Microscopia y Colorantes

Introduccin: El Microscopio:
El microscopio (de micro-, , pequeo, y scopio, , observar) es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeos para ser vistos a simple vista. El tipo ms comn y el primero que se invent es el microscopio ptico. Se trata de un instrumento ptico que contiene dos o ms lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refraccin. La ciencia que investiga los objetos pequeos utilizando este instrumento se llama microscopa. El microscopio fue inventado hacia los aos 1610, por Galileo segn los italianos, o por Zacharias Janssen en 1590, en opinin de los holandeses. En 1665 aparece en la obra de William Harvey sobre la circulacin sangunea al observar al microscopio los capilares sanguneos y Robert Hooke publica su obra Micrographia. En 1665 Robert Hooke observ con un microscopio un delgado corte de corcho y not que el material era poroso, en su conjunto, formaban cavidades poco profundas a modo de celditas a las que llam clulas. Se trataba de la primera observacin de clulas muertas. Unos aos ms tarde, Marcello Malpighi, anatomista y bilogo italiano, observ clulas vivas. Fue el primero en estudiar tejidos vivos al microscopio. Durante el siglo XVIII el microscopio tuvo diversos adelantos mecnicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso, aunque no se desarrollaron por el momento mejoras pticas. Las mejoras ms importantes de la ptica surgieron en 1877, cuando Ernst Abbe public su teora del microscopio y, por encargo de Carl Zeiss, mejor la microscopa de inmersin sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener aumentos de 2000. A principios de los aos 1930 se haba alcanzado el lmite terico para los microscopios pticos, no consiguiendo estos aumentos superiores a 500X o 1,000X. Sin embargo, exista un deseo cientfico de observar los detalles de estructuras celulares (ncleo, mitocondria, etc.). El microscopio electrnico de transmisin (TEM) fue el primer tipo de microscopio electrnico desarrollado. Utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de 100.000X. Fue desarrollado por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrnico de barrido (SEM).

(http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio)

Objetivos
Manejar correctamente el microscopio y reconocer sus partes as como observar preparados en fresco y en seco Obtener correctamente un preparado en fresco y en seco y usar adecuadamente los colorantes acido, bsico y neutros en las preparaciones microscpicas Saber correctamente los nombres de las partes del microscopio Incentivar el trabajo en grupo Observar lo que pasaba con las muestras de preparado

Materiales Laboratorio
Microscopio compuesto Mechero de Alcohol Azul metileno Gradillas Asa de koll Wrigth Pipetas Eosina leishman

Alumno
Agua estancada Algodn Alcohol Laminas y laminillas

Lancetas Goteros fsforos

Procedimiento El microscopio: El microscopio tiene 2 partes, una ptica y una mecnica. Parte ptica: 1. El ocular: se encuentra situado en la parte superior del tubo. Su nombre se
debe a la cercana de la pieza con el ojo del observador. Tiene como funcin aumentar la imagen formada por el objetivo. Los oculares son intercambiables y sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de potencias mayores a 20X y otros que poseen una escala micromtrica; estos ltimos tienen la finalidad de medir el tamao del objeto observado.

2. Los objetivos: se disponen en una pieza giratoria denominada revlver y

producen el aumento de las imgenes de los objetos y organismos, y, por tanto, se hallan cerca de la preparacin que se examina. Los objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de inmersin.

(http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_compuesto)

2.1 Clases de objetivos

a. Los objetivos secos: se utilizan sin necesidad de colocar sustancia

alguna entre ellos y la preparacin. En la cara externa llevan una serie de ndices que indican el aumento que producen, la abertura numrica y otros datos. As, por ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es planacromtico, su aumento 40 y su apertura numrica 0,65, calculada para una longitud de tubo de 160 mm. El nmero de objetivos vara con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos de los objetivos secos ms frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X. Por el nmero de aumento son de tres clases: 1: De pequeo aumento = Mayor de 0X y Menor de 10X 2: De medio aumento = Mayor de 10X y Menor de 30X 3: De gran aumento = Mayor de 30X y Menor de 90X

b. Objetivos de inmersin: est compuesto por un complicado

sistema de lentes. Para observar a travs de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparacin, de manera que la lente frontal entre en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son de 100X y se distingue por uno o dos crculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior. Caractersticas: 1: Es el mayor aumento (100X, 150X) 2: La lente frontal es mas pequea 3: lleva inscrita una fraccin: 1/12, o un decimal: 1,20, 1,30 o la palabra ol inmersin 4: De acuerdo con la procedencia lleva una franja o raya negra para facilitar su identificacin
(http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_compuesto#sistema_.c3.b3ptico)

Distancia Focal La distancia focal o longitud focal de una lente es la distancia entre el centro ptico de la lente o plano nodal posterior y el foco (o punto focal) cuando enfocamos al infinito. La inversa de la distancia focal de una lente es la potencia. Para una lente positiva (convergente), la distancia focal es positiva. Se define como la distancia desde el eje central de la lente hasta donde un haz de luz de rayos paralelos colimado que atraviesa la lente se enfoca en un nico punto. Para una lente negativa (divergente), la distancia focal es negativa. Se define como la distancia que hay desde el eje central de la lente a un punto imaginario del cual parece emerger el

haz de luz colimado que pasa a travs de la lente.

Estas distancias focales para los diferentes objetivos son: Pequeo aumento = entre 0,5 y 3 cm. Mediano aumento = entre 3 mm. y 5 mm. Gran aumento = entre 1 mm. y 3 mm. Inmersin = entre 0,8 mm. y 1,20 mm.
(http://es.wikipedia.org/wiki/Distancia_focal)

3. Sistema

de

Iluminacin

Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la preparacin u objeto que se va a observar en el microscopio de la manera adecuada. Comprende los siguientes elementos: a. Fuente de iluminacin: se trata clsicamente de una lmpara incandescente de tungsteno sobrevoltada; en versiones ms modernas con leds. Por delante de ella se sita un condensador (una lente convergente) e, idealmente, un diafragma de campo, que permite controlar el dimetro de la parte de la preparacin que queda iluminada, para evitar que exceda el campo de observacin produciendo luces parsitas. b. El espejo: necesario si la fuente de iluminacin no est construida dentro del microscopio y ya alineada con el sistema ptico, como suele ocurrir en los microscopios modernos. Suele tener dos caras: una cncava y otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones. La cara cncava se emplea de preferencia con iluminacin artificial, y la plana, para natural (luz solar). Los modelos ms modernos no poseen espejos sino una lmpara que cumple la misma funcin que el espejo. c. Condensador: est formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparacin, formando un cono de luz con el mismo ngulo que el del campo del objetivo. El condensador se sita debajo de la platina y su lente superior es generalmente planoconvexa, quedando la cara superior plana en contacto con la preparacin cuando se usan objetivos de gran abertura (los de mayor ampliacin); existen condensadores de inmersin, que piden que se llene con aceite el espacio entre esa lente superior y la preparacin. La abertura numrica mxima del condensador debe ser al menos igual que la del objetivo empleado, o no se lograr aprovechar todo su poder separador. El condensador puede deslizarse verticalmente sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo, bajndose para su uso con objetivos de poca potencia.

d. Diafragma: el condensador est provisto de un diafragma-iris, que

regula su abertura para ajustarla a la del objetivo. Puede emplearse, de manera irregular, para aumentar el contraste, lo que se hace cerrndolo ms de lo que conviene si se quiere aprovechar la resolucin del sistema ptico.
(http://bioservice77.obolog.com/sistema-iluminacion-microscopio-337832)

Parte Mecnica: La parte mecnica del microscopio comprende el pie, el tubo, el revlver, el asa, la platina, el carro y el tornillo micromtrico. Estos elementos sostienen la parte ptica y de iluminacin; adems, permiten los desplazamientos necesarios para el enfoque del objeto. 1. El pie: Constituye la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene
por lo general forma de Y o bien es rectangular. 2. La columna o brazo: llamada tambin asa, es una pieza en forma de C, unida a la base por su parte inferior mediante una bisagra, permitiendo la inclinacin del tubo para mejorar la captacin de luz cuando se utilizan los espejos. Sostiene el tubo en su porcin superior y por el extremo inferior se adapta al pie. 3. La Platina: En los microscopios ms sencillos, la platina consiste sencillamente en una pieza para soportar la preparacin. Esta pieza suele ser muy fuerte, cuadrada o rectangular, con su superficie superior plana, donde se coloca la preparacin, y que generalmente tienen una gran resistencia a los reactivos. La mayor parte de las platinas son lo suficientemente grandes para poder soportar una placa de Petri. Sobre la platina se encuentra unas piezas para la sujecin de la preparacin, de modo que la mismo tiempo que mantiene fija , permite que se deslice sobre la platina al ser accionada con los dedo, lo cual a veces es necesario para poner bajo el campo ptico una parte determinada de la preparacin. Las pinzas no son muy necesarias mientras la platina est horizontal, pero cuando sta se inclina son imprescindibles, ya que de no tenerlas, la reparacin resbalara fcilmente.

4. El tubo: tiene forma cilndrica . El tubo se encuentra en una carretera superior de la columna mediante un sistema de cremalleras, las cuales permiten que el tubo se mueva mediante los tornillos. 5. El Revolver: El revlver consiste generalmente, en una pieza rotatoria
que lleva cuatro objetivos, de modo que al girar esta pieza puede cambiarse de objetivo- Este mecanismo giratorio lleva un muelle que deja al objetivo en la posicin correcta, es decir de modo que su eje ptico coincida exactamente con el del microscopio. Con el fin de mantener limpio lo objetivos, el revlver debe estar hermticamente cerrado. Aunque el sistema de revlver es el ms generalizado, algunos microscopios tienen en su lugar, unos carriles en la parte inferior del tubo, gracias a los cuales pueden ponerse diversos objetivos intercambiables.

6. El Tornillo Macromtrico: El movimiento

de desplazamiento realizado por el tornillo macromtrico se consigue poner un mecanismo de pin y cremallera de dientes diagonales. Con este mecanismo se consigue que, en todo momento, uno o ms dientes del pin estn engrandados con los de la cremallera, lo cual permite un desplazamiento suave, continuo y silencioso, del tubo o de la platina. Para conseguir este engranaje suave, los dientes estn cuidadosamente moldeados y este mecanismo debe manejarse con mucho cuidado para evitar su deterioro por mal uso. 7. El Tornillo Micromtrico: El movimiento de este tornillo se realiza mediante un sistema mecnico del tipo de tornillo y tuerca. El tornillo es de estras muy finas, unas 25 vueltas por centmetro, por lo cual puede producir un movimiento muy lento.Los movimientos del tornillo o de la tuerca accionan un elevador de brazos desiguales, de modo que el movimiento del tornillo o de la tuerca queda reducido en una proporcin de 5:1. Gracias a este mecanismo, el movimiento de la cabeza del tornillo micromtrico produce un desplazamiento muy lento del tubo o de la platina.En la figura puede verse un mecanismo de este tipo. El tornillo, al girar sobre la tuerca fija, mueve un disco que forma cuerpo con l y que acta sobre uno de los brazos de la pieza elevadora. El otro brazo est sujeto a una pieza deslizante que lleva el tubo. De este modo, para poner un ejemplo, una vuelta de tornillo micromtrico produce un desplazamiento del tubo de 0.12 mm.
(http://www.euita.upv.es/varios/biologia/Pr%C3%A1cticas/Pr%C3%A1ctica%201.pdf)

 PROCESO DE ENFOQUE
1. Iluminacin: Con el objetivo de menor aumento y mirando por el ocular se regula la cantidad de luz encendiendo el foco y regulando el condensador y el diafragma hasta que el campo esta perfectamente iluminado 2. Colocacin de la preparacin: Se sita en la platina de manera que el objeto de observacin quede situado en el centro de la abertura 3. Enfoque: Con el objetivo de menor aumento y MIRANDO POR FUERA se acerca el objetivo de menor aumento a la preparacin, moviendo el tornillo macromtrico. A continuacin mirando por el ocular se va separando el objetivo de la preparacin hasta que aparezca enfocada. Finalmente se ajusta el enfoque con el tornillo micromtrico. 4. SIN DESENFOCAR se da vuelta al revolver para situar el objetivo de mediano aumento. Puede que se necesite ajustar la iluminacin y el enfoque. 5. Para retirar la preparacin se sita el objetivo de menor aumento, se separa la platina del objetivo y ya se puede retirar la muestra Para calcular os aumentos en los que se ha realizado la observacin se multiplican los aumentos del ocular por los del objetivo.
(http://encina.pntic.mec.es/~esarment/imagenes/practicas/PDescripcionMOp.pdf)

Preparados y coloraciones
No podemos estudiar una muestra sin antes llevar a cabo una preparacin del mismo para poder observarlo. La preparacin del objeto de estudio puede resultar un proceso simple o, por el contrario, ser bastante complejo, dependiendo de la naturaleza y caractersticas de aquello que queremos observar. Precisamente de esto, de los diferentes tipos de preparacin, es de lo que hablaremos a continuacin, exponiendo los diversos tipos de estudio que podemos realizar y las distintas tcnicas que se utilizan para ello. La preparacin de una muestra para estudiarla al microscopio ptico es diferente segn la naturaleza del material que ha de ser observado, orgnico o inorgnico, y si es orgnico, segn queramos observar propiedades que slo se manifiestan en estado vivo, o si queremos observar morfologa y estructuras, que no se modifican cuando sobreviene la muerte celular.

Preparados en fresco:
son aquellos en donde la sustancia examinada no se encuentra fija en la lamina portaobjetos, esta sumergida en una sustancia liquida y generalmente se utiliza una lamina cubreobjetos para observacin. Esta clase de preparados se observa comnmente con objetivos a seco y el microscopio en posicin normal.

 Procedimiento
Limpiar bien una lamina portaobjetos Con un gotero colocar una gota de agua estancada en el centro de la lamina portaobjetos y sobre la muestra el cubreobjetos Efectuar la iluminacin del microscopio Colocar el portaobjetos en la platina del microscopio, fijarla con la pinzas. La parte que contiene el cubreobjetos y la preparacin, deber estar sobre el orificio de la platina Enfocar, mientras observa por el ocular, eleve ligeramente el tubo con el tornillo macromtrico hasta que visualice el preparado, haga la imagen mas ntida con el tornillo micromtrico El ajuste de la intensidad de la luz se har con el diafragma Se enfoca girando el tornillo micromtrico, lentamente, hacia atrs o hacia delante para obtener detalles Las observaciones se inician con el objetivo de pequeo aumento. procurando enfocar bien

Despus de haber colocado unas gotas de agua estacada en la lamina y haber seguido las indicaciones del profesor procedimos a ver en el microscopio, primero con el objetivo de 4X all pudimos observar los diferentes microbios y bacterias que contena el agua. Se Llama preparado en fresco al que realizas e inmediatamente lo observas al microscopio, por ejemplo, si va a observar microorganismos utilizas una gota de agua estancada, si quieres ver clulas vivas tomas parte de un tejido y asi ves material fresco.

 Preparacin en seco:
son aquellos en donde la sustancia examinada se encuentra fija a la lamina portaobjetos la observacin de estos preparados, se hace generalmente con la lente de inmersin aunque inicialmente se utilizara los objetivos de menor aumento

Extensin: consiste en extender la sustancia examen en la mina portaobjetos.

tratando de hacerlo en el centro, uniformemente y lo mas finamente posible, utilizando para ello una asa de koll, montadiente(fsforo), etc Frontis: consiste en extender la sustancia examen en el portaobjeto, utilizando para ello dos laminas portaobjetos. En el tercio externo de una de ellas se coloca la sustancia examen, sobre la cual se coloca el borde de la otra lamina, de tal manera que conforme un ngulo de 45 aproximadamente. Despus de observar q la sustancia examen se extiende en todo el borde de la lamina superior, deslizar un frontis fino y uniforme

Coloracin simple: cuando se emplea un solo colorante Procedimiento:

Extensin o frontis: sustancia examen, tomamos la muestra de mucosa labial de un compaero Fijacin: alcohol, calor, etc. Colorear: con un colorante acido o bsico Lavar: lavamos con agua destilada hasta que salga incolora Secar: al medio ambiente o calor moderado Observar: objetivos de pequeo, mediano y gran aumento

En la mucosa labial pudimos observar todo lo que contiene nuestra boca. Gracias al uso del microscopio y los diferente objetivos

 Coloracin neutra: cuando se utiliza un colorante que se va a disociar en su parte acida y bsica Procedimiento: Obtencin de muestra: con una lanceta estril un compaero
realiza un pinchazo en el dedo medio para obtener la muestra Frontis : sustancias examen de sangre Colorear de 3 a 5: colorante leishman Lavar: con agua destilada Observa: con el objetivo pequeo, mediano y gran aumento

En esta muestra pudimos observar los glbulos rojos. De la muestra de sangre de nuestro compaero Discusiones:

o En esta practica de laboratorio se logro demostrar que el microscopio tiene

diversas partes y funciones como

El pie y soporte La columna o brazo El tubo El tornillo macromtrico o macroscopico El tornillo micromtrico o microscopico La platina Las pinzas El revlver El ocular: Fuente de iluminacin: El espejo Condensador Diafragma Como lo dice en la siguiente pagina http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio

o Adems los diversos pasos que debemos seguir para emplear un microscopio de acuerdo con lo enseado por el maestro en el laboratorio y por lo investigado en la siguiente pagina Web: http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_compuesto Conclusiones :

o Se comprob que por mas que lavemos nuestra boca constantemente. Las bacterias no desaparecen por completo y siempre las encontraremos en la boca o Que la sangre tiene miles de glbulos rojos o Que el agua tiene miles de bacterias y microbios que si no es tratada adecuadamente podemos contraer diversas enfermedades