Comparacin de tres mtodos para la determinacin de Atorvastatina en comprimidos

Introduccin La Atorvastatina es un compuesto sinttico del grupo de las estatinas, es un inhibidor competitivo de la HMG- CoA- reductasa (Tamargo & Vizcano, 2009), enzima limitante de la sntesis de colesterol endgeno. Utilizadas en hiperlipidemias, las estatinas, adems mejoran la sntesis de xido ntrico y la funcin endotelial, estabilizan la placa de ateroma, exhiben propiedades antiinflamatorias, antiproliferativas y antitrombticas, aumentan la fibrinlisis y disminuyen la presin arterial. (Tamargo & Vizcano, 2009) La semivida plasmtica es de 14 hs y se transforma en el hgado a metabolitos activos de vida media 30 hs. Se elimina por va biliar (75-80 %) y renal (5-20 %). (Tamargo & Vizcano, 2009) Presenta doce formas polimrficas, siendo la Forma cristalina I comercializada por Pfizer con el nombre de Lipitor por primera vez. Actualmente existen en el mercado comprimidos conteniendo diferentes polimorfos y la forma amorfa (Skorda & Kontoyannis, 2008). Atorvastatina clcica es altamente susceptible al calor, la humedad, la luz y a pH bajos. La forma amorfa es mucho ms inestable que la forma cristalina (Wankhede, Krishnaprasad, Manjunath, & Debnath, 2010). Debido a la falta de un mtodo sencillo estandarizado en farmacopea para la determinacin de Atorvastatina, se realiz una bsqueda bibliogrfica de mtodos de cuantificacin. El objetivo de este estudio es comparar tres mtodos diferentes de determinacin de Atorvastatina en comprimidos: 1) Mtodo UV por solubilizacin hidrotrpica con Urea 2.0 M (Jadhav, Bhatia, & Thamake, 2010); 2) Mtodo de colorimetra espectrofotomtrica: formacin de complejo de Atorvastatina con Ferricianuro de K y Cloruro frrico (Jadhav, Bhatia, & Thamake, 2010); 3) Mtodo por HPLC (Zaheer, Farooqui, Mangle, & Nikalje, 2008). Para los tres mtodos se realiz una curva de calibracin y se determin la concentracin de una muestra de comprimidos de 10 mg de Atorvastatina. Materiales Reactivos Atorvastatina clcica cristalina 95,0 %(Donacin Bag, Ind- Swift Laboratories Limited), Atorvastatina clcica amorfa 98,0 %(Donacin Bag, Ind- Swift Laboratories Limited); Urea para anlisis 99% (Biopack), Ferricianuro de potasio (Evans), Hierro (III) Cloruro Hexahidrato reactivo analtico (Anedra), Metanol Absoluto pro-anlisis (Cicarelli Laboratorios), Acetonitrilo grado HPLC 99,9 %(J. T. Backer), Metanol grado HPLC 99,9% (Carlo Erba Reagents), potasio fosfato monobsico anhidro reactivo analtico 99,5% (Anedra), Agua bidestilada. Comprimidos de Atorvastatina 10 mg (Nombre del producto: Lipovastatin Klonal, Laboratorio: Klonal Cardiologa). Cinta indicadora de pH Merck (rango pH 0-14). Instrumentos Balanza analtica OHAUS Adventurer . Ultrasonido CLEANSON modelo KT-1106. Bomba de vaco Silfab. Agitador magntico Decalab. Espectofotmetro UV GBC Cintra 6 y software UVLite 1.1.

UFLC Shimadzu Prominence con detector de arreglo de diodos UV y software LCsolution versin 1.23 (LabSolutions Corporation Shimadzu), Japn. Columna LiChrosorb RP-18, 250 x 4 mm (5 um) (Merck, Alemania). Mtodos 1) Solubilizacin hidrotrpica A partir de una solucin madre de concentracin 0,1 mg/ml de Atorvastatina clcica cristalina se realiz una curva de calibracin de 5,93-19,96 ug/ml. La solucin madre se realiz pesando 10,4 mg y agregando 70 ml de una solucin de Urea 2,0 M, fue sonicada por 10 minutos y llevada a volumen con agua destilada en matraz aforado de100 ml. Se realiz un barrido en el espectrofotmetro UV entre 200 y 400 nm, y se ley a 240 nm. Diez comprimidos fueron pesados y molidos. Tres alcuotas correspondientes a 10 mg de Atorvastatina fueron pesadas y disueltas en 70 ml de Urea 2,0 M. Fueron sonicadas 10 minutos y llevadas a volumen con agua destilada. Luego fueron filtradas y diludas a una concentracin de 12 ug/ml. Se leyeron a 240 nm y calculadas sus concentraciones.

2) Colorimetra espectrofotomtrica Solevente: Metanol:Agua (60:40). Reactivos: Cloruro frrico 0,3 %, Ferricianuro de potasio 0,02%. A partir de una solucin madre de concentracin 0,1 mg/ml de Atorvastatina clcica cristalina se realiz una curva de calibracin de 21,6-100 ug/ml. La solucin madre se realiz pesando 10,0 mg y agregando 70 ml de solvente metanol: agua, fue sonicada por 10 minutos y llevada a volumen con en el mismo solvente en matraz aforado de100 ml. A partir de la madre se confecciona la curva de calibracin agregando en cada matraz 10 ml de cloruro frrico 0,3% y 10 ml de ferricianuro de potasio 0,02 % llevando a volumen con agua destilada. Se deja reaccionar 30 minutos hasta complejo estable color verde. Se realiz un barrido en el espectrofotmetro UV entre 400 y 800 nm, y se ley la absorbancia a 780 nm. Diez comprimidos fueron pesados y molidos. Tres alcuotas correspondientes a 10 mg de Atorvastatina fueron pesadas y disueltas en 70 ml de solvente metanol:agua. Fueron sonicadas 10 minutos y llevadas a volumen con solvente. Luego fueron filtradas. Se tomaron 15 ml del filtrado, se colocaron en matraz de 50 ml, se agregaron 10 ml de cloruro frrico 0,3% y 10 ml de ferricianuro de potasio 0,02%, y llevado a volumen con agua destilada (concentracin de 32 ug/ml aprox.). Se leyeron las soluciones a 780 nm y calculadas sus concentraciones.

HPLC Condiciones cromatogrficas: Temperatura 25 C. Fase mvil Metanol:Acetonitrilo:Buffer fosfato pH 6,8 (45:45:10). Flujo: 0,5 ml/min y 1,0 ml/min. Deteccin a 246 nm. Volumen de inyeccin: 20 uL.

A partir de dos soluciones madres de 0,3 y 0,4 mg/ml, se realiz una curva de calibracin de Atorvastatina amorfa 98,0% de 15,92 a 36,23 mcg/ml. Las soluciones madres se realizaron pesando exactamente 15,4 mg y 20,3 mg de Atorvastatina amorfa (98,0%) respectivamente. Se adicion fase mvil hasta el lmite inferior del vstago del matraz de 50 ml y se sonic 10 minutos. Luego se llev a volumen. Se realizaron 4 diluciones cruzadas y fueron inyectadas por duplicado. La elucin fue llevada a cabo a 0,5 ml de Fase mvil/min Aparte, se realiz una solucin madre de Atorvastatina cristalina de 21,1 mg en 50 ml en las mismas condiciones. Se le realiz una dilucin 2/25 y fue inyectada en iguales condiciones. Esto se realiz para confirmar el ttulo y ver presencia de impurezas y resolucin. Luego, con las mismas diluciones se duplic la velocidad de elucin a 1,0 ml FM/min, como estipulaba el trabajo citado (Zaheer, Farooqui, Mangle, & Nikalje, 2008). Obtenindose la correspondiente curva de calibracin. Diez comprimidos fueron pesados y molidos. Dos alcuotas correspondientes a 10 mg de Atorvastatina fueron pesadas y disueltas en fase mvil. Fueron sonicadas 10 minutos y llevadas a volumen de 50 ml en matraz aforado. Luego fueron filtradas. Se tomaron 3 ml del filtrado, se colocaron en matraz de 25 ml y se llev a volumen (concentracin de 24 ug/ml aprox.). Se filtr e inyect las muestras por duplicado.

Resultados 1) Solubilizacin hidrotrpica

Conc. ATORV 5,93 7,98 9,88 11,97 15,81 19,96

Abs. Absorvancia 0,237 0,335 0,387 0,483 0,624 0,782

Curva calibracin Atorvastatina 1 cristalina 0.5 y = 0.0385x + 0.0162 R = 0.9984 0 0 10 Concentracin 20

Muestra 1 2 3 Promedio CV%

mg Atorv por comp. 10,96 10,55 10,66 10,73 1,9

%SVD 109,57 105,54 106,64 107,25 1,9

2) Colorimetria

El mtodo colorimtrico ensayado segn la tcnica encontrada (Jadhav, Bhatia, & Thamake, 2010) no fue reproducible. Los tiempos de reaccin fueron impredecibles y el complejo termin como precipitado azul.

3) HPLC Concentracin 15,92 24,15 31,84 36,23 rea 1728544,5 2449205,0 3488516,5 3792931,0 Curva calibracion ATORV por HPLC a 0,5 ml/min 6000000.0 Atorvastatina amorfa y = 105883x + 2148,1 R = 0,9892

Areas

4000000.0 2000000.0 0.0 0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

Concentracion (mcg/ml) Atorvastatina Cristalina: Masa inicial: 21,1 mg

Masa encontrada: 20,29 Ttulo calculado: 96,17% Ttulo segn certificado de anlisis: 95,0% Atorvastatina cristalina 32 ug/ml:

Concentracin 15,92 24,15 31,84 36,23

rea 788416 1222053 1702951 1854172 2000000 reas 1500000 1000000 500000 0

Curva de calibracin de Atorvastatina amorfa a 1,0 ml/min y = 54041x - 69149 R = 0.9942 Atorvastatina amorfa 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00

concentracion mcg/ml

Mg %SVD encontrados M1 11,39 113,94 M2 11,68 116,78 Promedio 11,54 115,36 CV% 1,74 Muestra

Discusin Mtodo UV de solubilizacin hidrotrpica: fue rpidamente reproducible, de fcil implementacin y con buenos resultados. Mtodo UV colorimtrico: no fue reproducible, no es una tcnica rpida para obtener un resultado confiable. HPLC: Utilizando dos atorvastatinas, una amorfa y otra cristalina, se utiliz la de ttulo ms elevado para valorar la segunda, y ver la presencia o no de impurezas. Como se observa en los resultados, la concentracin est dentro del error del mtodo, y el cromatograma de Atorvastatina cristalina est libre de impurezas. La valoracin de los comprimidos por el mtodo HPLC dio ms alta que el mtodo UV. Esto podra deberse al efecto del error de dilucin, ya que se manejan diferentes concentraciones, siendo la de HPLC mucho ms alta. De todas formas, aunque los comprimidos tienen un ttulo por encima del permitido por farmacopea (citar), el mtodo no est validado an, y no se puede asegurar nada. Conclusiones

Bibliografa Jadhav, S. D., Bhatia, M. S., & Thamake, S. L. (2010). Spectrophotometric Methods for Estimation of Atorvastatin Calcium Form Tablet Dosage Forms. Int.J. PharmTech Res. , 2 (3), 1948-1953. Skorda, D., & Kontoyannis, C. G. (2008). Identification and quantitative determination of atorvastatin calcium polymorph in tablets using FT-Raman spectroscopy. Talanta , 74 (4), 10661070. Tamargo, J., & Vizcano, F. P. (2009). Captulo 27. Frmacos hipolipemiantes. En Velzquez, Farmacologa Bsica y Clnica (pgs. 455-475). Madrid: Editorial Mdica Panamericana. Wankhede, S. V., Krishnaprasad, M., Manjunath, S., & Debnath, S. (2010). Formulation and stabilization of Atorvastatin tablets. J. Chem. Pharm. Res. , 2 (5), 548-554. Zaheer, Z., Farooqui, M. N., Mangle, A. A., & Nikalje, A. G. (2008). Stability-indicating high performance liquid chromatographic determination of Atorvastatin calcium in pharmaceutical dosage form. African Journal of Pharmacy and Pharmacology , 2 (10), 204-210.