH ) permite en la actualidad la deteccin de cromosomas en interfase (Figura 18). Con esta tcnica no es necesario trabajar con clulas en cultivo ni esperar varios das para obtener un resultado. As mismo, las reorganizaciones cromosmicas pueden ser observadas y caracterizadas de forma muy precisa (Figura 19) .

Figura 17. Cariotipo por bandas G de un paciente de sexo femenino. Ver explicacin en el texto.

Alteraciones estructurales de los cromosomas. Distinguimos dos grandes tipos de cambios estructurales en los cromosomas, las reorganizaciones cromosmicas como las translocaciones (intercambio de material entre cromosomas) y las inversiones (reordenacin por inversin de grandes fragmentos de un cromosoma) y las deleciones (perdidas) o duplicaciones (ganancias) de material cromosmico. Si el cambio estructural no comporta ni perdida ni ganancia de material cromosmico diremos que est balanceado o equilibrado y en numerosas ocasiones puede pasar desapercibido en un individuo afecto. La viabilidad ser mucho menor cuando el cambio estructural de lugar a una perdida o ganancia de material cromosmico. Estratgias y pocedimientos en el diagnstico citogentico. La naturaleza de los cambios que afectan a los cromosomas determinan dos grandes tipos de estrategias de diagnstico, las que pretenden determinar si el nmero de cromosomas difiere del normal y las diseadas para detectar variaciones en la estructura de los cromosomas. Los cromosomas solo pueden ser observados al microscopio ptico durante el proceso de la divisin celular (mitosis o meiosis) ya que en la interfase (periodo entre dos divisiones celulares) el ADN de los cromosomas est descondensado y no es posible su observacin. As pues, para observar cromosomas y poder realizar un recuento de los mismos es necesario trabajar con clulas cultivadas y en divisin. Para la observacin de cromosomas de individuos adultos, la fuente ms comn de clulas consiste en el cultivo de clulas nucleadas de sangre perifrica en presencia de drogas mitognicas (inductoras de la divisin celular). Cuando se pretende observar cromosomas de fetos en desarrollo las clulas obtenidas mediante biopsia de las vellosidades corinicas o bien del lquido amnitico pueden ser cultivadas directamente en medio adecuado. Tras la incubacin a 37C durante 48-72h los cultivos son tratados con colchicina con el objeto de parar la mitosis en la etapa de metafase, en la cual los cromosomas adquieren su mximo estado de condensacin. Seguidamente se

Cr. X

Cr. 18

Cr. 18

Cr. Y

Cr. 21

Figura 18. FISH en interfase. Marcaje de ncleos en interfase mediante sondas fluorescentes. a) Determinaci n del sexo. Sondas especficas de los cromosomas 18 (azul), X (verde) e Y (rojo). b) Deteccin trisomia cromosoma 21. Sondas de los cromosomas 18 (verde) y 21 (rojo).

La dimensin social del diagnstico gentico No quisiera finalizar esta revisin sin abordar algunos de los aspectos tico-sociales que acompaan al diagnstico gentico. En la introduccin se enumeraron algunas de las caractersticas distintivas de este tipo de diagnstico respecto al diagnstico convencional. Las diferencias no son de ndole metodolgica o tecnolgica, dado que en los distintos mbitos de la biomedicina la complejidad tecnolgica es similar, sino que estas radican en el mbito de sus implicaciones tico-sociales. Deseara destacar algunos de los aspectos ms significativos de esta dimensin tico-social. 13

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El primero se refiere a la relacin que se establece entre el paciente y su familia. Todo diagnstico genera en el paciente una tensin que se resuelve en un sentido positivo o negativo segn sea el resultado. El diagnstico gentico no solo genera tensin en el propositus sino que toda su familia se ve implicada en l. Esta implicacin no es solo de ndole solidaria, la tensin en la familia obedece a una reaccin primaria al verse directamente implicados en la patologa como potencialmente afectados. Es por ello que el genetista debe considerar a la familia como la unidad de diagnstico y aliviar mediante la adecuada informacin, la angustia y la tensin que el diagnstico pueda generar. El segundo aspecto hace referencia a la componente predictiva del diagnstico gentico. Sin duda alguna la fatalidad Figura 19. Deteccin de una inversin pericntrica (icluye al centrmero) que acompaa al diagnostico positivo de del cromosoma 4 (46,XX, inv(4) (p15q12). Se utiliza una sonda del brazo una enfermedad hereditaria no tiene corto del cromosoma 4 (4p) marcada con rodamina (rojo) y una sonda parangn en otras disciplinas mdicas. proximal (cercana al centrmero) del brazo largo del mismo cromosoma Ello es as, porque en la actualidad la marcada con fluorescena (verde). a) tincin de contraste con DAPI. b) mayora de las enfermedades marcaje con la sonda 4p. c) marcaje con la sonda 4q proximal. d) marcaje hereditarias carecen de una terapia curativa. Cuando en una familia se con ambas sondas al unsono. e) representacin esquemtica del resultado diagnstica un hijo con fibrosis qustica obtenido. no solo se esta dando una prediccin sobre la progresin clnica del paciente en un futuro los ms acrrimos defensores del papel del ambiente en prximo, sino que adems se esta asignando a la familia la ecuacin: fenotipo = genotipo + ambiente, sean los una prediccin sobre futuros embarazos. As mismo, genetistas. cuando uno de los miembros de una familia es diagnosticado como afecto de una enfermedad hereditaria de manifestacin tarda, los miembros jvenes de la BIBLIOGRAFA familia reciben una carga de angustia y tensin. Un ejemplo de esta situacin lo tenemos en el diagnstico de Andrews LB, et al. (1994). Assessing Genetic Risks: Implications la enfermedad de Huntington. Querrn los miembros de for Health and Social Policy. National Academy Press. la familia saber cual es el diagnstico del propositus ? Desearn los familiares asintomticos ser sometidos a Bernstam V. (1992). Handbook of Gene Level Diagnostics in un diagnstico? Estas y otras cuestiones se podrn Clinical Practice. CRC plantear y la respuesta no es obvia. La determinacin de los factores de riesgo y el estudio de la predisposicin o susceptibilidad gentica es uno de los campos de futura aplicacin del diagnostico gentico. Sin duda alguna esto comportar grandes beneficios medicosociales, al facilitar la medicina preventiva en enfermedades como la diabetes, la hipertensin, las enfermedades cardiovasculares u otras de carcter multifactorial, que tienen una gran prevalencia en nuestra poblacin. Sin embargo, todo lo positivo que comporta este tipo de estudios puede verse truncado por una mala utilizacin de la informacin obtenida. No se debe asignar rango de infalibilidad a una informacin de tipo probabilstico. La probabilidad de padecer la enfermedad de Alzheimer se incrementa en un factor de 8 en los individuos homozigotos para el alelo APO-e4, pero ello no implica que un individuo homozigoto para dichos alelos vaya a manifestar inexorablemente la enfermedad. Los factores ambientales, la historia natural de cada individuo, y el fondo gentico tienen un papel muy importante en la manifestacin fenotpica de un carcter. Resulta curioso constatar que en la actualidad
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