REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Las bases tericas de la reaccin de PCR son simples. En la reaccin intervienen tres segmentos de ADN : el segmento de doble cadena que queremos amplificar, y dos pequeos fragmentos de cadena sencilla, los oligonucletidos (primers u oligos), que tienen la misma secuencia que los extremos flanqueantes del ADN molde. Adems, participan en el reaccin el enzima Taq polimerasa (Taq), deoxinucletidos-trifosfato (dNTPs), sales, y un tampn. Los oligos se aaden a la reaccin en exceso con respecto al ADN que desea amplificarse. Los oligos hibridarn con las regiones complementarias del ADN, quedando orientados con sus extremos 3 enfrentados, de modo que la sntesis mediante la ADN polimerasa (que cataliza el crecimiento de nuevas cadenas 5 3) se extiende a lo largo del segmento de ADN que queda entre ellas. El primer ciclo de sntesis producir nuevas cadenas, de longitud indeterminada, las cuales, a su vez, son capaces de hibridar con los oligos. Este tipo de productos se ir acumulando de forma geomtrica, con cada ciclo de sntesis, utilizando como moldes las molculas de ADN parental de la reaccin. Durante el segundo ciclo de sntesis, estas cadenas hijas servirn a su vez como moldes, generndose en este caso fragmentos cuyo tamao ser el del fragmento que engloba los extremos de ambos oligos. Estas nuevas cadenas hijas servirn de molde a su vez para sucesivos ciclos de sntesis. La cantidad de estos productos se duplica con cada ciclo, por lo que se van acumulando de forma exponencial. Al cabo de 30 ciclos, habrn aparecido 270 millones de estas molculas, por cada una de ADN original que hubiese. El primer paso necesario en este proceso de la sntesis es la desnaturalizacin del ADN. Puesto que el molde es una molcula de ADN de doble cadena, ser necesaria la separacin de estas para que los oligos puedan acceder a sus secuencias complementarias y unirse a ellas en el siguiente paso, llamado de alineamiento ("annealing"). Una vez que los oligos se han unido a las cadenas, sirven como cebadores para la accin de la ADN polimerasa, la cual comienza a crear a partir de ellos nuevas cadenas de ADN complementarias, en el proceso de elongacin. Estos tres pasos consecutivos (desnaturalizacin, alineamiento y elongacin) constituyen un ciclo de sntesis. Para las reacciones de PCR de secuenciacin se ha diseado una Taq polimerasa especfica, Taq FS (fluorescente sequencing), a partir de la Taq polimerasa de Thermus aquaticus y modificada genticamente de forma que posee muy baja actividad exonucleasa 5->3 con lo que los resultados son ms limpios con menos ruido de fondo y apenas falsas terminaciones. Adems este enzima incorpora los ddNTPs marcados fluorescentemente ms eficientemnte, con lo cual son necesarios menos ddNTPsfluorescentes y menos ADN molde para conseguir la misma seal. En los ltimos aos, tambin se ha avanzado notablemente en la obtencin de sondas fluorescentes cuyos espectros de emisin de fluorescencia presentan un mnimo solapamiento.