PRACTICA1.PREPARACINDEMATERIALDE LABORATORIOPARASUESTERILIZACIN PRACTICA1.

Materia:Laboratoriode TcnicasMicrobiolgicas

PREPARACINDEMATERIALDELABORATORIOPARASUESTERILIZACIN OBJETIVO El alumno aprender a esterilizar el material de vidrio, instrumental de laboratorio y mediosdecultivoparasuposteriorusoenellaboratorio INTRODUCCIN. El laboratorio de microbiologa, al igual que cualquier laboratorio requiere mantenerse constantemente limpio, sin embargo debido a que en este se manejan cultivos microbianos, requiere adems que el material e instrumental que este en contacto con los microorganismos se encuentre estril o se mantenga as hasta su uso por lo que deben de estar protegidos adecuadamentedecualquierposiblecontaminacin. Para comprobar la esterilidad de los medios de cultivo se recomienda incubarlos 24 h a 28 C inmediatamente despus de que pasaron por el proceso de esterilizacin, despus de esta incubacin slo podrn usarse si no se observan cambios en la turbidez en caso de medios slidos osinoseobservancoloniasencasodemediosslidos. El trmino estril se aplica en microbiologa a cualquier ambiente, material o reactivo que se encuentra libre de cualquier forma de vida, los procesos para poder generar un ambiente estril conducen, entonces a la eliminacin de todo tipo de organismos, lo cual se consigue utilizando agentes qumicos en concentraciones adecuadas o aplicando mtodos fsicos (como el calor o radiaciones), estos ltimos son los ms utilizados en microbiologa debido a que por lo general no dejanresiduosynorequierendeungastoenreactivos. El mtodo esterilizarte fsico menos complicado y ms barato es el calor hmedo, ya que inhibe irreversiblemente la actividad enzimtica de la mayora de los microorganismos as como otros compuestosproteicos.Elequipomsutilizadoparalaaplicacindelcalorhmedoeslaautoclave y consiste en una cmara doble cerrada hermticamente dentro de la cual el vapor de agua saturado permite la transferencia rpida del calor, los parmetros de operacin tpicos son 15 libras/pulgada2 de presin a 121 C durante 15 minutos. Este mtodo se recomienda para esterilizarmaterialyreactivostermoestables.

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Cuando el material a esterilizar es termoestable pero no debe de humedecerse se recomienda utilizarcalorseco,creandounaatmosferadeairecaliente(160Ca180C)duranteunperiodode tiempomsprolongado(2horas)paraloqueseutilizanhornosoestufas.

Instruccionesgeneralesparaelmanejodelautoclavevertical.
1. Comprobarqueelniveldeaguaseaadecuado,deacuerdoalindicadordelequipo 2. Sacarlacanastillaycolocarensuinteriorelmaterialparaesterilizar 3. Colocarlacanastilladentrodelautoclave 4. Cerrar y atornillar la tapa, apretando las tuercas por parejas diametralmente opuestas de formaquelatapaseacopleperfectamente 5. Abrirlavlvuladeescapedevaporyprenderelautoclaveenmximo. 6. Una vez que salga el vapor por la vlvula de seguridad, esperar al menos 3 minutos para permitirquetodoelairedelinteriorseaexpulsado,posteriormentecerrarlavlvula 7. Vigilar el manmetro y la vlvula de seguridad, al alcanzar la presin deseada disminuir la intensidaddecalentamientoparamantenerconstantelascondicionesrequeridas 8. Al finalizar el tiempo de esterilizacin apagar el autoclave y esperar a que el manmetro descienda a cero para abrir la vlvula de seguridad y permitir que el vapor remanente salgalibremente 9. Abrir la tapa liberando las tuercas por parejas diametralmente opuestas y sacar el material MATERIAL,EQUIPO,REACTIVOSYCEPASMICROBIANASPOREQUIPO a)EQUIPO Autoclavea121C Hornoa170C Incubadoraa37Coa55C c)Materialporequipo 1rollodecintatestigo(maskingtapeindicador) 1rollodepapelaluminio 1metrodepapelKraft Algodnsuficienteparataponesdematraces Gasaoteladepaalina(3metros) 2pipetasgraduadasde10ml 2matracesErlenmeyerde125mlode250ml

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2matracesErlenmeyerde250mlcon50mldeaguadestilada 2cajasdePetrilavadasysecas 4tubosdeensayede13X100mm 3tubosdeensayecon3mldecaldonutritivoestril 1mecherodebunsen 1asabacteriolgica. MEDIOSDECULTIVO Caldonutritivo CEPASMICROBIANAS Unmatrazcon50mldeunasuspensinmicrobianadeEscherichiacoli. DESARROLLOEXPERIMENTAL 1.PREPARACINDEMATERIALPARAESTERILIZACIN 1.1Lavadodematerialdevidrioeinstrumental a) Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el material plano y el instrumental metlico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando extrn. b)Enjuagarsuficientementeconaguadelallave. c) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente. 2.PREPARACINDEMATERIALPARAESTERILIZACINPORCALORHMEDO 2.1TUBOSDEENSAYO a) Tapar 4 tubos de ensaye de 13 X 100 mm con tapones de algodn envueltos en gasa siguiendo lasindicacionesdelprofesor. b) Colocar los tubos en un bote de lmina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga, anotarfecha,equipo,grupo,medidadelostubos.Colocarunpedazodemaskingtapeindicador. 2.2CAJASDEPETRI a) Envolver las cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel,lacantidaddecajasenvueltas,fecha,equipo,nmerodeequipodelaboratorioygrupo.

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2.3PIPETAS a) Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapn de algodn cuidando que no quede muy compactado, utilizar para ello una aguja de diseccin o un clip y flamear con mechero las boquillasdelaspipetasafindeeliminarelexcesodealgodn. b) Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremoconmaskingtapeyanotarsobreelpapellacapacidaddelapipeta,lafecha,elgrupoyel nmero de equipo de laboratorio. Con una flecha indicar el extremo en donde est la punta de la pipeta.

2.4MATRACESERLENMEYER a)Colocarenlabocadecadamatrazuntapncompactodealgodn,envueltocongasa,siguiendo las instrucciones del profesor, con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente ms grande que el tapndealgodn. b) Enunatirade maskingtapeanotarlafecha, grupoyequipo,adherirelMaskingtapeal matraz. Noanotarlosdatossobreelgorrodepapel.

2.5PINZASYTIJERAS a)EnvolverconpapelKraftunapinzaotijerayconlpizsealarconunaflechalapunta. b)Anotarenelpapellapiezadequesetrate,lafecha,grupoyequipo. 3.PREPARACINDEMATERIALPARAESTERILIZACINPORCALORSECO 3.1TUBOSDEENSAYE a) Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metlica. b)AnotarenunatiradepapelKraftlafecha,grupoyequipo,sujetarelpapelconmaskingtape.

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3.2CAJASDEPETRI a)ColocarenelinteriordeuncilindrodeaceroinoxidableparacajasdePetridoscajasenposicin invertida perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MTODO MATERIAL CONTAMINADO). b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el nmero de cajas que contiene el cilindro, el grupo ylafecha. c) En caso de no contar con un contenedor para esterilizar de esta forma, utilizar el mtodo descrito que para calor hmedo: envolver las cajas de Petri con papel Kraft. Anotar en el papel, la cantidaddecajasenvueltas,fecha,equipo,nmerodeequipodelaboratorioygrupo. 3.3PIPETAS a) Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapn de algodn cuidando que no quede compactado. b) Flamear las boquillas en la flama del mechero a fin de eliminar el exceso de algodn, antes colocar en el interior un poco de papel aluminio para evitar que las pipetas se despunten en el momentodeintroducirlas. c)Colocarenelinteriordeuncilindropipetero,laspipetaspreparadas. d) Anotar en una tira de papel Kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijarlatiraentrelatapadelcilindropipetero. e)Sinosecuentaconcilindropipetero,envolverlaspipetasdelamismaformaqueparaesterilizar por calor hmedo: envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft,fijarelextremoconmaskingtapeyanotarsobreelpapellacapacidaddelapipeta,lafecha, elgrupoyelnmerodeequipodelaboratorio.Conunaflechaindicarelextremoendondeestla puntadelapipeta. 3.4MATRACES a)Colocarenlabocadeunmatrazde125mlunatapadepapelaluminio. b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetndoloconmaskingtapeoetiquetarsobreelmaskingtapeconunmarcadorindeleble. 3.5PINZASYTIJERAS a)Envolverenpapelaluminiounapinzaounatijera. b)Enunatirademaskingtape,anotarfecha,grupoyequipo.Fijarelmaskingtapealaenvoltura. 4.ESTERILIZACINPORCALORHMEDO a)Colocarelmaterialpreparadoparaesterilizarporcalorhmedo. b)Preparar3tubosdeensayede13X100mm con3mldecaldo nutritivoestrilyetiquetarcada uno de ellos como tubo 1, 2 y 3. (Adicionar a la etiqueta la siguiente informacin: grupo, equipo, mtododeesterilizacinyfecha). c) El tubo 1, utilizarlo como testigo positivo (inocular en forma estril las esporas con Bacillus stearothermophilus, mantenerlo sin esterilizar). El tubo 2 ser utilizado como bioindicador de esterilidad (inocular en forma estril las esporas de Bacillus stearothermophilus, someterlo a esterilizacin). El tubo 3 se utilizar como testigo negativo (medio de cultivo sin inocular esporas, meterloaesterilizar). d)Incubarlostrestubosa55oC2Cyregistrardiariamentelaaparicinonodeturbidez.

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f) En caso de no contar con las esporas de B. stearothermophilus, trabajar con un inculo de Escherichiacolieincubara37C. 5.ESTERILIZACINPORCALORSECO a) Colocar el material preparado para esterilizar por calor seco y encender el horno. Cuando la temperaturaestea160oCtomareltiempode1h. b) En un tubo de ensaye sin esterilizar y vaco, colocar una asada de Bacillus subtilis o 1 mL de E. coli., cubrir la boca del tubo con papel aluminio y colocarlo junto con el material indicado en (a). Esterilizara160oCdurante1h. c) Despus de transcurrido el tiempo de esterilizacin, apagar el horno y esperar a que el termmetro indique la temperatura ambiente. Abrir, retirar el material y el tubo de ensaye con la tiradeesporas. d) Con ayuda de una pinza estril (flamear con alcohol) y bajo condiciones de esterilidad, colocar una asada de Bacillus subtilis o 1 mL de E. coli. a un tubo de ensaye que contenga 3 ml de caldo nutritivoestrilyetiquetado. e)Teneradisposicinotrosdostubosdeensayequefuncionencomotestigopositivo(conesporas sinesterilizar)ynegativo(mediodecultivosinesporas,esterilizado). f)Incubarlostrestubosa55oC2Cyregistrardiariamentelaaparicinonodeturbidez.

CUESTIONARIO
1. Defina los siguientes trminos: Desinfectante, bactericida, microbiosttico, antisptico, estril,gnotobiotico,agnotobiotico. 2. Qu otros mtodos fsicos se utilizan para esteriliza medios de cultivo o soluciones inestablesalcalor? 3. 4. Elcaldonutritivoesunmediodecultivosintticoonosinttico. Mencionealmenos10causasdecontaminacinenuncultivorecinsalidodelautoclave.

Referencias.
1. Breach,M.R.Esterilizacin,mtodosdecontrol.ElmanualModerno,S.A.Mxico 2. Brock, D.T. Madigan, T.M. and Martinko, M.J. Biology of microorganisms. 7th edition, PrenticeHall,NewJerses 3. Jhonson, T.R. and Case, C.L. Laboratory experiments in microbiology. 4th edition. The Benjamin/CummingsPublishingCompany,Inc.California.