PCR en tiempo real

Porqu a tiempo real?

PCR en tiempo real

Aspectos tericos

PCR en tiempo real

Aspectos tericos
Anlisis de DNA obtenido mediante PCR mediante Electroforesis en gel de Agarosa.

La cuantificacin del DNA de partida es bsica en un 80% de las aplicaciones de la PCR.

PCR en tiempo real

Porqu en tiempo real ?
El anlisis en gel de agarosa en tiempo final no permite diferenciar la high concentration / concentracin de partida high efficiency
high concentration / low efficiency low concentration / high efficiency

end-point analysis

log-phase analysis

N : number of amplified molecules n : number of amplification cycles

PCR en tiempo real

Porqu en tiempo real ?
high concentration / high efficiency high concentration / low efficiency low concentration / high efficiency

end-point analysis

log-phase analysis

N : number of amplified molecules n : number of amplification cycles

La fluorescncia es proporcional a la concentracin de DNA

PCR en tiempo real

Porqu en tiempo real ?

!!

PCR en tiempo real

Aspectos tericos La cuantificacin por PCR en punto final no es possible debido al efecto plateau.

Reasociacin del producto de

amplificacin. Competicin con los primers. Agotamiento de reactivos. Inestabilidad de la Enzima. Inhibicin por producto.

PCR en tiempo real

Aspectos tericos

Cantificacin mediante PCR

La cuantificacin por PCR a punto final no es posible debido al efecto plateau. N= N0x2n N = N0 x (Evar)n

Reasociacin del producto de amplificacin. Competicin con los primers. Agotamiento de reactivos. Inestabilidad de la Enzima. Inhibicin por producto.

PCR en tiempo real

Aspectos tericos
N N = N 0 x 2n

Theory N = N0 x (Econst)n
n N0

log-phase-PCR

Real

N = N0 x (Evar)n
n N0

end-point-PCR

N: number of amplified molecules cycles N0: initial number of molecules

n: number of amplification E: amplification efficiency

PCR en tiempo real

Aspectos tericos
Cuantificacin mediante PCR. Mtodos.
End-point-PCR:
- PCR competitiva gel analysis PCR ELISA limiting dilution PCR ...

Log-phase-PCR:
- Anlisis Cintico - real-time, on-line analysis

PCR en tiempo real

Aspectos tericos

Cuantificacin por Electroforesis en Gel de Agarosa. PCR Competitiva

109 - 101 copies of plasmid

containing tPA target

105 copies of plasmid

containing competing sequence

PCR en tiempo real

Aspectos tericos

Cuantificacin en Tiempo Real

Ventajas del anlisis en fase logartmica.

El anlisis en fase logartmica es el nico mtodo que permite la cuantificacin en tiempo real:
Anlisis en la fase de eficiencia constante. Amplio rango dinmico (hasta 10 logaritmos). Mtodo seguro y repetitivo. Uso de standards internos y externos. Cuantificacin absoluta y relativa. Uso de control interno, que elimina las variaciones de tubo a tubo. Anlisis en el mismo tubo de reaccin, eliminacin de contaminaciones post-PCR.

PCR en tiempo real

Cuantificacin en Real time
Fundamento.
Unknown Sample
Target
log (F2/F1)

cycles Crossing Point (Cycles)

RESULT
Absolute Value (Copy Number)
log (copy number)

log (F2/F1)

cycles

Standard Curve

PCR en tiempo real

Cuantificacin en Real time

Evolucin de la Tecnologa del DNA

Phenol / chloroform EtOH precipitation

Affinity columns

Sample preparation

In vitro Amplification

PCR en tiempo real

Cuantificacin en Real time

Se requieren termocicladores especiales: Unidad ptica integrada capaz de detectar seal mientras se produce la reaccin Software capaz de interpretar la seal

PCR en tiempo real

Cuantificacin en Real time Compaas que han desarrollado sistemas para PCR en Tiempo Real
Applied Biosystems BioRad Roche Diagnostics Cepheid Stratagene Corbett Eppendorf

PCR en tiempo real

Fundamentos tericos

PCR efficiency = number of copies in cycle n

number of copies at cycle n-1 Minimum PCR efficiency = 1 Maximum PCR efficiency = 2 During the first PCR cycles, until reagents became a limiting factor, PCR efficiency should be close to 2

PCR en tiempo real

Fundamentos tericos

PCR en tiempo real

Fundamentos tericos

If we plot the data on logarithmic scale we can see differences in earlier cycles During the logarithmic phase there is a straight relation between DNA amount and cycle number

PCR en tiempo real

Fundamentos tericos

PCR en tiempo real

Fundamentos tericos

PCR en tiempo real

Fundamentos tericos

We should get a straight line relationship in the linear part of the PCR reaction

PCR en tiempo real

Fundamentos tericos

Only the very early part of the curve represents the linear correlation Looking at logarithmic scales is more intuitive

PCR en tiempo real

Fundamentos tericos

Escala real
Multiple samples

PCR en tiempo real

Fundamentos tericos

Escala log.
Multiple samples

PCR en tiempo real

Fundamentos tericos
The software measures for each
sample the cycle number at which the fluorescence crosses the arbitrary line, the threshold.

This crossing point is the Ct value.

More dilute samples will cross at later Ct values.

PCR en tiempo real

Fundamentos tericos

PCR en tiempo real

Fundamentos tericos
We can plot the Ct values for the dilutions against
concentration: the result is a linear graph.

It should have an excellent correlation coefficient

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