PPTIDOS ANTIMICROBIANOS Y SU PARTICIPACIN EN LA DEFENSA CONTRA INFECCIONES BACTERIANAS

Marta Gajardo R. Prof. Asociado, Departamento de Patologa, Facultad de Odontologa, Universidad de Chile. mgajardo@odontologia.uchile.cl Gittith Snchez P. Prof. Asociado, Programa de Biologa Celular y Molecular, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. gsanchez@med.uchile.cl

A lo largo de nuestra vida, los seres humanos estamos en contacto permanente con diferentes especies bacterianas. Algunas de ellas son capaces de colonizar fcilmente las superficies corporales para establecerse como miembros de la microbiota normal y, como parte de esta microbiota, pueden desarrollar un rango de asociaciones simbiticas con el hospedero humano. Hay tres tipos principales de simbiosis: mutualismo, comensalismo y parasitismo. En una relacin de mutualismo ambos miembros de la asociacin se benefician. En cambio, el comensalismo, en que no se produce beneficio ni dao aparente, y el parasitismo, en que un miembro vive a expensas del otro, son asociaciones que permiten al microorganismo llegar a actuar como patgeno (patgenos potenciales) y causar enfermedad. Patgenos potenciales tambin pueden ser oportunistas, ya que viviendo en interaccin comensal o parasitaria no producen enfermedad a menos que tengan la oportunidad para hacerlo. Otras bacterias provenientes del medio ambiente externo (exgenas) no se asocian normalmente con el hospedero excepto cuando causan enfermedad. Estos patgenos obligados pueden encontrarse, aunque en raras ocasiones, como miembros de la microbiota normal en portadores asintomticos o en personas recuperadas de la enfermedad. A pesar de la continua asociacin entre el hospedero humano y patgenos potenciales o patgenos obligados, es poco frecuente que estos microorganismos lleguen a causar enfermedad. Esto se debe, en gran medida, a la efectividad de los mecanismos defensivos del hospedero, los cuales restringen la invasin por patgenos endgenos y nos protegen contra patgenos exgenos. Ambos, hospedero y microbio, se encuentran en una interaccin dinmica cuyo resultado depende de los factores de virulencia del microbio y de la capacidad de resistencia del hospedero. Los vertebrados en general, cuentan con un sistema complejo y muy desarrollado de defensas antimicrobianas para protegerse durante las distintas etapas del proceso infeccioso. Estas defensas se han agrupado en dos grandes categoras: innatas o naturales y adquiridas o adaptativas.

Las defensas innatas o naturales, tambin llamadas constitutivas, son comunes a todos los individuos sanos y protegen contra la invasin por bacterias de la microbiota normal, o contra la colonizacin, infeccin y enfermedad causadas por patgenos. Estas defensas estn siempre disponibles, tienen una especificidad limitada y estn dirigidas a contrarrestar las estrategias generales utilizadas por los patgenos para invadir el organismo. Sin embargo, stas pueden ser insuficientes para proteger al hospedero contra la invasin. Los patgenos que evaden o superan las defensas innatas, usualmente son susceptibles a las defensas adquiridas. En general, las reacciones de inmunidad innata producen respuestas similares frente a encuentros sucesivos con el mismo agente infeccioso y constituyen la primera barrera defensiva al limitar, detener o eliminar infecciones microbianas. Las defensas adquiridas o adaptativas, tambin llamadas inducibles, deben ser inducidas o activadas por la exposicin del hospedero a un patgeno, como ocurre durante una infeccin. A diferencia de las defensas naturales, stas no estn disponibles previo al encuentro con dicho patgeno, son especficamente dirigidas contra l y tienen la capacidad de recordar el primer encuentro para desarrollar una respuesta ms rpida, efectiva y duradera, frente a encuentros posteriores con el mismo patgeno. El estado de resistencia generado de esta manera en el hospedero, se conoce como inmunidad adquirida o adaptativa. La inmunidad innata constituye la rama evolutivamente ms antigua de los mecanismos defensivos, ya que en plantas y animales se han observado mecanismos moleculares similares para responder a patgenos. Entre los diversos componentes de la inmunidad innata, que comprende barreras epiteliales, clulas y molculas, en la actualidad ha cobrado gran importancia el estudio de los pptidos con actividad antimicrobiana. Investigaciones en este tema han permitido identificar ms de 800 pptidos antimicrobianos diferentes sugiriendo su gran relevancia biolgica. En este artculo se presenta un breve revisin sobre la estructura, clasificacin y mecanismos de accin de pptidos antimicrobianos, molculas producidas por muchos tipos de clulas y tejidos en una variedad de especies de invertebrados, de plantas y de animales, que incluye adems, ciertas citoquinas y quimioquinas, algunos neuropptidos y hormonas peptdicas y fragmentos de protenas de mayor tamao. Caractersticas estructurales de los pptidos antimicrobianos El tamao de estos pptidos vara desde seis residuos de aminocidos, para pptidos aninicos, a ms de 59 para algunos pptidos catinicos. Tambin se han reportado dipptidos y tripptidos que poseen actividad antimicrobiana. Los pptidos catinicos (cargados positivamente) son ricos en arginina y lisina, mientras que los pptidos a aninicos (cargados negativamente) son ricos en cidos asprtico y glutmico. Pptidos aninicos que contienen zinc, o pptidos catinicos muy cargados, son ms activos que pptidos menos cargados o neutros.

En cuanto a su conformacin y estructura, los pptidos antimicrobianos pueden adoptar una variedad de estructuras secundarias, incluyendo -hlices y estructuras antiparalelas de lmina . En general, los pptidos son ms activos cuando presentan una estructura secundaria mejor definida. La hidrofobicidad caracterstica de algunos pptidos, les permite insertarse dentro de la bicapa lipdica, y mediante la amfipaticidad pueden interactuar con las regiones polares y apolares de ella. Esta ltima es una propiedad determinada por la alineacin de aminocidos hidroflicos en un lado de la molcula helicoidal, y de aminocidos hidrofbicos en el lado opuesto. Otros pptidos presentan una separacin espacial de residuos polares e hidrofbicos lo cual, como en los casos anteriores, tambin les permite desestabilizar la estructura de la membrana microbiana, blanco de su accin. Clases de pptidos antimicrobianos Los pptidos antimicrobianos conocidos hasta ahora, se han clasificado en cinco subgrupos de acuerdo a su composicin aminoacdica y a su estructura. Un primer subgrupo contiene pptidos antimicrobianos aninicos, pequeos, ricos en cido glutmico y cido asprtico, los que se han aislado de extractos de surfactante, fludo de lavado bronquioalveolar y clulas del epitelio respiratorio. Ellos son producidos en concentraciones milimolares, requieren Zn++ como cofactor para su actividad antimicrobiana y son activos contra bacterias Gram negativo y Gram positivo. Otro subgrupo es el de pptidos catinicos lineales -helicoidales, que contiene alrededor de 290 pptidos catinicos cortos (<40 residuos de aminocidos). Carecen de residuos cistena y a veces tienen una zona flexible en la mitad de la molcula. En solucin acuosa, muchos de estos pptidos tienen una estructura desordenada, pero en presencia de ciertas sustancias tales como vesculas de fosfolpidos, liposomas o lpido A, una parte o toda la molcula es convertida en -hlice. Se ha observado que un mayor contenido de -hlice en los pptidos, se correlaciona con una actividad antimicrobiana ms fuerte. Como el subgrupo anterior, estos pptidos son activos contra bacterias Gram positivo y Gram negativo. Pptidos catinicos enriquecidos en ciertos aminocidos, constituyen el tercer subgrupo. Hay alrededor de 44 pptidos catinicos de este tipo, entre los cuales se encuentran pptidos salivales pequeos, ricos en histidina. Estos pptidos carecen de residuos cistena y son lineales, aunque algunos pueden formar espirales extendidos. El cuarto subgrupo es el de pptidos aninicos y catinicos que contienen cistena, forman enlaces disulfuro y estructuras estables de lminas . Este subgrupo tiene aproximadamente 380 miembros, entre los que se encuentra una familia muy diversa de molculas llamadas defensinas. Hay alrededor de 55 -defensinas que incluyen pptidos humanos producidos por neutrfilos y cryptidinas producidos por clulas del epitelio intestinal. Tienen 29 a 35 aminocidos, incluyendo 6 cistenas unidas por 3 enlaces disulfuro

intracadena. Este subgrupo tambin incluye alrededor de 90 -defensinas humanas y de animales, las que contienen 36 a 42 aminocidos, incluyendo 6 cistenas unidas por 3 enlaces disulfuro intracadena, como en el caso anterior. Por ltimo, el quinto subgrupo est formado por pptidos aninicos y catinicos que son fragmentos de protenas grandes. Estos fragmentos tienen actividad antimicrobiana y son similares en composicin y estructura a los pptidos del subgrupo anterior. Como ejemplos, en humanos tenemos los pptidos lactoferricina proveniente de lactoferrina y dominios antimicrobianos derivados de hemoglobina y lisozima. Adems de los subgrupos mencionados, existe una familia de pptidos antimicrobianos con estructura similar al colgeno y que actan como lectinas uniendo manosa por lo cual se han denominado Colectinas. Adems de su accin antimicrobiana, estos pptidos pueden activar complemento por la va de las lectinas y actuar como opsoninas, facilitando la fagocitosis.

Mecanismos de accin antimicrobiana de los pptidos Atraccin por la clula bacteriana. La muerte microbiana mediada por pptidos puede ser muy rpida. Se ha reportado que algunos pptidos lineales -helicoidales catinicos destruyen bacterias muy rpidamente, por lo que caracterizar las etapas que preceden a la muerte celular constituye un gran desafo. Otros pptidos del mismo grupo demoran 15 a 90 minutos en ejercer su efecto bactericida. Cualquiera sea el tiempo y mecanismo utilizado para lograr la muerte del microbio, el pptido debe primero ser atrado a la superficie microbiana. El mecanismo ms directo es la unin electrosttica de pptidos catinicos a componentes de la superficie bacteriana que presentan una carga neta negativa, por ejemplo fosfolpidos aninicos y grupos fosfatos del LPS, en bacterias Gram negativo, y cidos teicoicos en bacterias Gram positivo. Unin a la membrana celular. Posteriormente, el o los pptidos que se encuentran en estrecho contacto con la clula bacteriana, deben atravesar el polsacrido capsular, para poder interactuar con la membrana celular externa. Una vez que los pptidos han contactado con la membrana plasmtica, pueden interactuar con la bicapa lipdica. Insercin del pptido y permeabilizacin de la membrana celular. Se han descrito tres modelos principales de posibles mecanismos para lograr la permeabilizacin de membranas por estos pptidos: barrel-stave (barril sin fondo), toroidal pore (poro toroidal) y carpet (carpeta). En el modelo barrel-stave, los pptidos unidos se agregan y se insertan en la bicapa de modo que las regiones hidrofbicas de los pptido se alinean con la regin del core lipdico de la membrana, dejando las regiones hidroflicas hacia el lmen central. Se forma as un poro transmembrana muy similar a un barril sin fondo cuyas paredes son los pptidos helicoidales. En cambio, en el modelo modelo de poro toroidal, los pptidos unidos se agregan y se insertan en la membrana e inducen la monocapa de lpidos a curvarse a travs del poro, de

modo que las regiones polares de ambas capas de la membrana llegan a unirse. As, las paredes del poro quedan formadas por las cabezas polares de los lpidos de membrana y por los pptidos insertados en ella. En el modelo carpeta, los pptidos se acumulan en la superficie de la bicapa cubriendo la superficie de la membrana celular como una carpeta. En altas concentraciones estos pptidos interrumpen la continuidad de la membrana insertndose en la membrana en paralelo a la bicapa lipdica, mediante sus regiones hidrofbicas. Las regiones polares de los pptidos quedan expuestas al exterior, de modo que actan de manera similar a los detergentes para desintegrar finalmente la membrana formando micelas. Se ha sugerido que canales inicos, poros transmembrana y ruptura extensiva de la membrana, no representan tres modos de accin completamente diferentes sino que existe una continuidad entre ellos. En relacin a los modelos de muerte intracelular, hay evidencia creciente que indica que los pptidos antimicrobianos tienen adems blancos intracelulares. Una vez en el citoplasma, los pptidos pueden alterar la formacin del septum citoplsmico, inhibir la sntesis de pared celular, inhibir la sntesis de cidos nucleicos, inhibir la sntesis de protenas o inhibir la actividad enzimtica. Como la actividad antimicrobiana de los pptidos puede tambin impedir las infecciones por hongos, especialmente aquellas causadas por Cndida sp., y por algunos virus, en la actualidad se considera que stos actan como verdaderos antibiticos naturales de amplio espectro. Sus propiedades, analizadas brevemente en este artculo, los presentan como factores de gran efectividad, simples y muy conservados a lo largo de la evolucin, constituyendo un importante componente de la defensa antimicrobiana innata. Ms an, se ha demostrado que los pptidos antimicrobianos son molculas multifuncionales universales ya que, ms all de la accin antimicrobiana, sus funciones protectoras se extienden a la actividad antitumoral, actividad mitognica, participacin en las vas de transduccin de seales, quimiotaxis de linfocitos y estimulacin de la respuesta inmune adaptativa. As, uno de los focos de mayor inters para la investigacin biomdica actual es la elucidacin de los mecanismos de accin de los pptidos antimicrobianos y de los procesos biolgicos que subyacen la capacidad de stos para actuar como verdaderos antibiticos naturales. El propsito de estos estudios es desarrollar nuevas estrategias de tratamiento de las enfermedades infecciosas, como alternativa al uso indiscriminado de antibiticos y en consecuencia a la aparicin de cepas resistentes frente a ellos.

Referencias Brogden Kim A. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nature Reviews. Microbiology. 2005, 3:238-250 www.nature.com/reviews/micro The Nature of Host-parasite Interactions in Humans. En: The Nature of Host-Parasite Interactions. 2002 Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology. Todars Online Textbook of Bacteriology The Constitutive Host Defenses against Microbial Disease. En: Ken Todars Microbial World. University of Wisconsin Madison 2005 Kenneth Todar University of WisconsinMadison Department of Bacteriology. Bacteriology at UW - Madison Wojciech K, Marcin O and ukasiak J. Novel properties of antimicrobial peptides. Review. Acta Bioqumica Polonica 2003, 50(2):461-469 Ganz, T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nature Rev Immunol 2003, 3:710-720 Zasloff M. Atimicrobial peptides of multicellular organisms. 2002. Nature 415:389-395