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Not As Protein As 2
Not As Protein As 2
CONSIDERACIONES GENERALES
PROTENAS
COMPOSICIN
ESTRUCTURA FUNCIN BIOLGICA PROPIEDADES DE SOLUBILIDAD
AMINOCIDOS LIBRES PEQUEOS PPTIDOS CIDOS NUCLICOS FOSFOLPIDOS AZCARES AMINAS PORFIRINA ALGUNAS VITAMINAS
OTROS MACROCOMPONENTES DE LOS ALIMENTOS QUE PUEDEN INTERFERIR CON EL ANLISIS DE PROTENAS
LPIDOS CARBOHIDRATOS
DETERMINACIN DE ACTIVIDAD BIOLGICA. EJEMPLO: PECTINASAS DURANTE LA MADURACIN DE FRUTOS. INVESTIGACIN SOBRE PROPIEDADES FUNCIONALES. EJMPLO: GLIADINA Y GLUTENINAS PARA LA ELABORACIN DEL PAN. ETIQUETAMIENTO NUTRICIONAL
CONTENIDO PROTICO TOTAL COMPOSICIN DE AMINOCIDOS CONTENIDO DE ALGUNA PROTENA PARTICULAR EN UNA MEZCLA CONTENIDO PORTECO DURANTE EL AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE UNA PROTENA NITRGENO NO PROTICO VALOR NUTRITIVO DE UNA (DIGESTIBILIDAD, BALANCE PROTICO)
HUEVOS
12.9%
0.2%
18.6%
ALMENDRAS ENTERAS
DE KJELDAHL DE BIURET DE LOWRY DEL CIDO BICINCONNICO (BCA) DE ABSORCIN UV A 280nm DE ADHESIN DE COLORANTE DE BRADFORD DE LA NINHIDRINA TURBIDIMTRICO
DIGESTIN CON H2SO4 CON LA ADICIN DE PERMANGANATO DE POTASIO PARA COMPLETAR LA OXIDACIN Y CONVERSIN DEL NITRGENO A SULFATO DE AMONIO. NEUTRANLIZACIN DE LA DIGESTA DILUIDA, SEGUIDA DE UNA DESTILACIN EN UN VOLUMEN CONOCIDO DE CIDO ESTNDAR CON UN CONTENIDO DE IODURO DE POTASIO E YODATO.
TITULACIN DEL YODO LIBERADO CON TIOSULFATO DE SODIO ESTNDAR
SE HAN AADIDO CATALIZADORES COMO: Hg, Cu, Se, Ti AL H2SO4 PARA LOGRAR UNA DIGESTIN COMPLETA. EL DIXIDO DE SELENIO Y EL SULFATO DE COBRE EN PROPORCIN 3:1 SON MUY EFECTIVOS EN LA DIGESTIN.
EL SULFATO DE POTASIO SE UTILIZA PARA AUMENTAR EL PUNTO DE EBULLICIN DEL CIDO SULFRICO PARA ACELERAR LA DIGESTIN. EL SULFURO O TIOSULFATO DE SODIO SE AADEN A LA DIGESTA DILUIDA PARA AYUDAR A LIBERAR EL NITRGENO DEL Hg EL CUAL TIENDE A ADHERIR AMONIO.
EL AMONIACO SE DESTILA DIRECTAMENTE EN UNA SOLUCIN DE CIDO BRICO Y ES SEGUIDO DE UNA TITULACIN CON UN CIDO ESTNDAR. SE UTILIZAN LA COLORIMETRA Y LA CROMATOGRAFA INICA PARA DETERMINAR EL CONTENIDO DE NITRGENO POSTERIOR A LA DIGESTIN.
DIGESTIN
EL SULFATO DE AMONIO NO VOLTIL SE FORMA DE LA REACCIN DEL NITRGENO Y EL CIDO SULFRICO. DURANTE LA DIGESTIN SE LIBERA EL NITRGENO PROTICO PARA FORMAR IONES DE AMONIO.
DIGESTIN
NEUTRALIZACIN Y DESTILACIN
REACCIONES DE LA TITULACIN
CLCULOS
SE DEBE UTILIZAR UN BLANCO CON REACTIVOS PARA SUSTRAER EL NITRGENO REACTIVO DEL NITRGENO DE LA MUESTRA.
N HCl = NORMALIDAD DEL HCl EN MOLES /1000 mL VOL. CIDO CORREGIDO = mL DE CIDO ESTNDAR PARA LA MUESTRA) (mL DE CIDO ESTNDAR PARA EL BLANCO) 14
FACTOR
SE UTILIZA UN FACTOR DE CONVERSIN DE % DE N2 A % DE PROTENA CRUDA. LA MAYORA DE LAS PROTENAS CONTIENEN 16% DE N2 EL FACTOR DE CONVERSIN ES: 6.25 (100/16 = 6.25)
%N2 X 6.25 = %PROTENA
FACTOR 6.25
6.38 5.7 5.71 5.83
APLICABLE A TODO TIPO DE ALIMENTOS RELATIVAMENTE SIMPLE BARATO PRECISO ES EL MTODO OFICIAL PARA MEDIR EL CONTENIDO DE PROTENA CRUDA
MIDE EL NITRGENO ORGNICO TOTAL, NO SLO EL NITRGENO PROTICO CONSUME MUCHO TIEMPO (AL MENOS 2 HORAS PARA COMPLETARSE) PRECISIN MS POBRE QUE EL MTODO DE BIURET USA REACTIVOS CORROSIVOS
FUNDAMENTO
AL FORMAR COMPLEJOS LOS IONES CPRICOS CON LOS ENLACES PEPTDICOS DE LAS PROTENAS SE PRODUCE UN COLOR VIOLETA-MORADO BAJO CONDICIONES ALCALINAS. LA ABSORBANCIA DEL COLOR PRODUCIDO ES LEDO A 540nm.
5 mL DE REACTIVO DE BIURET SE MEZCLA CON 1mL DE SOLUCIN PROTICA (1-10 mg DE PROTENA/mL). EL REACTIVO INCLUYE SULFATO DE COBRE, NaOH, Y TARTRATO DE SODIO Y POTASIO EL CUAL SE UTILIZA PARA ESTABILIZAR EL IN COBRE EN LA SOLUCIN ALCALINA
DESPUS DE REPOSO A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 15 A 30 MINUTOS, SE LEE LA ABSORBANCIA A 540nm CONTRA UN BLANCO CON SLO REACTIVO.
SI LA REACCIN NO ES CLARA DEBE CENTRIFUGARSE LA MUESTRA PREVIO A LA LECTURA DE LA ABSORBANCIA
SE DEBE ELABORAR UNA CURVA ESTNDAR DE CONCENTRACIN VS ABSORBANCIA UTILIZANDO ALBMINA DE SUERO DE BOVINO (BSA) PARA COMPARACIN CON LA MUESTRA BAJO ESTUDIO
MENOS CARO QUE EL MTODO DE KJELDAHL RPIDO (SE PUEDE COMPLETAR EN MENOS DE 30 MINUTOS) ES EL MTODO MS SIMPLE DE ANLISIS DE PROTENAS NO ES FRECUENTE ENCONTRAR DERIVACIONES DE COLOR POCAS SUBSTANCIAS NO PROTICAS INTERFIEREN CON LA REACCIN DE BIURET NO DETECTA N2 DE FUENTES NO PROTICAS O NO PEPTDICAS
NO ES MUY SENSIBLE COMPARADO CON EL MTODO DE LOWRY REQUIERE DE AL MENOS 2 A 4 mg DE PROTENA POR PRUEBA LAS CONCENTRACIONES ALTAS DE SALES DE AMONIO INTERFIEREN CON LA REACCIN PUEDE OCURRIR OPALESCENCIA EN LA SOLUCIN FINAL SI ESTN PRESENTES ALTAS CONCENTRACIONES DE LPIDOS O CARBOHIDRATOS DEBE ESTANDARIZARSE EL COLOR MEDIANTE CANTIDADES DE PROTENA CONOCIDAS
MTODO DE LOWRY
FUNDAMENTO COMBINA LA REACCIN DE BIURET CON LA REDUCCIN DEL REACTIVO DE FENOL FOLINCIOCALTEAU (CIDO FOSFOMOLBDICOFOSFOTNGSTICO) POR LOS RESIDUOS DE TIROSINA Y TRIPTOFANO DE LAS PROTENAS. EL COLOR AZULOSO DESARROLLADO ES LEDO A 750nm (ALTA SENSIBILIDAD PARA UNA CONCENTRACIN PROTICA BAJA) O A 500nm (ALTA SENSIBILIDAD PARA UNA CONCENTRACIN PROTICA ALTA)
MUY SENSIBLE MENOS AFECTADO POR LA TURBIDEZ DE LA MUESTRA MS ESPECFICO QUE LA MAYORA DE LOS OTROS MTODOS RELATIVAMENTE SIMPLE SE PUEDE COMPLETAR EN 1 A 1.5 HORAS
FUNDAMENTO SE BASA EN EL PRINCIPIO DE QUE LAS PROTENAS REDUCEN LOS IONES CPRICOS A IONES CUPROSOS BAJO CONDICIONES ALCALINAS. LOS IONES CUPROSOS REACCIONAN CON EL BCA (VERDOSO) PARA FORMAR UN COLOR MORADO. EL COLOR FORMADO ES PROPORCIONAL AL CONTENIDO PROTICO DE LA MUESTRA
SENSIBILIDAD COMPARABLE A LA DEL MTODO DE LOWRY (0.5mg a 10mg) LA MEZCLA EN UN PASO ES MS FCIL QUE EN EL MTODO DE LOWRY EL REACTIVO ES MS ESTABLE QUE EL REACTIVO DE LOWRY LAS SALES DE BUFFER Y DETERGENTE NO INICO NO INTERFIEREN CON LA REACCIN LAS CONCENTRACIONES DEL MEDIO DE REACTIVOS DESNATURALIZANTES NO INTERFIEREN (GUANIDINA 4M-HCl O UREA 3M)
EL COLOR NO ES ESTABLE CON EL TIEMPO. SE NECESITA CONTROLAR CUIDADOSAMENTE EL TIEMPO ENTRE EL ANLISIS Y LA LECTURA EN ABSORBANCIA. LOS AZCARES REDUCTORES INTERFIEREN CON LA REACCIN. ALTAS CONCENTRACIONES DE SULFATO DE AMONIO INTERFIEREN CON LA REACCIN. LA RESPUESTA EN LA ABSORBANCIA NO ES LINEAL
FUNDAMENTO
LAS PROTENAS MUESTRAN UN FUERTE GRADO DE ABSORCIN A 280nm EN UV, PRINCIPALMENTE DEBIDO PRINCIPALMENTE A LOS RESIDUOS DE TRIPTOFANO Y LA TIROSINA DE LAS PROTENAS. YA QUE LAS CONCENTRACIONES DE ESTOS AMINOCIDOS EN LAS PROTENAS ES FRANCAMENTE CONSTANTE SE PUEDE UTILIZAR LA ABSORBANCIA A 280nm PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIN DE PROTENAS USANDO LA LEY DE BEER
FUNDAMENTO
DADO QUE CADA PROTENA TIENE UNA COMPOASICIN NICA DE AMINOCIDOS AROMTICOS, EL COEFICIENTE DE EXTINCIN (E280) O SU ABSORTIVIDAD MOLAR (Em) DEBEN SER DETERMINADOS PARA PROTENAS INDIVIDUALES PARA LA ESTIMACIN DEL CONTENIDO PROTICO
MTODO RPIDO Y RELATIVAMENTE SENSIBLE (VARIAS VECES MS SENSIBLE QUE EL MTODO DE BIURET) NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE AMONIO Y OTRAS SALES BUFFER MTODO NO DESTRUCTIVO UTILIZADO EN DETECCIN POST-COLUMNA DE LAS PROTENAS
LOS CIDOS NUCLICOS TAMBIN ABSORBEN EN LA REGIN DE 280nm EL CONTENIDO DE AMINOCIDOS AROMTICOS DIFIERE CONSIDERABLEMENTE EN VARIAS PROTENAS. LA SOLUCIN DEBE SER CLARA E INCOLORA. LA TURBIDEZ PUEDE PRODUCIR RESULTADOS ERRTICOS SE REQUIERE UN SISTEMA RELATIVAMENTE PURO PARA UTILIZAR ESTE MTODO
MTODO DE BRADFORD
FUNDAMENTO LA MUESTRA PROTICA SE MEZCLA CON UNA CANTIDAD EXCESIVA CONOCIDA DE UN COLORANTE ANINICO EN UNA SOLUCIN BUFFER.
LAS PROTENAS SE UNEN AL COLORANTE PARA FORMAR UN COMPLEJO INSOLUBLE.
FUNDAMENTO SE MIDE EL COLORANTE NO ADHERIDO, SOLUBLE POSTERIOR A LA EQUILIBRACIN DE LA REACCIN Y LA REMOCIN DEL COMPLEJO INSOLUBLE POR CENTRIFUGACIN Y FILTRACIN. EL COLORANTE NO ADHERIDO EST INVERSAMENTE RELACIONADO AL CONTENIDO PROTICO DE LA MUESTRA
FUNDAMENTO
MTODO RPIDO (15 MINUTOS O MENOS) BARATO RELATIVAMENTE EXACTO PARA EL ANLISIS DE PROTENAS EN ALIMENTOS PUEDE UTILIZARSE PARA ESTIMAR LOS CAMBIOS EN EL CONTENIDO DE LISINA DISPONIBLE DE LOS CEREALES DURANTE SU PROCESAMIENTO.
NO UTILIZA REACTIVOS CORROSIVOS NO MIDE NITRGENO NO PROTICO MS PRECISO QUE EL MTODO KJELDAHL
LAS PROTENAS DIFIEREN EN SU CONTENIDO DE AMINOCIDOS BSICOS DIFIEREN EN SU CAPACIDAD DE ADHESIN DEL COLORANTE SE NECESITA ELABORAR CURVA DE CALIBRACIN MUCHOS COMPONENTES NO PROTICOS TAMBIN SE PUEDEN ADHERIR AL COLORANTE (ALMIDN), METALES (Ca O P) Y CAUSAR ERRORES EN LOS RESULTADOS
MTODO DE BRADFORD
FUNDAMENTO
EL AZL BRILLANTE G-250 COOMASSIE SE ADHIERE A LA PROTENA, EL COLORANTE SE TORNA DE ROJIZO A AZULADO YE L MXIMO DE ABSORCIN DEL COLORANTE CAMBIA DE 465 A 595nm. EL CAMBIO EN LA ABSORBANCIA A 595nm ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIN DE PROTENA EN LA MUESTRA.
MTODO DE LA NINHIDRINA
FUNDAMENTO
AL SER HERVIDOS EN UN BUFFER A UN pH DE 5.5 EN PRESENCIA DE NINHIDRINA E HIDRINDANTINA, LOS AMINOCIDOS, AMONACO, Y LOS GRUPOS AMINO PRIMARIOS, ORIGINAN UN COLOR MORADO RUHEMANN
LA PRESENCIA DE PEQUEAS CANTIDADES DE AMINOCIDOS, PPTIDOS, AMINAS PRIMARIAS, Y AMONACO OCASIONA UNA SOBREESTIMACIN DEL CONTENIDO PROTICO BAJA PRECISIN
EL COLOR VARA CON LA DIFERENTE COMPOSICIN DE AMINOCIDOS SE NECESITA ELABORAR UNA CURVA ESTNDAR EN CADA ANLISIS