Prctica N 1 MICROSCOPA MEDICIN DE ESTRUCTURAS MICROSCPICAS Blgo.

. Walter Fernando Manya Agurto INTRODUCCIN: Hay 3 grandes problemas que dificultan la observacin de estructuras biolgicas microscpicas: 1) Las pequeas dimensiones de las clulas y sus organelas. 2) Su transparencia a la luz visible; lo cual origina la falta de contraste entre las diferentes estructuras y entre stas y el medio que los rodea. 3) Su falta de estabilidad en el tiempo. Para superar el primer problema se inventaron, construyeron y perfeccionaron microscopios capaces de aumentar significativamente las imgenes revelando los pormenores de las estructuras. Para resolver el segundo problema, se desarrollaron tcnicas de coloracin y tincin, que permiten aumentar el contraste entre las diferentes estructuras y entre ellas y su entorno hacindolas claramente visibles y diferenciables. La estabilidad y preservacin de las estructuras biolgicas llev al desarrollo de tcnicas de deshidratacin, fijacin e inclusin que nos permiten tener muestras permanentes. Todo esto dio origen al desarrollo de disciplinas como la Citologa, la Histologa, la Microscopa, etc. MICROSCOPIO.- Es un instrumento ptico que nos permite observa una imagen amplificada de un objeto pequeo; siempre y cuando sus dimensiones estn dentro del lmite de resolucin del microscopio. La cantidad de detalles que puede registrar un sistema ptico depende de la naturaleza ondulatoria de la luz. Como se aprecia en la Figura 1; si P es un punto luminoso que irradia ondas luminosas en todas las direcciones; stas llevan informacin del punto P, pero solo una fraccin de ellas es captada por la lente AB y son utilizadas para formar la imagen P1 del punto P. Es por esta razn que ni el mejor instrumento ptico conocido puede darnos una imagen perfectamente puntual del objeto bajo observacin.

APERTURA NUMRICA.- Es la expresin numrica de la fraccin de ondas luminosas que emitidas por el objeto atraviesan la lente y sirven para formar su imagen. En la Figura 2 podemos observar que la lente AB recibe un cono de rayos luminosos provenientes del punto P; si 2u es el ngulo de este cono, la expresin:

AN

n . Sen u

Donde: AN = Apertura numrica n = ndice de refraccin del medio entre el punto P y la lente Sen u = Seno del ngulo de apertura mide la cantidad de rayos que penetran en la lente y se denomina Apertura Numrica. Puesto que la funcin Seno est definida en el intervalo [-1 , 1] entonces el Sen u no puede ser mayor de 1, y dado que el ndice de refraccin de los mejores medios pticos conocidos no es mayor de 1.6; usando aceite de inmersin, podemos deducir que la mxima Apertura Numrica que puede lograrse en una lente es de 1.4. La Apertura Numrica es una constante ptica para cualquier lente y determina la capacidad de la lente para dar detalles finos del objeto observado. Su valor est grabado en las lentes objetivo.

PODER DE RESOLUCIN.- Es la capacidad del sistema ptico que nos permite distinguir 2 puntos situados uno muy cerca del otro como si fueran unidades independientes y por lo tanto formando imgenes separadas. Dos puntos forman imgenes separadas entre s siempre y cuando entre ellos exista una distancia mnima. LMITE DE RESOLUCIN.- Es la distancia mnima que debe existir entre 2 puntos para que puedan ser visualizados como entidades independientes. Si la distancia que separa a los 2 puntos es menor que el lmite de resolucin, formarn una sola imagen es decir, sus imgenes se superponen.

Ejemplo: El lmite de resolucin del ojo humano es de 0.1mm por lo que, 2 puntos separados por una distancia menor a 0.1 mm (100 micras) sern visualizados como uno solo. Por otro lado, el lmite de resolucin del microscopio de luz visible es de 0.2 micras (0.0002 mm); por lo que los puntos sern visualizados como independientes. El lmite de resolucin es una constante ptica y su valor puede ser calculado por la siguiente frmula: -r = 0.61 AN

Donde: r = Lmite de resolucin = Longitud de onda de la luz empleada en la observacin En general, la radiacin de una determinada longitud de onda no puede ser usada para observar detalles ms pequeos que su propia longitud de onda; este hecho representa una limitacin fundamental en todo microscopio compuesto. Como hemos visto, la mxima apertura numrica que puede lograrse es de 1.4 por lo tanto, el lmite de resolucin de un microscopio compuesto depende, en ultima instancia, de la longitud de onda de la luz empleada en la observacin; la cual est en el rango de 0.4 0.7 micras dependiendo de su color. En trminos prcticos, las bacterias y la mitocondrias, las cuales estn alrededor de 0.5 micras (500 nanmetros), son las estructuras ms pequeas que pueden ser vistas con el microscopio compuesto. Estructuras ms pequeas que estas no podrn ser visualizadas por efectos de la difraccin ptica.

UNIDADES USADAS EN MICROSCOPA 1 milmetro 1 micra 1 nanmetro = 1mm = 1 = 1nm = 1000 micras = 1000 nanmetros = 10 Angstrom = = = 103 103 nm 10 A0

MECANISMO DE LA FORMACIN DE IMGENES EN EL MICROSCOPO Para el caso del microscopio compuesto nos interesa conocer el mecanismo de formacin de imgenes a travs de lentes biconvexas. Una manera fcil de entender el funcionamiento del microscopio es, considerarlo como un sistema ptico formado por dos lentes convergentes: el ocular y el objetivo. La imagen formada por estas lentes puede construirse por simple geometra.

FORMACIN DE LA IMAGEN EN LA LENTE OBJETIVO.- Como puede apreciarse en la Figura 3, la imagen resultante, P1Q1 es ms grande que el objeto PQ y adems es invertida. Esta se conoce como imagen primaria; pues es la primera que se forma y es real; porque puede recogerse en una pantalla situada en el plano de la imagen, puede proyectarse y fotografiarse.

FORMACIN DE LA IMAGEN EN LA LENTE OCULAR.- Como puede observarse en la Figura 4, la lente ocular toma como objeto la imagen formada por la lente objetivo, P1Q1 para producir su propia imagen, P2Q2. La imagen resultante es ms grande e invertida con respecto a la imagen del objetivo y derecha con respecto al objeto. Esta imagen se conoce como imagen secundaria pues es la segunda imagen que se forma y virtual porque no puede ser recogida en una pantalla, no puede proyectarse ni fotografiase.

En la Figura 5 se aprecia el mecanismo completo de la formacin de la imagen en un microscopio compuesto, es importante sealar que tambin interviene una tercera lente que es el cristalino del ojo del observador.

PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO PARTE MECNICA.- La parte mecnica de un microscopio compuesto consta de: Tubo ptico.- Cilindro metlico relacionado en su parte superior con la lente ocular y en la parte inferior con el revlver que porta a las lentes objetivo. En su parte posterior posee un engranaje llamado cremallera. Cuando el microscopio posee un solo tubo ptico se llama monocular y si posee 2 se llama binocular. Brazo.- Dispositivo metlico que en su parte postero-superior lleva un engranaje que coincide con la cremallera; sirve para fijar el tubo ptico. En su parte inferior se relaciona con la base por medio de un tornillo llamado charnela el cual permite inclinar el brazo del microscopio. El brazo porta adems los tornillos macromtrico y micromtrico. Tornillo macromtrico.- Situado en la parte superior y lateral de brazo, sirve para desplazar rpidamente el tubo ptico acercando los objetivos al objeto. Nos da un enfoque grosero del objeto observado.

 Tornillo micromtrico.- Situado en la parte inferior y lateral del brazo, sirve para desplazar lentamente el tubo ptico y enfocar al objeto. Nos da un enfoque fino del objeto observado. Platina.- Placa metlica que se encuentra fija en la parte inferior del brazo, presenta una abertura central llamada abertura de la platina destinada a dar paso a los rayos luminosos proyectados por el espejo y a travs de la cual puede observarse la lente condensador. En la parte posterior y lateral lleva pinzas que sirven para fijar la lmina porta objeto. Revlver.- Sistema discoidal giratorio que va montado en la parte inferior del tubo ptico, posee 3 4 aberturas donde se atornillan las lentes objetivo. Este dispositivo permite el intercambio de las lentes objetivo las cuales al girar deben disponerse en el retn indicando que se encuentran en posicin de observacin. Tornillo del condensador.- Permite desplazar verticalmente el condensador. Para una ptima observacin; el condensador debe estar en su posicin ms alta. Base.- Llamada tambin pie o estativo; sirve para dar estabilidad al microscopio. PARTE PTICA.- La parte ptica de un microscopio compuesto consta de: Ocular.- Situado en la parte superior del tubo ptico. Recibe ese nombre por ser la lente situada ms cerca al ojo del observador. Existen oculares de diferentes poderes de amplificacin: 4x, 5X, 10x, 12x, y 16x. Su valor se encuentra grabado en la lente la cual acta como una lupa proporcionando una imagen ms grande, virtual y derecha de la imagen del objetivo. Objetivo.- Lentes dispuestas en el revlver, en la parte inferior del tubo ptico. Reciben este nombre por ser las lentes que se sitan ms cerca al objeto. Existen objetivos de diferentes poderes de amplificacin : 4x, 10x, 40x, 43x, 63x y 100x. El objetivo de 100X recibe el nombre de objetivo de inmersin. Cada objetivo lleva grabado 2 nmeros que corresponde a su poder de amplificacin y a su apertura numrica. Los objetivos nos proporcionan una imagen amplificada, real e invertida del objeto. Condensador.- Concentra los rayos luminosos sobre el objeto. Diafragma.- Situado debajo del condensador, es un dispositivo con una abertura central la cual puede ser regulada aumentando o disminuyendo su dimetro. Sirve para regular la intensidad luminosa y es muy til cuando los objetos observados son muy trasparentes puesto que nos permite contrastarlos sobre un fondo luminoso.

 Espejo.- Se encuentra situado debajo de la platina y est montado es un soporte que permite girarlo en cualquier direccin. Es un elemento fundamental del sistema de iluminacin del microscopio puesto que al dirigirlo hacia la fuente de luz permite reflejar los rayos luminosos hacia el objeto. Posee una cara plana que es usada cuando se trabaja con luz natural y una cara cncava que se utiliza cuando se trabaja con luz artificial.

En microscopios modernos es reemplazado por un foco.

PODER DE AMPLIFICACIN TOTAL El poder de amplificacin total de un microscopio compuesto, para cualquier combinacin de oculares con objetivos, se obtiene multiplicando los respectivos poderes de amplificacin. Ejemplo: Si usamos un ocular de 10x combinando con un objetivo de 40x entonces, el poder de amplificacin total es de 400x Al usar esta combinacin de lentes observamos una imagen amplificada 400 veces el dimetro del objeto. OBJETIVOS: Reconocer cada una de las partes de un microscopio compuesto. Determinar la funcin que cumple cada una de la partes. Conocer lo cuidados que deben tenerse para el uso correcto del microscopio. Lograr un uso eficiente del microscopio. MATERIALES: Del estudiante: 1 franela 3 lminas portaobjetos 3 lminas cubre objeto (laminillas). 1 frasco gotero. Papel lente Tijera, pinza, bistur y estilete Hebras de lana y algodn Papel bond escrito a maquina Papel milimetrado. Del laboratorio: Microscopio compuesto Aceite de inmersin Alcohol absoluto : ter etlico (1 : 2)

MTODO: El microscopio es un instrumento de precisin, delicado y caro. Por ms slido que parezca no debe ser sometido a un trato rudo pues esto afectara su delicado mecanismo. Es necesario familiarizarse con sus partes y a continuacin seguir los siguientes pasos: El microscopio se transporta cogiendo con una mano el brazo y con la otra se soporta la base. Limpie la mesa de trabajo con un pao limpio. Elegir un lugar, en la mesa de trabajo, de manera que el microscopio est estable. Limpie la parte mecnica del microscopio: tubo ocular, brazo, platina, tornillos macromtrico y micromtrico, tornillo del condensador y base. Use un pao limpio y seco. Proceda a limpiar el sistema ptico: ocular, objetivos, condensador y espejo. Esta limpieza se lleva a cabo usando nicamente PAPEL LENTE y cuidando de no colocar los dedos sobre las lentes. Seleccione el objetivo de menor aumento. Desplazar el tubo ptico a su mnima posicin. Verificar que el diafragma est completamente abierto. Con ayuda del respectivo tornillo, desplace el condensador a su posicin ms alta. Verifique que entre el espejo y la fuente de luz no existan obstculos. Mirando por el ocular, dirigir el espejo, por su cara cncava, hacia la fuente de luz hasta que el campo de microscopio se ilumine intensamente y en forma homognea. Una vez completado este procedimiento, el microscopio est enfocado, apto para proceder a la observacin de las muestras deseadas y no debe ser cambiado de lugar pues la posicin del espejo con respecto a la fuente de luz varia y habra que enfocarlo nuevamente. DESARROLLO EXPERIMENTAL: Limpie una lmina porta objeto con un pao limpio y seco. Maneje la lmina nicamente por los bordes. Con sumo cuidado limpie una lmina cubre objeto. Con un gotero, coloque una o dos gotas de agua en el centro de la lmina porta objeto. Recorte una letra e minscula y, con ayuda de la pinza y el estilete, colquela en la gota de agua en posicin de lectura. Cubra la muestra con una laminilla cubre objeto evitando la formacin de burbujas de aire. Seque el exceso de agua con papel absorbente. Disponga esta preparacin; llamada preparacin hmeda, sobre la platina y sujtela con las pinzas. Proceda a observar con el objetivo de menor aumento. Dibuje sus observaciones.

 Observando por el ocular cierre lentamente del diafragma anotando los cambios en la imagen. Desplace la lmina porta objeto hacia arriba, luego hacia abajo y describa el desplazamiento de la muestra. Desplace la lmina porta objeto hacia la derecha, luego hacia la izquierda y describa el desplazamiento de la muestra. Gire el revlver para seleccionar el objetivo de mediano aumento. Dibuje sus observaciones. Realice la misma operacin para el objetivo de mayor aumento. Una vez terminada la prctica, limpie la parte mecnica con la franela y el sistema ptico con papel lente. Seleccione el objetivo de menor aumento, abra completamente el diafragma, coloque el tubo ocular en su mnima posicin y guarde el microscopio.

CUESTIONARIO 1.- Qu es difraccin ptica. Explique cmo influye este fenmeno en microscopia. 2.- Qu es refraccin y como influye en microscopia. 3.- La fuente luminosa de un microscopio compuesto es radiacin ultravioleta, de 2000 de longitud de onda y lo usamos con objetivos de aperturas numricas 0.25 y 0.65. Calcular el lmite de resolucin del microscopio para cada uno de lo objetivos. 4.- El PPLO (organismo del tipo de la pleuroneumona) mide 0.1 u de dimetro. Exprese su tamao en milmetros, nanmetros y ngstrom. 5.- De qu factores depende el aumento microscopio? 6.- Qu otros tipos de microscopios existen? BIBLIOGRAFA BAKER, J. W. & ALLEN, G.E. Biologa e Investigacin Cientfica. 1970. Fondo Educativo Interamericano S.A. BRUCE, A.; BRAY, D.; LEWIS, J; RAFF, M, ROBERTS, K. & W.ATSON J.D. Molecular Biology of the Cell ,1 983. Garland Publishing, INC. NEW YORK - London DE ROBERTIS, E.D.P. & DE ROBERTIS, E.M.F. Biologa Celular y Molecular. 1981. Dcima Edicin. Editorial El Ateneo. WALD, G.; ALBERSHEIM, P.; DOG. J.; HOPKINS, J. & LACKS, S. Twenty six afternoons of biology: A introductory laboratoy manual. 1962. Addison-Wesley Publishig Company, Inc. Reading Massachusetts.

VILLEE, C.A. Biologa. 1978. Sptima Edicin. Nueva Editorial Mxico.

Interamericana.

CMO SE PUEDEN MEDIR ESTRUCTURAS MICROSCPICAS Blgo. Walter F. Manya Agurto Frecuentemente es necesario conocer las dimensiones de los objetos, estructuras u organismos que se estn observando bajo el microscopio. Existen 2 mtodos para estimar el tamao de los objetos microscpicos. MTODO A.- Es simple, pero no exacto. Nos permite obtener un estimado aproximado del tamao del objeto al compararlo con el dimetro del campo visual. Para ello, es necesario medir primero el dimetro del campo visual. Los pasos a seguir son los siguientes: 1. Colocar papel milimetrado o una regla de plstico transparente sobre la platina de manera que la escala sea visible. Empezar con el objetivo de menor aumento. 2. Alinear el centro de una de las lneas verticales de la escala con el extremo izquierdo del campo visual. Para hacer esta alineacin tomar en cuenta el dimetro mayor del campo visual. 3. La distancia del centro de una lnea al centro de la siguiente lnea es de 1 mm. Contar el nmero de milmetros incluidos desde el lado izquierdo hasta el lado opuesto del campo visual. Si el lado derecho del campo visual no coincide con el centro de una de las lneas, estime la fraccin de milmetro involucrada.

DIMETRO DEL CAMPO VISUAL

Cul es el dimetro, en milmetros, del campo visual de su microscopio cuando usa el objetivo de menor aumento? Tenga presente que en Microscopa la unidad de medida utilizada es mucho ms pequea que el milmetro. La unidad utilizada es el: MICRN = MICRA = MICRMETRO = -3 1 = 0.001 mm = 1 X 10 mm

Cul es el dimetro, en micras, del campo visual de su microscopio cuando usa el objetivo de menor aumento? 4. Seleccionar el objetivo de mediano aumento: En este caso, el dimetro del campo visual es menor de 1 mm.; por lo que resulta muy difcil estimar la fraccin de milmetro involucrada. En lugar de medir el dimetro directamente, este se puede obtener de la siguiente manera: a) Dividir el dimetro del campo visual del objetivo de menor aumento entre el factor de correccin. b) El factor de correccin se obtiene dividiendo el poder de magnificacin del objetivo de mediano aumento entre el poder de magnificacin del objetivo de menor aumento.

dmediano aumento

Dimetro del campo visual con el objetivo de menor aumento

Poder de magnificacin del objetivo de mediano aumento Poder de magnificacin del objetivo de menor aumento

Cul es el dimetro del campo visual de su microscopio cuando se usa el objetivo de mediano aumento?: a) En milmetros b) En micras El mismo procedimiento se sigue para los objetivos de mayor aumento y de inmersin. El profesor le proporcionar lminas preparadas de clulas u otros objetos para que usted determine el largo y ancho en micras. 1 del dimetro del campo visual 3 a menor aumento y usted ha calculado que el dimetro del campo visual es de 1 200 entonces el dimetro del objeto es de 400 aproximadamente. Ejemplo: Si la longitud del objeto es aproximadamente MTODO B.- Es ms exacto. Para obtener medidas exactas de los objetos microscpicos se debe usar: a) Un ocular micromtrico.- Es un ocular que tiene insertado un pequeo disco de vidrio sobre el cual se han grabado lneas uniformemente espaciadas. OCULAR MICROMTRICO 10 : 100 ( 1mm) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Al cambiar de objetivo no cambia las dimensiones de la escala.

Cuando se observa un objeto con el ocular micromtrico, ste acta como una regla la cual se debe superponer al objeto que se desea medir. Debido a que los microscopios varan en su magnificacin; an usando microscopios de la misma marca, oculares y objetivos con la misma AN y el mismo poder de amplificacin, es necesario primero calibrar el ocular micromtrico para su microscopio; esto se logra con una lmina patrn. b) Una lmina patrn.- Es una lmina porta objeto que tiene grabadas lneas uniformemente espaciadas pero de una distancia conocida. LMINA PATRN (1 mm)

10

20

30

40

50

60

70 1mm.

80

90

100

El procedimiento a seguir es el siguiente: CON EL OBJETIVO DE 10X 1) Colocar el ocular micromtrico Colocar la lmina patrn sobre la platina Seleccionar el objetivo de menor aumento Enfocar. 2) Al observar usted ver 2 escalas; una corresponde a la del ocular micromtrico y la otra a la de la lmina patrn Girar el ocular hasta que las 2 escalas se siten en paralelo. 3) Mover la lmina patrn de tal forma que las lneas de los extremos izquierdos de ambas escalas coincidan (se superpongan). 4) Determine cuntos espacios de la escala de la lmina patrn estn incluidos dentro de un nmero dado de espacios de la escala del ocular micromtrico.

Y espacios del ocular micromtrico

X espacios de la lmina patrn

5) Teniendo presente que los espacios de la escala del ocular micromtrico estn uniformemente espaciados y que los espacios ms pequeos sobre la escala de la lmina patrn miden 0.01 mm, calcule cunto mide un espacio del ocular micromtrico. Use la siguiente frmula:

1 espacio del ocular micromtrico

[X espacios sobre la lmina patrn] [0.01mm] Y espacios sobre el ocular micromtrico

Con esta informacin usted podr medir cualquier objeto microscpico. Ejemplo: 65 espacios del ocular micromtrico = 66 espacios de la lmina patrn. 65 OM = 66 LP

1 OM = 66 LP x 0.01 mm = 65 OM 1 OM = 0.010153... mm 1 OM 0.0102 mm Hallando la distancia en micras: 1 mm 0.0102 mm x = 1000 x 0.0102 x 1000 1

0.66 65

x = 10.2

CON EL OBJETIVO DE 40X 10 OM = 2.5 LP 1 OM = 2.5 LP x 0.01 mm 10 OM 1 OM = 0.025 10 1 OM = 0.0025 mm Hallando la distancia en micras: 1 mm 0.0025 mm x = 1000 x 0.0025 x 1000 1 x = 2.5

CUESTIONARIO 1) Si 25 espacios del OM corresponden a 20 espacios en la LP. Cunto medir un Paramecium si su longitud es de 50 espacios del OM. Exprese su tamao en nanmetros y en mstrong. 2) Si usted conoce el dimetro. Halle el rea del campo visual: a) A menor aumento b) A mediano aumento 3) Si el dimetro promedio de un glbulo rojo es de 7.5 m. Cuntos glbulos rojos pueden alinearse a lo largo del dimetro del campo visual de su microscopio cuando usa el objetivo de: a) Menor aumento b) Mediano aumento 4) Si un microscopio usa luz UV de longitud de onda de 200 nm y lo usamos con un objetivo de AN de 0.60. Cul es el lmite de resolucin del microscopio?