UROCULTIVO

I. INTRODUCCIN: Varios miembros de las enterobacterias pueden aislarse de la orina en el curso de infecciones del aparato urinario o urogenital, como tambin en otros tipos de afecciones.La orina vesical normalmente no contiene microorganismos. Sin embargo, los primeros 10 a 15 ml. de orina emitidos por personas normales de cualquier edad o sexo, siempre presentan bacterias, las que proceden de la flora corriente de la uretra anterior, prepucio, regin vulvovaginal o de contaminacin fecal. La flora de estas localizaciones es variada y est constituida por estafilococos coagulasa-positivo y negativos, estreptococos diversos, bacilos difteromorfos, enterobacterias, lactobacilos, micoplasmas, bacterias anaerobias, levaduras y muchos microorganismos. En la presencia de esta flora influyen localizacin anatmica, sexo, edad, hbitos de higiene y factores patolgicos propios del husped. En la etiologa de las infecciones urinarias predominan los bacilos gramnegativos. Los procesos agudos y crnicos son provocados por E. coli y por especies de los gneros Enterobacter, Proteus, Citrobacter, Pseudomonas, Serratia, etc. De estos agentes, E. coli se asla en 80% de los casos. Ps.aeruginosa y S.marcescens se identifican en pacientes hospitalizados, muy debilitados o sometidos a instrumentacin repetida. Con bastante menor frecuencia desempea un papel causal Streptococcus faecalis (enterococo) y excepcionalmente los estafilococos. El examen microbiolgico de una muestra de orina se denomina Urocultivo. ste se ha de hacer desde un punto cuantitativo y cualitativo. A. Examen cuantitativo Mtodo de conteo en placa o recuento de colonias. Introducido por Kaas para evitar los riesgos del cateterismo vesical y diferenciar bacteriuria verdadera de contaminacin, se realiza de la siguiente manera:

Se homogeneiza la muestra mediante agitacin. Se diluye la muestra al 1:100, colocando 0.1 ml. de orina en 9.9 ml. de caldo de tripticasa o de suero fisiolgico, estriles. Se preparan diluciones al 1:1000 y 1:10 000, a partir de la dilucin al 1:100. Se deposita 1 ml. de cada dilucin en placas de Petri esterilizadas, sobre las cuales se vaca un tubo de agar-tripticasa o medio CLED, fundidos y enfriados a 45. Mediante rotacin suave, se favorece la distribucin homognea de la siembra. Se incuban todas las siembras a 37 durante 24 a 48 horas.Para calcular el nmero de colonias se eligen placas que contengan entre 30 y 300 colonias. Contadas stas, basta multiplicar su nmero por la dilucin respectiva para obtener la cuenta total. Mtodo del asa calibrada. Esta estimacin cuantitativa consiste en sembrar una placa con medio de agarsangre o agar con CLED en una muestra de orina, sin centrifugar, empleando asa de platino calibrada (4 mm. de dimetro). Despus de incubar las siembras a 37 durante 24 a 48 horas, se cuenta el nmero de colonias desarrolladas y el resultado se multiplica por 100, ya que la asada de platino contiene 0.01 ml. de orina.Los resultados del estudio cuantitativo se informan de la siguiente manera:

No hubo desarrollo microbiano. Menos de 10 000 colonias por ml. Entre 10 000 y 100 000 colonias por ml. Ms de 100 000 colonias por ml. Cuando se obtienen dos recuentos sucesivos con ms de 100 000 colonias por ml., la probabilidad de infeccin es de 80%, cifra que se eleva a 95% si el mismo resultado se logra en tres recuentos sucesivos.Por lo general, las muestras contaminadas tienden a mostrar cuentas inferiores a 10 000 colonias/ml. Cuando el recuento revela valores intermedios, entre 10 0000 y 100 000 colonias /ml, el examen debe repetirse. Conviene advertir que pueden pasar inadvertidas infecciones urinarias verdaderas, si no se toman en cuenta cuentas inferiores a 100 000 colonias por ml, ya que existen diversos factores que pueden explicar recuentos bajos en infecciones urinarias verdaderas, diuresis acentuada, obstruccin uretral, infecciones crnicas e infecciones por cocos grampositivos. b. Examen cualitativo

El estudio cualitativo, que conduce a la identificacin del agente, se realiza mediante la siembra de la muestra homogeneizada, en placas con agar-sangre, agar-CLED, agar de Levine o MacConkey. Es recomendable el medio CLED, porque favorece el desarrollo de bacterias patgenas urinarias y permite la identificacin de los microorganismos contaminados. Su contenido en cistena y lactosa y su deficiencia en electrolitos facilitan, por una parte, el reconocimiento de colonias de bacterias y, por otra, inhiben el carcter invasor de las colonias de Proteus. As se facilita la identificacin de estafilococos, bacilos difteromorfos, lactobacilos y otros agentes que pueden contaminar la orina.La identificacin final de los agentes se hace mediante el estudio de sus propiedades bioqumicas y caractersticas serolgicas. Esto permite establecer relaciones de identidad entre microorganismos aislados en cultivos sucesivos o de control, y definir el estado de revivida o de reinfeccin. De esto deriva el valor que tiene el conocimiento del biotipo, del serotipo (particularmente en E. coli), del piocinotipo (en especial cuando es de Ps. aeruginosa) y del antibitico. ste ltimo se obtiene al comparar el antibiograma de cepas aisladas de muestras obtenidas de diferentes oportunidades en un mismo paciente Si existe correspondencia, se concluye que se trata de una misma cepa. * Mtodos rpidos de diagnstico.Existen varios procedimientos prcticos y econmicos para el diagnstico rpido de infecciones urinarias o de bacteriurias significativas. Son tiles para investigar grandes grupos de personas. Estos mtodos pueden ser microscpicos, qumicos o de microcultivo.La coloracin de un frotis de orina no centrifugada mediante el mtodo de Gram constituye un ndice prctico para diferenciar entre infeccin y contaminacin urinarias. En efecto, la observacin de un bacilo gramnegativo por campo microscpico puede realizarse cuando la muestra contiene ms de 100 000 bacterias por ml. Sin embargo, la dificultad de encontrar bacterias en frotis de orina por este mtodo, provoca resultados falsos negativos. Menos confiable aun es el hallazgo de 20 o ms bacterias gramnegativas por campo microscpico de sedimento urinario, aunque dicho nmero permita sospechar recuentos superiores a 100 000 microorganismos por ml.Los procedimientos qumicos estn basados en propiedades enzimticas de las bacterias, que se pueden poner de manifiesto en la orina. Entre las pruebas se pueden mencionar: catalasa, reduccin de nitratos, reduccin de trifeniltetrazolio e hipoglucosuria. Estos mtodos, aunque rpidos y econmicos, tienen el inconveniente de ser indirectos, basarse en propiedades metablicas de las bacterias y no en su desarrollo y observacin, y producir muchos falsos negativos. II. REALIZACIN DE LA PRCTICA A. TOMA DE LA MUESTRA:El mtodo ms recomendado para realizar la recogida de muestra para un urocultivo es la toma, durante el periodo medio de la miccin, siempre que el paciente sea capaz de limpiarse y recogerla, ya que la muestra de orina requiere una cuidadosa limpieza de los genitales externos. Esta tcnica impone los siguientes requisitos: El paciente debe tener como mnimo de tres a cuatro horas de retencin de orina, y la muestra ms representativa es la primera orina de la maana. El paciente no debe haber recibido tratamiento antimicrobiano durante los tres das anteriores a la recoleccin, exceptuando los casos de control de tratamiento, y paciente gravemente enfermos.Esta tcnica no es apropiada para nios que no controlan sus esfnteres, en cuyo caso se procede a hacer limpieza de los genitales y a fijar un recolector de orina estril (especial para bebs). Se deja en esta posicin hasta que el nio realice su miccin; se despeja el recolector y se sella inmediatamente. No debe dejarse colocado el recolector por tiempo prolongado. La alta probabilidad de contaminacin en muestras de orina de lactantes, obliga a realizar el estudio en tres muestras sucesivas de miccin espontnea. En ciertas ocasiones se justifica el sondeo uretral o la aspiracin suprapbica. No obstante, existe un pequeo riesgo de infeccin tras sondeo uretral, el cual vara segn el tipo de paciente. Debido a la colonizacin por bacterias de la uretra, suele ser difcil definir si los microorganismos aislados a partir de orina tomada con sonda son de origen urinario o uretral.En los pacientes con sonda uretral permanente con drenaje cerrado, la orina para cultivo se recoge despus de desinfectar la pared de la sonda en su punto de unin con el tubo de drenaje. Se aspira la orina por medio de puncin en la sonda con una aguja 21. En ningn momento deber sacarse de la bolsa de drenaje material para cultivo. b. Conservacin y/o Transporte:En lo que respecta al transporte y conservacin de muestras de orina, hay que tener en cuenta que la orina constituye un excelente medio de cultivo para casi todas las bacterias, por lo que una vez recogida, la muestra debe enviarse de inmediato al laboratorio, previa colocacin del envase en un recipiente que contenga cubos de hielo. Este procedimiento permite que el nmero de bacterias permanezca relativamente constante por un tiempo considerable. C. Procesamiento de la muestra Una vez se ha obtenido la muestra de orina se homogeneiza en dos partes:

 Una parte de la muestra va destinada al Examen en Fresco y posterior Tincin. La otra parte va destinada al Urocultivo. En nuestra prctica vamos a realizar en primer lugar una siembra en placa con la muestra de orina. Cuando se desean observar las caractersticas de las colonias de un microorganismo, las placas de Petri resultan muy adecuadas para tal fin. La poca profundidad de la placa y la extensa superficie de cultivo facilitan el examen macroscpico de las colonias as, como si fuera necesario, la observacin microscpica de las mismas.Para aislar colonias de modo individualizado el medio en placas de Petri se inocula de la siguiente manera. Empleando un asa estril se extiende la toma de la muestra a modo de estras en el primer cuadrante. A continuacin se hace lo mismo en el segundo cuadrante pero en una direccin diferente a la anterior. En el tercer y cuarto cuadrante hacemos lo mismo.Una vez realizada la extensin de la muestra dejamos incubar la muestra a 37 C durante 24 o 48 horas.A continuacin vamos a hacer un urocultivo en el cul emplearemos un tubo a cuyo tapn hay unido una lengeta. En cada cara de la lengeta hay una medio de cultivo. En nuestro caso, uno de los medios de cultivo es agar MacConkey y el otro es Agar CLED.EL agar MacConkey es un medio selectivo-diferencial. Los microorganismos aislados de orina pueden ser fermentadores o no fermentadores de la lactosa. Se emplean medios diferenciales para distinguir unos de otros. El medio MacConkey se utiliza para diferenciar los microorganismos intestinales fermentadores de la lactosa de los que no presentan esta propiedad. En el agar, los nutrientes bsicos son el agar y la peptona. El taurocolato sdico (sal biliar) inhibe la flora Gram positiva, mientras que la lactosa y el indicador (rojo neutro) diferencia los fermentadores de la lactosa de los que no tienen esta capacidad. Los microorganismos que fermentan la lactosa producen cido lctico, que neutraliza la sal biliar y absorbe el colorante dando colonias rojizas. Los microorganismos que no fermentan la lactosa dan una reaccin alcalina, no toman el rojo neutro y dan lugar a colonias incoloras. Composicin del agar MacConkey Lactosa 10 g. Solucin acuosa rojo neutro

El otro medio de cultivo utilizado es diferente segn la casa comercial. Uno de los ms utilizados es el agar CLED. Segn la casa comercial ste recibe diferentes nombres; en nuestro caso se llama Brolacyn. El medio CLED (Cistina-Lactosa-Deficiente en Electrolitos) se recomienda para bacteriologa urinaria. La deficiencia en electrolitos evita el crecimiento invasivo de Proteus spp. , al mismo tiempo que se consigue una buena diferenciacin de colonias para la mayor parte de los patgenos. Composicin del agar CLED:. Lactosa 10 g. L-Cistina 0.128 g. Azul de Bromotimol 0.02 g.

Tanto en el medio MacConkey como el Brolacyn tienen un sustrato llamado MUG sobre el cul acta E. coli. De modo que si existe E. coli. en la muestra romper la molcula de MUG dejando libre una parte de ella de tal modo que al aplicarle luz ultravioleta (360-400 nm.)emitir fluorescencia. Para la realizacin de nuestra prctica introducimos la lengeta en la muestra de orina, lo cerramos y dejamos incubar durante 24 horas. III. RESULTADOS Placa de agar MacConkey ! No ha crecido nada Tubo-Lengeta MacConkey/CLED ! Los colores no han virado y mantienen e brillo. Resultados: no se observan microorganismos en la muestras analizadas. Vemos un anlisis paralelo para ver como deberan haber virado los colores. As:

verde brillante ! amarillo mate anaranjado ! rojo fuerte