PRCTICA 1.

Determinacin De Protenas Por Los Mtodos De Lowry Y Bradford

OBJETIVOS.
y y y y Conocer y comprender el principio y la metodologa en la que se basan los mtodos de determinacin de protena de Lowry y Bradford. Realizar un anlisis estadstico bsico y aplicar las pruebas: t de Student y F de Fisher; para determinar si existe o no diferencia significativa en la precisin y exactitud entre el mtodo de Lowry y el mtodo de Bradford. Determinar si sustancias no protenicas producen una interferencia en la determinacin de protenas para ambos mtodos. Establecer ventajas y desventajas entre el mtodo de Lowry y el mtodo de Bradford.

DATOS EXPERIMENTALES E INFORME.

a) Mtodo de Lowry y Curva de Calibracin.
Tabla 1.1 - Curva de calibracin de hemoglobina. Mtodo de Lowry A590 Cantidad de Tubo No. Protena ( g) Serie a Serie b 1 2 3 4 5 25 50 75 100 125 0.051 0.124 0.156 0.197 0.236 0.050 0.102 0.162 0.187 0.259

G1.1 - Curva de calibracin de hemoglobina. Mtodo de Lowry

0.3 Absorbancia (590nm) 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 20 40 60 80 100 120 140

y = 0.0019x + 0.0105 R = 0.9779

Cantidad de Protena ( g)

De la ecuacin obtenida, interpretamos al valor 0.0105 (ordenada al origen) como la absorbancia de nuestro blanco con una cantidad de protena igual a 0 g, al valor 0.0019 (valor de la pendiente) como la razn de cambio entre la cantidad de protena y la absorbancia, es decir, el factor de calibracin de la curva. As tambin podemos decir que la ecuacin y = 0.0019x + 0.0105 cumple la Ley de Bouger y Beer (A= .d.c)1 en el intervalo [25, 125], teniendo un factor de calibracin de la curva =526.32 que en sistemas fotomtricos estables permanece constante y permite realizar un clculo sencillo para determinar la concentracin de la muestra multiplicando el factor de calibracin ( ) por la absorbancia (A) y Anlisis estadstico.
Tabla 1. 2 Rplicas para el Anlisis Estadstico Cantidad de Tubo No. A590 Protena ( g) 1 0.131 63.42 2 0.119 57.11 3 0.128 61.84 4 0.082 37.63 5 0.092 42.89 6 0.142 69.21 7 0.145 70.79 8 0.105 49.74 9 0.109 51.84 10 0.122 58.68 56.3 = S= 10.83 CV= 19.23% %Er = -24.91 2 S= 117.28 L.C.M. = 7.7

Frmulas usadas:


 

  

La cantidad de la protena se obtuvo de la ecuacin de la curva de calibracin:      

Despejando x, se tiene:

Por ejemplo, para la absorbancia 0.131 se calcula:

Donde A = la absorbancia de la muestra, c = concentracin, d = el espesor recorrido por la radiacin y = el factor de calibracin.

y Interferencias en el desarrollo del mtodo de Lowry

Tabla 1.3 Efecto de algunas sustancias no protenicas en el Mtodo de Lowry Tipo de Tubo Cantidad de Sustancia A590 Interferencia No. Protena ( g) Generada 1 0.124 59.74 TRIS 1M pH. 7.0 No Interferencia 2 3 4 5 Glicerol al 1% (v/v) Detergente comercial al 1% Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1.0% cido tricloro actico (TCA) al 5% 0.163 0.157 0.141 0.154 L.C.I. = L.C.S.= 80.26 77.11 68.68 75.53 48.6 64.1 Positiva Positiva Positiva Positiva

El mtodo de Lowry se da en condiciones alcalinas pues el Cu2+ se reduce a Cu+ formando complejos con los enlaces peptdicos, siendo sustancias acidulantes, quelantes o reductores de Cu+ algunos interferentes de este mtodo. Por lo que de la Tabla 1.3 comparando los L.M.C. Inferior (L.C.I.) y Superior (L.C.S.) con la cantidad de protena se determina si la interferencia se debe a la sustancia, siendo positiva si el valor es mayor al L.C.S. y negativa si es menor a L.C.I. b) Mtodo de Bradford. y Curva de Calibracin.
Tabla 1.4 Curva de calibracin de hemoglobina. Mtodo de Bradford A590 Cantidad de Tubo No. Protena ( g) Serie a Serie b 1 2 3 4 5 25 50 75 100 125 0.167 0.33 0.345 0.375 0.383 0.22 0.35 0.37 0.381 0.405

Curva de calibracin de hemoglobina. Mtodo de Bradford

0.5 Absorbancia (590nm) 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 20 40 60 80 100 120 140

y = 0.0018x + 0.2009 R = 0.7153

Cantidad de Protena ( g)

Para Bradford se obtiene el valor de 0.2009 (ordenada al origen), el valor 0.0018 (pendiente), adems la ecuacin y = 0.0018x + 0.2009 cumple la Ley de Bouger y Beer en el intervalo [50, 125] y tiene un factor de calibracin de la curva =555.55. y Anlisis Estadstico.
Tabla 1. 5 Rplicas para el Anlisis Estadstico Cantidad de Tubo No. A590 Protena ( g) 1 0.319 65.61 2 0.277 42.28 3 0.342 78.39 4 0.329 71.17 5 0.289 48.94 6 0.329 71.17 7 0.293 51.17 8 0.319 65.61 9 0.308 59.50 10 0.321 66.72 62.1 = S= 11.39 CV= 18.36% %Er = -17.26 2 S= 129.78 L.C.M. = 8.1

y Interferencias en el desarrollo del mtodo de Bradford

Tabla 1.6 Efecto de algunas sustancias no protenicas en el Mtodo de Bradford Tipo de Tubo Cantidad de Sustancia A590 Interferencia No. Protena ( g) Generada 1 0.510 171.72 TRIS 1M pH. 7.0 Positiva 2 3 4 5 Glicerol al 1% (v/v) Detergente comercial al 1% Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1.0% cido tricloro actico (TCA) al 5% 0.434 0.524 0.354 0.460 L.C.I. = L.C.S.= 129.50 179.50 85.06 143.94 53.9 70.2 Positiva Positiva Positiva Positiva

Del mtodo de Bradford se espera que carbohidratos, detergentes y lcalis interfieran en la determinacin de protenas, de los datos obtenidos y los L.M.C. se estableci que todas las sustancias son interferentes para Bradford.

c) Comparacin de Bradford Vs Lowry de precisin y exactitud.

Tabla 1.7 Comparacin Bradford Vs Lowry

Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A590 Bradford 0.319 0.277 0.342 0.329 0.289 0.329 0.293 0.319 0.308 0.321 Lowry 0.131 0.119 0.128 0.082 0.092 0.142 0.145 0.105 0.109 0.122 D= SD= t cal= F cal= t tab= F tab= Di 0.188 0.158 0.214 0.247 0.197 0.187 0.148 0.214 0.199 0.199 0.20 0.03 21.885 1.11 2.262 4.03

Valor F t

Tabla 1.8 Prueba F y t de Student Calculado Tablas Interpretacin 1.11 < 4.03 N.D.S. El mtodo de Lowry 21.885 > 2.262 es ms inexacto

DISCUSIN.
El mtodo de Lowry es un mtodo para determinar la cantidad de protenas por desarrollo de color a 590nm relativamente simple, repetible y sensible (25-100 g), sin embargo, toma ms tiempo al tener que incubar en dos ocasiones para que el reactivo desarrolle color. En ste mtodo la curva de calibracin sigui con ms fidelidad la ley de Bouguer y Beer teniendo una R2 = 0.9779, en el anlisis estadstico bsico la media fue baja comparada con el valor esperado de 75 g y finalmente en cuanto a las sustancias interferentes, el mtodo de Lowry es poco selectivo pues de las 5 sustancias interferentes, nicamente para TRIS 1M, pH 7.0 no provoc una interferencia; aunque esto puede ser cuestionado debido a que los analistas que elaboraron las experiencias fueron diferentes, por lo que los L.C.M. son difcilmente aplicables para esta prctica. En cuanto al mtodo de Bradford, tambin es un mtodo simple, repetible, sensible (1-15 g) y adems rpido, su desarrollo de color es en la longitud de onda de 595nm. Su curva tipo present una zona no linean [25,50] y present una R2 = 0.7153, el anlisis estadstico bsico fue mejor desarrollado, sin embargo, las muestras de interferencia presentaron una cantidad muy elevada de protena, dando interferencias positivas que bien podran ser debido a las sustancias interferentes o ms probablemente al analista que las realiz.

Comparando Bradford contra Lowry, tenemos que Bradford es ms rpido y sensible, sin embargo presenta mayor interferencia con las sustancias utilizadas por ste equipo, por lo que si se tuviera que escoger uno de stos para realizar una determinacin en la presencia de los interferentes usados Lowry sera el ms indicado, a pesar de ser ms tardado, as tambin Lowry present una linealidad ms definida y prxima a la ecuacin de Bouguer y Beer y una R2 mucho mejor y en el anlisis estadstico bsico nuestro analista es ms exacto con Bradford que con Lowry, esto se demuestra estadsticamente, pues entre ambos mtodos no existe diferencia significativa en la precisin (Prueba F) pero si existe en la inexactitud (Prueba t de Student) siendo Lowry el ms inexacto. La determinacin de protenas por medio de anlisis fotomtricos, son mtodos destructivos, pues las muestras una vez desarrollado el color no pueden ser usadas nuevamente, sin embargo, son las pruebas ms sensibles para ste objetivo, algunos mtodos son, en orden descendente de sensibilidad: cido Bicinconnico, Bradford, Lowry y Biuret. Los mtodos fotomtricos siguen la ley de Bouguer y Beer, por lo que es fcil determinar su factor de calibracin de la curva, y debido a su comportamiento lineal y la relacin pareada de las muestras es de fcil anlisis estadstico.

CONCLUSIONES.
y Los mtodos de determinacin de protena de Lowry y Bradford son mtodos fotomtricos, que obedecen la ley de Bouguer y Beer, en ambos casos los reactivos provocaron un desarrollo de color debido a complejos formados con las protenas, la caracterstica medida fue la absorbancia utilizando un espectrofotmetro a 590nm (Lowry) y 595nm (Bradford) al 100% de transmitancia, a travs de la cual se pudo realizar la curva de calibracin para la cuantificacin de protenas. Para ambos mtodos se realiz un anlisis estadstico bsico, obteniendo su media (x), desviacin estndar (s), coeficiente de variacin (C.V.), porcentaje de error (%Er), varianza (S2) y el lmite de confianza media (L.C.M.); con stas herramientas estadsticas y al realizar las pruebas F y t de Student determinamos que ambos mtodos fueron igual de precisos, sin embargo, el mtodo de Bradford fue ms exacto. Tanto Lowry como Bradford presentaron interferencia debido a sustancias no protenicas, sin embargo, las obtenidas en sta prctica no son las esperadas, esto es probablemente al diferente trabajo realizado entre analistas. El mtodo de Bradford estadsticamente es mejor, debido a que ambos son igual de precisos y sensibles, pero Bradfo1d es ms exacto